Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Storskala gravitakseanalyse av Caenorhabditis dauer larver

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

Denne protokollen skisserer metoder for å gjennomføre en storskala gravitakseanalyse med Caenorhabditis dauer larver. Denne protokollen muliggjør bedre påvisning av gravitaksisoppførsel sammenlignet med en platebasert analyse.

Abstract

Gravitasjonsfølelse er en viktig og relativt understudert prosess. Å føle tyngdekraften gjør det mulig for dyr å navigere i omgivelsene og letter bevegelsen. I tillegg er tyngdekraften, som oppstår i pattedyrets indre øre, nært knyttet til hørsel - og dermed har forståelse av denne prosessen implikasjoner for auditiv og vestibulær forskning. Gravitaxisanalyser finnes for noen modellorganismer, inkludert Drosophila. Enkle ormer har tidligere blitt analysert for deres orienteringspreferanse når de bosetter seg i løsning. En pålitelig og robust analyse for Caenorhabditis gravitaxis er imidlertid ikke beskrevet. Denne protokollen skisserer en prosedyre for å utføre gravitakseanalyser som kan brukes til å teste hundrevis av Caenorhabditis dauers om gangen. Denne storskala, langdistanseanalysen tillater detaljert datainnsamling, og avslører fenotyper som kan gå glipp av på en standard platebasert analyse. Dauer-bevegelse langs den vertikale aksen sammenlignes med horisontale kontroller for å sikre at retningsskjevhet skyldes tyngdekraften. Gravitaktisk preferanse kan deretter sammenlignes mellom stammer eller eksperimentelle forhold. Denne metoden kan bestemme molekylære, cellulære og miljømessige krav til gravitakse i ormer.

Introduction

Å føle jordens gravitasjonskraft er avgjørende for mange organismers orientering, bevegelse, koordinering og balanse. Imidlertid er de molekylære mekanismene og nevrokretsene av tyngdekraftfølelse dårlig forstått sammenlignet med andre sanser. Hos dyr samhandler tyngdekraften med og kan utkonkurreres av andre stimuli for å påvirke atferd. Visuelle signaler, proprioceptiv tilbakemelding og vestibulær informasjon kan integreres for å generere en følelse av kroppsbevissthet i forhold til dyrets omgivelser 1,2. Omvendt kan gravitaktisk preferanse endres i nærvær av andre stimuli 3,4,5. Derfor er gravitaktisk oppførsel ideell for å studere tyngdekraftfølelse og forstå nervesystemets komplekse sensoriske integrasjon og beslutningstaking.

C. elegans er en spesielt nyttig modellorganisme for å studere gravitakse på grunn av sin polyfeniske livssyklus. Når de utsettes for stressorer under utvikling, inkludert varme, overbefolkning eller mangel på mat, utvikler C. elegans larver seg til dauers, som er svært stressbestandige6. Som dauers utfører ormer karakteristisk oppførsel, for eksempel nictation, der ormer "står" på halene og vinker hodet, som kan lette spredning til bedre habitater7. Gravitaxisanalyser av C. elegans og C. japonica antyder at dauer larver negativt gravitax, og at denne oppførselen lettere observeres hos dauers enn hos voksne 8,9. Testing av gravitakse i andre Caenorhabditis-stammer kan avsløre naturlig variasjon i gravitaktisk oppførsel.

Mekanismer for gravitasjonsfølelse har blitt karakterisert i Euglena, Drosophila, Ciona og forskjellige andre arter ved hjelp av gravitaxisanalyser 3,10,11. I mellomtiden ga gravitaxisstudier i Caenorhabditis i utgangspunktet blandede resultater. En studie av C. elegans orienteringspreferanse fant at ormer orienterer seg med hodet ned i løsning, noe som tyder på positiv gravitaktisk preferanse12. I mellomtiden, selv om C. japonica dauers tidlig ble identifisert som negativt gravitactic8, har denne oppførselen bare nylig blitt beskrevet i C. elegans9. Flere utfordringer oppstår ved å utvikle en representativ gravitakseanalyse i ormer. Caenorhabditis stammer opprettholdes på agar plater; Av denne grunn bruker atferdsanalyser vanligvis agarplater som en del av deres eksperimentelle design13,14,15. Den tidligste rapporterte gravitaxisanalysen i Caenorhabditis ble utført ved å stå en plate på siden i en 90 ° vinkel mot den horisontale kontrollplaten8. Gravitaksisadferd er imidlertid ikke alltid robust under disse forholdene. Mens voksne ormer kan analyseres for orienteringspreferanse i løsning12, kan denne retningspreferansen også være kontekstavhengig, noe som fører til forskjellig atferd hvis ormene kryper i stedet for å svømme. I tillegg er C. elegans følsom for andre stimuli, inkludert lys og elektromagnetiske felt16,17, som forstyrrer deres respons på tyngdekraften9. Derfor er en oppdatert gravitakseanalyse som skjold mot andre miljøvariabler viktig for å dissekere mekanismene i denne sensoriske prosessen.

I denne protokollen er en analyse for å observere Caenorhabditis gravitaxis beskrevet. Oppsettet for denne studien er delvis basert på en metode utviklet for å studere nevromuskulær integritet18,19. Dauerlarver dyrkes og isoleres ved hjelp av standardprosedyrer20. De injiseres deretter i kamre laget av to 5 ml serologiske pipetter fylt med agar. Disse kamrene kan orienteres vertikalt eller horisontalt og plasseres i et mørkt Faraday-bur i 12-24 timer for å beskytte mot lys og elektromagnetiske felt. Plasseringen av hver orm i kamrene registreres og sammenlignes med de vertikale taksisene til en referansestamme som C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Stammene som er brukt i denne studien er C. elegans (N2) og C. briggsae (AF16) (se materialtabell). En blandet kjønn befolkning av dauers ble brukt for hver analyse.

1. Kammer forberedelse

  1. Arbeid i en avtrekksvifte. Sett opp arbeidsområdet med en Bunsen-brenner, 1-2 barberblader, tang, pinsett og en skjæreflate i plast (se Materialfortegnelse).
  2. For hvert kammer samles to 5 ml serologiske pipetter. Fjern bomullspluggen fra en pipette med pinsett. Hold et barberblad over Bunsen-brenneren til det er varmt med tang. Bruk det oppvarmede bladet til å skjære av den koniske enden av den andre pipetten slik at hele pipetten har en jevn diameter (figur 1A).
  3. Arbeid raskt, ta de to modifiserte pipetteendene nær flammen og smelte dem litt. Bli med i disse endene ved å trykke dem godt sammen, slik at veggene i begge pipettene er kontinuerlige. Hvis noen hull er synlige etter at de er blitt med, bryter du dem fra hverandre og gjentar dette trinnet (figur 1A, B).

2. Fyll kamrene med agar

  1. Forbered NGM med 4% agar i henhold til standard ormprosedyrer21. Mens agar fortsatt er smeltet, fyll hvert kammer ved å feste det til en serologisk pipettor og sakte tegne opp løsningen. Forsegl spissen med parafinfilm før du fjerner kammeret fra pipetoren. Legg kammeret flatt (parallelt med benken) for å avkjøles.
    MERK: Å dekke kolben med klamfolie (se Materialfortegnelse) etter autoklavering bidrar til å forhindre at bobler dannes i løsningen18.
    1. For å minimere eventuelle variasjoner i agarens konsistens på grunn av ujevn avkjøling, hold pipettoren (se materialtabellen) parallelt med benkeplaten mens du trekker opp agaren. Legg kamrene flatt på benken og la agaren stivne før du beveger deg.
      MERK: Agarprosenten og medieinnholdet kan skreddersys til eksperimentet. 4% agar er stivere enn den omtrent 2% konsentrasjonen som brukes til platehelling og forhindrer ormer i å grave gjennom mediet i våre hender. Imidlertid har andre eksperimenter observert gravende oppførsel av voksne ormer i opptil 9% agar18,19.
  2. Når den er avkjølt, varm en 3 mm sekskantnøkkel (eller et annet metallverktøy av samme størrelse, se Materialtabell) over en Bunsen-brenner. Trykk den godt inn i veggen i hvert kammer ca. 5 mm til den ene siden av midtlinjen, og lag en liten åpning i plasten (figur 1C). Bruk et oppvarmet blad for å fjerne bomull og koniske ender av kammeret og forsegle disse endene med parafinfilm.
    MERK: Når det er klargjort, må hvert kammer brukes innen 1 dag eller oppbevares ved 4 °C i flere dager. Dekk eventuelle eksponerte åpninger med parafinfilm for å forhindre at agaren tørker ut.

3. Isolere dauer larver

  1. 10-15 dager før forsøket, blingsett hver belastning på 2-3 store NGM-plater med OP50-bakterier og pakk inn med parafinfilm. Etter 10-15 dager må hver tallerken være helt utsultet med tusenvis av dauer larver til stede på agar, vegger og lokk.
    MERK: Lag tallerkener på forhånd ved hjelp av en tykk OP50-oppskrift for maksimal trengsel (se Materialfortegnelse). Dauerdannelse kan også induseres gjennom andre metoder, inkludert tilsetning av feromoner eller ved å vokse ved høyere temperaturer22.
  2. Samle ormer ved å skylle lokkene og platene med M9-buffer og pipettere løsningen i 15 ml sentrifugerør. Spinn ved 1,600 x g i 30-60 s ved romtemperatur og aspirer det meste av M9-bufferen med en pipette eller vakuumaspirator.
  3. Isoler dauers ved å behandle med 1% SDS etterfulgt av en 30% sukroseflotasjonsgradient etter den tidligere publiserte rapporten20.
    1. Tilsett 7 ml 1% SDS-løsning til hver ormpellets. La ormene stå i SDS i 30 minutter; Roter rørene kontinuerlig i løpet av denne tiden for å tillate lufting. Skyll 3-5x med M9 for å fjerne vaskemiddelet.
    2. Deretter tilsettes 5 ml M9 etterfulgt av 5 ml kald, filtrert 60% sukroseløsning. Bland grundig, og sentrifuger deretter ved 1,600 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å skape en separasjonsgradient.
  4. Fyll nye 15 ml sentrifugerør med 2 ml M9 buffer. Knus endene av glass Pasteur-pipetter for å utvide boringen og bruk disse pipettene til å overføre det øverste laget av løsningen (som inneholder isolerte dauers) fra sukrosegradienten til de nye rørene. Skyll dauers 3-5x med M9.
    MERK: Det vil være tusenvis av isolerte dauers i løsning på dette punktet. De kan brukes umiddelbart eller holdes luftet ved å rotere i 5-7 ml M9 over natten.

4. Legge dauers til kammeret

  1. Sentrifugerer ved 1 600 x g i 5 minutter ved romtemperatur og aspirerer det meste av M9-løsningen med pipette eller vakuumaspirator. For å estimere ormtetthet, telle manuelt antall ormer i tre separate 1 μL dråper under et dissekeringsmikroskop. Bruk gjennomsnittet av disse tellingene til å tilnærme antall ormer per μL.
    MERK: Noen pipettere med lite volum kan ikke nå bunnen av et 15 ml sentrifugerør; I dette tilfellet kan en konsentrert dråpe ormer overføres først til et stykke parafinfilm.
  2. Klipp enden av en pipettespiss på 10, 20 eller 200 μL for å utvide boringen. Still mikropipetten til et litt større volum enn det tiltenkte aspirasjonsvolumet. Aspirer ca. 1-2 μL av den konsentrerte ormløsningen (ideelt mellom 100-300 ormer) og la en liten mengde luft komme inn i spissen.
    MERK: Et stort antall ormer (1000+) i ett kammer kan øke rekkevidden av tilbakelagte avstander på grunn av overbefolkning9.
  3. Skyv pipettespissen forsiktig inn i agaren mens du trykker ned mikropipetten. Dette vil skape et injeksjonssted i agar uten å tette spissen. Slipp ormene i agaren. Bruk parafinfilm til å forsegle åpningen.

5. Kjører og scorer analysen

MERK: Gravitakse kan testes under ulike forhold som kan påvirke atferd9.

  1. For å eliminere så mange variabler som mulig, plasser kamrene i et mørkt Faraday-bur (se materialtabell) ved romtemperatur.
  2. Merk hvert kammer og heng det vertikalt i Faraday-buret (utfør dette ved hjelp av merkingstape). Test horisontale kontroller samtidig ved å legge noen kamre flatt innenfor de samme miljøforholdene. Test de eksperimentelle stammene mot vertikalt orienterte N2-ormer som en positiv kontroll. Bruk horisontalt orienterte kamre som inneholder N2 dauers som en ekstra negativ kontroll.
    MERK: Horisontale og vertikale analyser må utføres i samme innstilling i laboratoriet for å minimere miljøvariasjonen mellom de to forholdene. En stor inkubator kan brukes til å huse begge Faraday-burene.
  3. Dauers begynner å spre seg fra startstedet etter noen timer og tar flere timer å nå hver ende av kammeret. La kamrene være uforstyrret i løpet av denne tiden og score innen 12-24 timer etter injeksjon.
    MERK: Ikke bruk en paralytisk (for eksempel natriumazid) for å immobilisere ormer som har nådd endene av kamrene. Fordi den totale fordelingen av ormer måles i stedet for en preferanseindeks (som i en tovalgsanalyse), er natriumazid unødvendig og kan endre resultatene.
  4. Fjern og score gravitaksekamre en om gangen. Se etter levende dauers under et dissekeringsmikroskop og merk plasseringene deres med blekk (figur 1C, D). Ikke score ormer innen 2,5 cm til hver side av injeksjonsstedet, da disse ormene sannsynligvis ikke viser retningsbestemt preferanse.
    1. Unngå også å score ormer som virker døde eller er fanget i væsken. Kast kamre som inneholder >50% døde eller svømmende ormer.
      MERK: Når kammeret er fjernet fra testområdet, må det scores raskt for nøyaktighet. Dauers må bare være synlige mellom agars overflate og pipettens vegg. Hvis gravende oppførsel observeres, bør du vurdere å øke agarkonsentrasjonen i fremtidige analyser.
  5. For å kvantifisere resultatene, bruk en markør for å dele hver halvdel av kammeret i syv 3,5 cm seksjoner med start 2,5 cm fra injeksjonsstedet (på noen pipetter, 3,5 cm = 1 ml volum). Bruk en manuell telleteller (se Materialfortegnelse) for å telle antall ormer som er observert i hvert avsnitt.
    MERK: Det skal være syv seksjoner på hver side av opprinnelsen, som kan nummereres fra -7 (nederst) til +7 (øverst). Disse tallene må tilsvare de samme relative stedene basert på hvordan kamrene ble konstruert; agar trekkes fra -7-enden til +7-enden i trinn 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammenligning av gravitakse på tvers av arter
Etter prosedyren som er skissert ovenfor, kan C. briggsae dauer gravitaxis sammenlignes med C. elegans gravitakse og horisontale kontroller. Den vertikale fordelingen (rødbrun) av C. briggsae dauers er skjev mot toppen av kamrene, med en stor prosentandel ormer som når +7 (figur 2A). I motsetning til horisontale kontroller (aqua), der dauers er fordelt i en omtrent klokkeformet kurve rundt midten av kamrene, indikerer denne trenden negativ gravitaktisk oppførsel. Disse dataene kan sammenlignes med C. elegans gravitakse utført på de samme eksperimentelle dagene (figur 2B).

En Kruskal-Wallis-test etterfulgt av Dunns test med Bonferroni-korreksjon for flere sammenligninger bestemte noen signifikante forskjeller mellom analysene 9,23. I dette eksperimentet ble 1,108 C. briggsae dauers scoret over tre vertikale kamre fra to uavhengige eksperimentelle dager. Disse ormene migrerte betydelig oppover enn horisontale kontroller (p < 0,001; 1,639 dauers i tre horisontale kamre over 2 eksperimentelle dager). Videre var de vertikale C. briggsae og vertikale C. elegans-fordelingene ikke forskjellige (p > 0,05; 386 C. elegans dauers i to vertikale kamre over 2 eksperimentelle dager). Disse resultatene tyder på at C. briggsae dauers viser en negativ gravitakseadferd som ligner på C. elegans dauers.

Figure 1
Figur 1: Gravitakse analysekammeroppsett. Bilder som viser trinn av gravitakse analyse kammer forberedelse. (A) Individuelle 5 ml pipetter ble klargjort for fusjon i et enkelt kammer. Fjerning av bomullsplugg indikert med svart pilspiss; fjerning av spissen angitt med en hvit pilspiss. Rørene som brukes i denne studien har en indre diameter på 6 mm og er hver 34,5 cm lange (før kutting). (B) Fullført kammer før tillegg av NGM agar. Pipetter har blitt smeltet sammen ved først å smelte over en Bunsen-brenner. (C) Eksempel kamre fylt med NGM agar. Injeksjonsstedet er indikert med en pil og forstørret i innsatsen. Ormer har blitt merket med blekk, og linjer er tegnet for å skille avstander sammen med kammeret, samt for å lette scoring. (D) Visning av kamre i sin helhet (tatt etter scoring). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Gravitakse i C. briggsae vs. C. elegans. Resultater av gravitakse i C. briggsae og C. elegans. (A) Histogram av C. briggsae gravitaxis. Bevegelse i vertikale kamre (rødbrun) sammenlignes med horisontale kontroller (aqua). Avstand fra injeksjonspunktet (-7 er lengst under, +7 lengst over) plottes som prosentandelen av totale ormer analysert (x-akse). Ingen data er plottet for opprinnelsen (+0) da ormer ikke telles innen 2,5 cm til hver side av injeksjonsstedet. N = 1 639 ormer over tre rør i horisontal tilstand; vertikal N = 1.108 ormer over tre rør. (B) Boxplots som sammenligner fordelingen av C. briggsae horisontale og vertikale ormer versus C. elegans vertikale ormer. C. briggsae utvalgsstørrelser er gitt ovenfor. C. elegans vertikal N = 386 ormer over to rør. Midler er angitt med hvite diamanter; vertikale forhold er i rødbrun og er merket "V", og horisontale forhold ("H") er i vann. Sammenligninger ble gjort ved hjelp av Kruskal-Wallis-testen, etterfulgt av Dunns test med Bonferroni-korreksjon for flere sammenligninger. Ingen stjerner = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenligning med tidligere metoder
I motsetning til kjemotaksi kan gravitakse i Caenorhabditis ikke observeres pålitelig ved hjelp av en tradisjonell agarplate eksperimentell design. En standard petriskål er 150 mm i diameter, noe som resulterer i bare 75 mm tilgjengelig i begge retninger for dauers for å demonstrere gravitaxis preferanse. Selv om C. elegans orienteringspreferanse kan analyseres i løsning12, er denne metoden lav gjennomstrømning da ormer må analyseres en om gangen. I tillegg kan gravitaktiske preferanser og atferd variere mellom ormer som flyter i media versus kryper på en overflate. Av disse grunnene utviklet vi en høy gjennomstrømningsanalyse med forbedret følsomhet som kan brukes til å analysere gravitaksisadferd i krypende eller klatrende ormer. Fordi C. elegans er følsomme for lys og elektromagnetiske felt, som begge forstyrrer gravitaktisk preferanse9, må disse analysene utføres uten stimulans. Hvis et hjemmelaget Faraday-bur brukes, er det nødvendig og anbefalt å kontrollere burets styrke og forsterke det.

Analysekamrene beskrevet i denne protokollen måler omtrent 54 cm i lengde og er plassert i Faraday-bur for å beskytte mot lys og elektromagnetiske felt. Det ble funnet at endring av "arenaen" for å observere gravitaxisadferd har flere fordeler. For det første gir det mulighet for detaljert kvantifisering og beskrivende analyse. De relative avstandene som er reist, og den totale fordelingen av ormer kan samles inn og sammenlignes i stedet for å telle antall negativt versus positivt gravitaktiske ormer. For det andre replikerer det lukkede miljøet til en agarfylt pipette nærmere forholdene som kan fremme gravitakse i naturen. Som nevnt ovenfor er dauer-trinnet en spredningsfase som gjør det mulig å rømme fra ugunstige forhold6. Fordi Caenorhabditis lever i kompost, hvor styrende signaler som lys kanskje ikke er tilgjengelige, kan tyngdekraften gjøre det mulig for ormer å navigere til overflaten 6,9. Todimensjonale platebaserte analyser er usannsynlig å replikere disse forholdene selv om de testes uten andre stimuli. Til slutt tester dette større apparatet større mengder ormer i en enkelt analyse.

Begrensninger og andre hensyn
Selv om denne protokollen effektivt måler gravitaktisk preferanse i et stort antall dauers, er det upraktisk for små eller enkle ormeksperimenter på grunn av tiden og materialene som kreves for å konstruere hvert kammer. Ved å kombinere tellinger på tvers av forsøk i stedet for å bruke en gravitakseindeks, økes statistisk kraft fordi hver orm behandles som en uavhengig hendelse. Selv om denne forbedrede følsomheten er nyttig for å skille gravitaktiske og ikke-gravitaktiske ormer, er det viktig å merke seg at C. elegans dauers utviser sosial atferd 7,24 som kan påvirke generelle gravitaxis. Vi fant at høyere ormtettheter er korrelert med et større område i avstanden som er reist over den store analysen, selv om denne effekten er minimal når det totale antallet er mindre enn ca. 1000 ormer9. Interaksjonseffekter som følge av faktorer som totale ormer i hvert kammer bør overvåkes når dataene analyseres. Som med alle atferdsanalyser, bør scoring blindes når det er mulig.

Å finne en gjennomsnittlig tetthet av ormer i løsningen kan minimere variabiliteten i antall ormer injisert fra kammer til kammer. Ormer legger seg raskt i løsning, så det er viktig å blande ormene før pipettering, enten ved å flikke rørene eller pipettere opp og ned med en bred borespiss. Selv når en konsistent tetthet oppnås, kan antall ormer som er tilsatt variere fordi ormer sannsynligvis vil holde seg til innsiden av plastpipettespissene. Belegning av pipettespisser med BSA eller andre løsninger kan minimere denne effekten. Ormer må injiseres med så lite oppløsning som mulig; Hvis for mye væske legges til kammeret, vil ormer bli fanget i løsningen og kan til og med drive. Av denne grunn kan bare levende, krypende ormer scores, og ethvert kammer som inneholder mer enn 50% døde eller svømmende ormer må ikke brukes. Kamrene skal fjernes fra Faraday-buret en om gangen og scores innen 10-15 min for størst nøyaktighet.

Potensielle bruksområder
Denne analysen kan brukes til å teste miljømessige, genetiske og cellulære krav til gravitakse i en rekke Caenorhabditis stammer. Så langt har lys og elektromagnetiske felt blitt identifisert som stimuli som forstyrrer gravitaksin9. C. elegans er imidlertid følsom for andre stimuli, inkludert temperatur, flyktige og ikke-flyktige kjemikalier, tekstur, fuktighet og lyd, som påvirker deres oppførsel25,26,27,28. Å forstå hvordan ulike sensoriske innganger er integrert i nervesystemet er et fremragende spørsmål i nevrovitenskap, spesielt når integrasjon skjer på nivå med individuelle nevroner 9,29,30,31,32. Sensorisk integrasjon er spesielt viktig i propriosepsjon, som i seg selv er en integrert modalitet som trekker fra flere sensoriske signaler1.

Å forstå tyngdekraften i Caenorhabditis har implikasjoner for menneskers helse. Millioner av individer lider av vestibulær dysfunksjon i USA alene33, og mange av disse lidelsene har underliggende genetiske årsaker34,35. Av denne grunn er identifisering av genkandidater og målrettede terapier et aktivt forskningsområde36. I tillegg, fordi virveldyrs vestibulære og auditive systemer er nært knyttet utviklingsmessig og evolusjonært33,36,37, kan belysning av tyngdekraften også gi innsikt i hørsels- og hørselsforstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av forskningsmidler fra National Institutes of Health til JHR (#R01 5R01HD081266 og #R01GM141493). Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi vil gjerne anerkjenne Pradeep Joshi (UCSB) for hans redaksjonelle innspill. Statistisk konsultasjon levert av UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

Virkemåte utgave 183
Storskala gravitakseanalyse av <em>Caenorhabditis</em> dauer larver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter