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Neuroscience

प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स के साथ न्यूरोनल लाइसोसोम इंटरएक्टोम का लक्षण वर्णन

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64132
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, The George Washington University
* These authors contributed equally

Summary

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में गतिशील लाइसोसोमल माइक्रोएन्वायरमेंट को चिह्नित करने के लिए एक न्यूरोनल लाइसोसोम प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल का वर्णन यहां किया गया है। लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और प्रोटीन जो लाइसोसोम (स्थिर या क्षणिक रूप से) के साथ बातचीत करते हैं, उन्हें जीवित मानव न्यूरॉन्स में उत्कृष्ट इंट्रासेल्युलर स्थानिक संकल्प के साथ इस विधि में सटीक रूप से परिमाणित किया जा सकता है।

Abstract

लाइसोसोम अक्सर गिरावट और अन्य विविध सेलुलर कार्यों को प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रकार के बायोमोलेक्यूल्स के साथ संवाद करते हैं। लाइसोसोम मानव मस्तिष्क समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि न्यूरॉन्स पोस्टमाइटोटिक हैं और सेलुलर होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए ऑटोफैगी-लाइसोसोम मार्ग पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं। विभिन्न लाइसोसोमल कार्यों की समझ में प्रगति के बावजूद, लाइसोसोम और अन्य सेलुलर घटकों के बीच अत्यधिक गतिशील संचार को कैप्चर करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, खासकर उच्च-थ्रूपुट फैशन में। यहां, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) -व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में हाल ही में प्रकाशित अंतर्जात (नॉक-इन) लाइसोसोम निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।

10-20 एनएम त्रिज्या के भीतर लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और लाइसोसोम के आसपास के प्रोटीन दोनों को आत्मविश्वास से पहचाना जा सकता है और जीवित मानव न्यूरॉन्स में सटीक रूप से परिमाणित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को विस्तार से वर्णित किया गया है, यानी, एचआईपीएस-न्यूरॉन संस्कृति, निकटता लेबलिंग, न्यूरॉन फसल, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, बायोटिनिलेटेड प्रोटीन संवर्धन, प्रोटीन पाचन, एलसी-एमएस विश्लेषण और डेटा विश्लेषण। सारांश में, यह अद्वितीय अंतर्जात लाइसोसोमल निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक्स विधि जीवित मानव न्यूरॉन्स में अत्यधिक गतिशील लाइसोसोमल गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट और मजबूत विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करती है।

Introduction

लाइसोसोम कैटाबोलिक ऑर्गेनेल हैं जो लाइसोसोमल-ऑटोफैगी मार्ग1 के माध्यम से मैक्रोमोलेक्यूल्स को नीचा दिखाते हैं। गिरावट के अलावा, लाइसोसोम विभिन्न सेलुलर कार्यों जैसे सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन, पोषक तत्व संवेदन और स्राव 2,3,4 में शामिल हैं। लाइसोसोमल फ़ंक्शन में गड़बड़ी को लाइसोसोमल स्टोरेज विकारों, कैंसर, उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेशन 3,5,6,7 में फंसाया गया है। पोस्टमाइटोटिक और अत्यधिक ध्रुवीकृत न्यूरॉन्स के लिए, लाइसोसोम न्यूरोनल सेलुलर होमियोस्टेसिस, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और अक्षतंतु 8,9,10,11 के साथ लंबी दूरी के परिवहन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, मानव न्यूरॉन्स में लाइसोसोम की जांच करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य रहा है। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न न्यूरॉन प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति ने जीवित मानव न्यूरॉन्स की संस्कृति को सक्षम किया है जो पहले दुर्गम थे, मानव मस्तिष्क12,13 का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल और मानव रोगियों के बीच की खाई को पाटते हैं। विशेष रूप से, उन्नत आई3न्यूरॉन तकनीक एक डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल प्रमोटर के तहत आईपीएससी जीनोम में न्यूरोजेनिन -2 प्रतिलेखन कारक को एकीकृत करती है, जिससे आईपीएससी को 2 सप्ताह14,15 में शुद्ध कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जाता है।

अत्यधिक गतिशील लाइसोसोमल गतिविधि के कारण, अन्य सेलुलर घटकों के साथ लाइसोसोमल इंटरैक्शन को कैप्चर करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, खासकर उच्च-थ्रूपुट फैशन में। प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग तकनीक इन गतिशील इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि इसकी क्षमता असाधारण स्थानिक विशिष्टता16,17 के साथ स्थिर और क्षणिक / कमजोर प्रोटीन इंटरैक्शन दोनों को पकड़ने की क्षमता है। इंजीनियर पेरोक्सीडेज या बायोटिन लिगेज को आनुवंशिक रूप से चारा प्रोटीन से जोड़ा जा सकता है। सक्रियण पर, अत्यधिक प्रतिक्रियाशील बायोटिन कणों को सहसंयोजक रूप से पड़ोसी प्रोटीन को लेबल करने के लिए उत्पादित किया जाता है, जिसे तब तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) प्लेटफार्मों 17,18,19,20,21 के माध्यम से डाउनस्ट्रीम बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों द्वारा समृद्ध किया जा सकता है।

एक अंतर्जात लाइसोसोमल प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स विधि हाल ही में आई 3 न्यूरॉन्स22 में गतिशील लाइसोसोमल माइक्रोएन्वायरमेंट को पकड़नेकेलिए विकसित की गई थी। इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज (एपेक्स 2) को आईपीएससी में लाइसोसोमल संबद्ध झिल्ली प्रोटीन 1 (एलएएमपी 1) के सी-टर्मिनस पर दस्तक दी गई थी, जिसे बाद में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है। एलएएमपी 1 एक प्रचुर मात्रा में लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और एक शास्त्रीय लाइसोसोमल मार्कर23 है। एलएएमपी 1 को देर से एंडोसोम में भी व्यक्त किया जाता है, जो लाइसोसोम में परिपक्व होते हैं; इन देर से एंडोसोम-लाइसोसोम और नॉनडिग्रेडेटिव लाइसोसोम को इस प्रोटोकॉल में लाइसोसोम के रूप में संदर्भित किया जाता है। यह अंतर्जात एलएएमपी 1-एपेक्स जांच, शारीरिक स्तर पर व्यक्त की जाती है, एलएएमपी 1 गलत स्थानीयकरण और ओवरएक्प्रेशन कलाकृतियों को कम कर सकती है। सैकड़ों लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और लाइसोसोमल इंटरएक्टर्स को जीवित मानव न्यूरॉन्स में उत्कृष्ट स्थानिक संकल्प के साथ पहचाना और परिमाणित किया जा सकता है।

यहां, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में लाइसोसोम निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक्स के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित विधि22 से और सुधार के साथ वर्णित है। समग्र वर्कफ़्लो चित्र 1 में चित्रित किया गया है। प्रोटोकॉल में एचआईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन संस्कृति, न्यूरॉन्स में निकटता लेबलिंग सक्रियण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एपेक्स गतिविधि का सत्यापन, एक इष्टतम स्ट्रेप्टाविडिन बीड्स-टू-इनपुट प्रोटीन अनुपात का निर्धारण, बायोटिनिलेटेड प्रोटीन का संवर्धन, ऑन-बीड्स प्रोटीन पाचन, पेप्टाइड डीसाल्टिंग और परिमाणीकरण, एलसी-एमएस विश्लेषण और प्रोटिओमिक्स डेटा विश्लेषण शामिल हैं। प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग गुणवत्ता नियंत्रण और प्रदर्शन में सुधार के लिए समस्या निवारण दिशानिर्देशों और प्रयोगात्मक अनुकूलन पर भी चर्चा की जाती है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय जैव सुरक्षा और नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मीडिया और बफर की रचनाएं तालिका 1 में प्रदान की गई हैं। यहां उपयोग की जाने वाली वाणिज्यिक उत्पाद जानकारी सामग्री की तालिका में प्रदान की गई है।

1. मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन संस्कृति

  1. मानव आईपीएससी संस्कृति और LAMP1-APEX जांच एकीकरण (7 दिन)
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बर्फ की बाल्टी में मैट्रिगेल स्टॉक घोल को पिघलाएं, घोल के 500 μL को ठंडे बाँझ ट्यूबों में डालें, और एलिकोट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 49.5 एमएल ठंडे डीएमईएम / एफ 12 माध्यम में मैट्रिगेल स्टॉक के 500 μL जोड़कर 50 एमएल कोटिंग समाधान तैयार करें।
      नोट: मैट्रिगेल को ठंडा रखें और पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए प्रीचिल्ड शंक्वाकार ट्यूबों और पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। कोटिंग समाधान 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए 4 एमएल कोटिंग समाधान के साथ 10 सेमी सेल कल्चर डिश को कोट करें।
      नोट: विट्रोनेक्टिन आईपीएससी संस्कृति के लिए 5 μg / mL एकाग्रता और 2 घंटे कोटिंग पर एक वैकल्पिक कोटिंग समाधान हो सकता है। विट्रोनेक्टिन (एकल प्रोटीन घटक) मैट्रिगेल की तुलना में अधिक महंगा है, लेकिन मैट्रिगेल की तुलना में कम बैच विविधताएं और क्लीनर पृष्ठभूमि संकेत हैं, जो कई बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ माउस ट्यूमर से निकाला जाता है। विट्रोनेक्टिन कोटिंग के लिए गैर-उपचारित ऊतक संवर्धन प्लेट की आवश्यकता होती है। मैट्रिगेल कोटिंग उपचारित और गैर-उपचारित ऊतक संस्कृति प्लेटों दोनों के लिए काम करती है।
    3. प्रत्येक लेपित 10 सेमी डिश पर पिघलना और प्लेट 1-3 मिलियन एचआईपीएससी को 8 एमएल आवश्यक ई 8 पूर्ण माध्यम के साथ रॉक अवरोधक (अंतिम एकाग्रता 10 μM Y-27632 या 50 nM Chroman1) के साथ पूरक किया गया था।
      नोट: स्टेम सेल कल्चर माध्यम में रॉक अवरोधक (वाई -27632 या क्रोमन 1) जोड़ना विभाजन और क्रायोजेनिक संरक्षण के बाद पृथक्करण-प्रेरित एपोप्टोसिस को कम करता है। क्रोमैन 1 को हाल ही में रॉक 1 और रॉक 224 दोनों को रोकने में वाई -27632 की तुलना में अधिक शक्तिशाली दिखाया गया है।
    4. आईपीएससी के उपनिवेश बनाने के बाद रॉक अवरोधक के बिना ई 8 पूर्ण माध्यम के 10 एमएल में परिवर्तन करें, आमतौर पर 1-2 दिनों के बाद। ई 8 पूर्ण माध्यम में आईपीएससी संस्कृति बनाए रखें और हर दूसरे दिन सतह पर तैरने वाले को ताजा माध्यम से बदलें।
    5. CRISPR जीनोम इंजीनियरिंग द्वारा अंतर्जात LAMP1 जीन के सी-टर्मिनस में निकटता लेबलिंग एंजाइम, इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज (एपेक्स 2) को एकीकृत करें। एक इंजीनियर स्थिर सेल लाइन उत्पन्न करने के लिए विस्तृत चरणों के लिए, पहले प्रकाशित विधि (फ्रैंकनफील्ड एट अल) देखें। 22.
  2. मानव आईपीएससी-न्यूरॉन भेदभाव (3 दिन)
    1. भेदभाव से पहले 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 एमएल मैट्रिगेल कोटिंग समाधान के साथ रात भर 10 सेमी सेल कल्चर डिश को कोट करें।
    2. ~ 70% संगम तक उच्चPSC बनाए रखें। मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) 2 एक्स के साथ एचआईपीएससी को धीरे से धोएं। पीबीएस को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं के 10 सेमी डिश में 3 एमएल एक्यूटेस जोड़ें। वितरण के लिए प्लेट को हिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 8 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. प्लेट से कोशिकाओं को धोने और उठाने के लिए 2 एमएल पीबीएस जोड़ें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सभी सेल समाधान एकत्र करें। 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रों। प्लेट 2-4 × 106 एचआईपीएससी एक मैट्रिगेल-लेपित प्लेट पर 8 एमएल गर्म न्यूरॉन प्रेरण माध्यम के साथ प्रीलोडेड (तालिका 1)। समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: न्यूरॉन भेदभाव एक डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, न्यूरोजेनिन -2 (एनजीएन 2) द्वारा संचालित होता है, जिसे इस स्थिर एचआईपीएससी सेल लाइन15 में अतिरंजित किया गया था।
    4. मृत सेल मलबे को हटाने के लिए भेदभाव के दिन 1 पर पीबीएस के साथ धीरे से एचआईपीएससी धोएं। रॉक अवरोधक के बिना 10 एमएल गर्म प्रेरण माध्यम के साथ बदलें।
    5. भेदभाव के तीसरे दिन तक हर दिन रॉक अवरोधक के बिना गर्म प्रेरण माध्यम के साथ परिवर्तन।
      नोट: न्यूरॉन्स न्यूरोनल माध्यम में पुन: लोड होने के लिए तैयार हैं।
  3. न्यूरॉन्स चढ़ाना और न्यूरॉन संस्कृति को बनाए रखना (10 दिन)
    1. बोरेट बफर में 0.1 मिलीग्राम / एमएल पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ) कोटिंग समाधान तैयार करें (तालिका 1)।
    2. दिन 3 न्यूरॉन्स चढ़ाने से पहले कम से कम 1 घंटे या रात भर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पीएलओ कोटिंग समाधान के साथ एक सेल कल्चर डिश को कोट करें। पकवान को 4 एमएल बाँझ पानी से तीन बार धोएं और इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पूरी तरह से हवा में सूखने दें।
    3. प्रत्येक 10 सेमी डिश से दिन 3 न्यूरॉन्स को 3 एमएल एक्यूटेस के साथ अलग करें और गर्म कॉर्टिकल न्यूरॉन माध्यम के साथ प्रीलोडेड प्रत्येक 10 सेमी पीएलओ-लेपित डिश पर 8-10 मिलियन कोशिकाओं को प्लेट करें (तालिका 1)।
    4. गर्म न्यूरॉन माध्यम के साथ हर 2-3 दिनों में आधा-मध्यम परिवर्तन करें जब तक कि आई3न्यूरॉन्स भेदभाव के बाद 2 सप्ताह में परिपक्वता तक नहीं पहुंच जाते।

2. सीटू निकटता लेबलिंग और न्यूरॉन लाइसिस (2 घंटे)

  1. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 500 एमएम बायोटिन-फिनोल (बीपी) स्टॉक समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। निकटता लेबलिंग के दिन, बीपी स्टॉक समाधान को गर्म न्यूरॉन माध्यम के साथ पतला करें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 500 μM की अंतिम एकाग्रता पर न्यूरॉन्स का इलाज करें।
    नोट: डॉक्सीसाइक्लिन न्यूरॉन माध्यम में जोड़ा जाता है, जो एपेक्स एंजाइम अभिव्यक्ति को सक्रिय करेगा। डॉक्ससाइक्लिन को निकटता लेबलिंग प्रयोग से कम से कम 24 घंटे पहले जोड़ा जाना चाहिए।
  2. न्यूरॉन संस्कृति में 1 mM की अंतिम एकाग्रता पर H2O2 जोड़कर लेबलिंग प्रतिक्रिया शुरू करें और ठीक 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। तुरंत माध्यम को अस्त करें और बुझाने वाले बफर के साथ 3 बार कुल्ला करें (तालिका 1)।
    नोट: लेबलिंग प्रतिक्रिया से पहले एच2ओ2 समाधान को ताजा बनाया जाना चाहिए। प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने और लंबे समय तक एच2ओ2 उपचार के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने के लिए एच2 ओ 2सक्रियण को ठीक 1 मिनट की आवश्यकता होती है।
  3. प्लेट को सभी अवशिष्ट बफर को एस्पिरेट करने के लिए झुकाएं। न्यूरॉन प्लेट पर सीधे बर्फ-ठंडा सेल लाइसिस बफर (तालिका 1) जोड़ें। प्रति 1 मिलियन न्यूरॉन्स में सेल लाइसिस बफर के 100 μL का उपयोग करें। पर्याप्त सेल लाइसिस के लिए प्लेट को घुमाएं और बर्फ पर रखें।
  4. सेल लाइसेट को ठंडे 1.5 एमएल ट्यूबों में स्क्रैप करें। बर्फ के ठंडे पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए स्नान सोनिकेटर (>100 डब्ल्यू) का उपयोग करके सोनिकेट करें, जिसमें 40 सेकंड, 20 सेकंड की दूरी चक्र होता है।
    नोट: पर्याप्त रूप से लाइस्ड प्रोटीन समाधान छर्रों या अत्यधिक बुलबुले के बिना स्पष्ट होना चाहिए। सेल लाइसेट का पर्याप्त सोनिकेशन कतरनी न्यूक्लिक एसिड के लिए महत्वपूर्ण है और डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं में गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए सेल लाइसेट की चिपचिपाहट को कम करता है। एक प्रोब सोनिकेटर का उपयोग मजबूत और तेज़ सेल लाइसिस प्रदान करने के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन क्रॉस-संदूषण और नमूना हानि को कम करने के लिए नमूनों के बीच जांच को धोने की आवश्यकता होती है।
  5. लाइसिस बफर की 4 गुना मात्रा पर नमूने में ठंडा एसीटोन (−20 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें। भंवर संक्षेप में और 3 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है।
  6. सेंट्रीफ्यूज 16,500 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर। प्रोटीन गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को हटा दें। पेलेट को -20 डिग्री सेल्सियस एसीटोन 2x के 1 एमएल के साथ धोएं और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सुपरनैटेंट को हटा दें।
  7. प्रोटीन पेलेट को वैक्यूम कंसंट्रेटर से 1 मिनट के लिए सुखाएं। गोली को पूरी तरह से भंग करने के लिए सेल लाइसिस बफर जोड़ें। यदि आवश्यक हो तो संक्षेप में। नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: एसीटोन वर्षा नमूने में अवशेष बायोटिन-फिनोल को हटा सकती है, जो बायोटिनिलेटेड प्रोटीन के डाउनस्ट्रीम संवर्धन में हस्तक्षेप कर सकती है।

3. एपेक्स स्थानीयकरण और गतिविधि को मान्य करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (1.5 दिन)

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर30मिनट के लिए 500 एसएम बीपी के साथ अंतर्जात एलएएमपी 1-एपेक्स व्यक्त करने वाले आई 3 न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें। बायोटिन क्लाउड के प्रसार को सीमित करने के लिए केवल 1 सेकंड के लिए 1एमएम एच2 ओ 2 उपचार के साथ लेबलिंग को सक्रिय करें।
  2. बुझाने वाले बफर में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को तुरंत ठीक करें और धीरे से पीबीएस के साथ 3 एक्स धोएं।
    नोट: 10 सेमी डिश के लिए, पर्याप्त धोने के लिए 4-6 एमएल की आवश्यकता होती है।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 3% गधे के सीरम और 0.1% सैपोनिन का उपयोग करके कोशिकाओं को अवरुद्ध और स्थिर करें।
  4. प्राथमिक एंटी-एलएएमपी 1 एंटीबॉडी (माउस मोनोक्लोनल एच 3 ए 4, 1: 1,000) के साथ कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. न्यूरॉन्स को पीबीएस के साथ धीरे से धोएं। आरटी पर 1 घंटे के लिए एंटी-माउस एएफ 561 द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 1,000) और स्ट्रेप्टाविडिन -680 (1: 1,000) के साथ न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें।
  6. पीबीएस के साथ 2x धोएं और RT पर 10 मिनट के लिए Hoechst या 4', 4-diamidino-2-फेनिलइंडोल (DAPI) परमाणु मार्कर के साथ इनक्यूबेट करें।
  7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत निश्चित न्यूरॉन्स की कल्पना करें। एपेक्स गतिविधि के सही स्थान को मान्य करने के लिए नाभिक के बाहर स्ट्रेप्टाविडिन से सना बायोटिनिलेटेड प्रोटीन और एलएएमपी 1 धुंधला के साथ स्थानीयकृत प्रोटीन का निरीक्षण करें।

4. स्ट्रेप्टाविडिन बीड्स-टू-इनपुट प्रोटीन अनुपात का निर्धारण (1.5 दिन)

  1. सेल लाइसेट में कुल प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए डिटर्जेंट-संगत प्रोटीन परख (डीसीए) करें
    1. 4 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर सेल लाइसिस बफर में बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) प्रोटीन मानक को भंग करें। सेल लाइसिस बफर का उपयोग करके बीएसए प्रोटीन मानक समाधान (0.2-2 मिलीग्राम / एमएल, 5 कमजोर पड़ने) की एक श्रृंखला तैयार करें।
    2. प्रत्येक प्रोटीन नमूने से 5 μL, बीएसए प्रोटीन मानक समाधान, और रिक्त सेल लाइसिस बफर को 96-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं में तीन प्रतियों में स्थानांतरित करें।
    3. अभिकर्मक A प्राप्त करने के लिए अभिकर्मक A के प्रति 1 mL अभिकर्मक S जोड़ें। प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक A का 25 μL जोड़ें। प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक बी के 200 μL जोड़ें। यदि मौजूद है तो बुलबुले मिलाएं और पॉप करें।
    4. आरटी पर उस 96-वेल प्लेट को 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, माइक्रोप्लेट रीडर में 750 एनएम पर अवशोषण पढ़ें, और बीएसए मानक वक्र के आधार पर प्रोटीन नमूनों की सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  2. बीड्स अनुमापन डॉट ब्लॉट परख (1.5 दिन)
    1. स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के घोल की एक श्रृंखला (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) को पीसीआर स्ट्रिप्स ट्यूबों में स्थानांतरित करें। पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, मोतियों को 2% एसडीएस बफर के 100 μL के साथ 3x धोएं, और चुंबकीय रैक पर वॉश बफर को पूरी तरह से हटा दें।
    2. प्रत्येक ट्यूब में 50 μg प्रोटीन का नमूना जोड़ें। 80 μL की कुल मात्रा में अधिक लाइसिस बफर जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब को कसकर बंद करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    3. पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों को एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज पर संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों को 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। प्रत्येक ट्यूब से एक सूखी नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर सतह पर तैरने वाले 2 μL को स्पॉट करें और झिल्ली को पूरी तरह से सूखने दें।
      नोट: यदि सिग्नल की तीव्रता कम है, तो झिल्ली पर 2 μL से अधिक देखा जा सकता है। प्रत्येक बार के बीच झिल्ली के हवा में सूखने के बाद एक ही स्थान पर कई बार स्पॉट करके मात्रा बढ़ाई जा सकती है। एक बायो-डॉट उपकरण का भी उपयोग किया जा सकता है।
    4. 1 घंटे के लिए ब्लॉकिंग बफर (टीबीएस) में झिल्ली को इनक्यूबेट करें। स्ट्रेप्टाविडिन एलेक्सा फ्लोर 680 संयुग्म (ब्लॉकिंग बफर में 1: 1,000) में झिल्ली को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, झिल्ली को टीबीएस-टी (तालिका 1) 5x के साथ धो लें।
      नोट: डॉट ब्लॉट परख का एक विकल्प स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता है।
    5. 680 एनएम तरंग दैर्ध्य के तहत झिल्ली पर प्रत्येक बिंदु के फ्लोरोसेंट सिग्नल को मापें, और मोतियों की मात्रा पर फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ एक स्कैटर प्लॉट उत्पन्न करें। 50 μg इनपुट प्रोटीन नमूने के लिए आवश्यक मोतियों की इष्टतम मात्रा का चयन करें जहां वक्र का घातीय क्षय समाप्त होता है।
      नोट: प्रतिदीप्ति तीव्रता सतह पर तैरने वाले प्रोटीन में बायोटिनिलेटेड प्रोटीन की प्रचुरता का प्रतिनिधित्व करती है, जिसे मोतियों की बढ़ती मात्रा के साथ कम होना चाहिए।

5. बायोटिनिलेटेड प्रोटीन और ऑन-बीड्स पाचन को समृद्ध करना (3 दिन)

  1. -80 डिग्री सेल्सियस से प्रोटीन लाइसेट नमूने स्थानांतरित करें और समाधान को जल्दी से पिघलाने के लिए स्नान सोनिकेटर में 30 सेकंड के लिए 1.5 एमएल ट्यूबों में नमूने को सोनिकेट करें। भंवर और नमूना ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  2. प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में 250 μL स्ट्रेप्टाविडिन (SA) चुंबकीय मोती घोल स्थानांतरित करें। ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, मोतियों को 1 एमएल वॉश बफर ए (2% एसडीएस) के साथ 3 गुना धोएं, और अवशिष्ट बफर को हटा दें।
  3. डॉट ब्लॉट परख और डीसी प्रोटीन परख के परिणामों के आधार पर, स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोती घोल के 250 μL के लिए आवश्यक प्रोटीन नमूने (μg) की मात्रा की गणना करें।
    नोट: इस अंतर्जात रूप से व्यक्त एलएएमपी 1-एपेक्स जांच में, इनपुट प्रोटीन के 50 μg के लिए 5 μL मोतियों की आवश्यकता होती है। इसलिए, कुल प्रोटीन का 2.5 मिलीग्राम 250 μL मोतियों में जोड़ा जाता है। सीमित इनपुट नमूना सामग्री के लिए 250 μL से कम SA मोती का उपयोग किया जा सकता है।
  4. चुंबकीय मोती-लाइसेट मिश्रण वाले ट्यूब में सेल लाइसिस बफर को 1 एमएल की कुल मात्रा में जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    नोट: प्रयोगात्मक विविधताओं को कम करने के लिए विभिन्न समूहों या प्रतिकृतियों के नमूनों को एक ही प्रोटीन एकाग्रता, मात्रा और मोतियों की मात्रा में सामान्यीकृत किया जाना चाहिए।
  5. सभी ट्यूबों को एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज पर संक्षेप में घुमाएं और ट्यूबों को 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। चुंबकीय रैक पर रहते हुए सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    नोट: हर बार चुंबकीय रैक पर नमूना ट्यूबों को रखने के बाद 1 मिनट तक इंतजार करना महत्वपूर्ण है। यह समाधान में चुंबक की ओर बढ़ने वाले मोतियों की अदृश्य छोटी मात्रा के कारण मोती हानि को कम कर सकता है।
  6. आरटी पर वॉश बफर ए के 1 एमएल के साथ मोतियों को 2 गुना धोएं (हर बार 5 मिनट रोटेशन)। प्रत्येक वॉश बफर 2x के साथ प्रक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर क्रमिक रूप से दोहराएं। (बफर बी, बफर सी, और बफर डी; तालिका 1)।
    नोट: एसडीएस समाधान की एक उच्च सांद्रता ठंडे तापमान पर अवक्षेपित हो सकती है। पहला धोने आरटी पर किया जाना चाहिए।
  7. ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें। अवशिष्ट डिटर्जेंट को पूरी तरह से हटाने के लिए बफर डी के साथ मोतियों को 2x धोएं। मोतियों को 50 mM Tris बफर के 100 μL में पुन: निलंबित करें और तापमान-नियंत्रित मिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए 5 mM TCEP (अंतिम सांद्रता) जोड़ें, जो 1,200 आरपीएम पर हिल ें।
  8. प्रत्येक ट्यूब में 15 mM iodoacetamide (IAA, अंतिम सांद्रता) जोड़ें और तापमान-नियंत्रित मिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, अंधेरे में 1,200 आरपीएम पर हिलें (मिक्सर कैप ऑन)।
    नोट: आईएए प्रकाश-संवेदनशील है और इस चरण से 5 मिनट पहले ताजा बनाया जाना चाहिए।
  9. अतिरिक्त आईएए को बुझाने के लिए 5 एमएम टीसीईपी (अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। तापमान-नियंत्रित मिक्सर में 1,200 आरपीएम (मिक्सर कैप ऑफ) पर हिलने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. नमूना ट्यूबों को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए 50 mM Tris बफर में 5 mM TCEP का 200 μL जोड़ें। लिस-सी मिश्रण के 1 μg को नमूने में जोड़ें, और तापमान-नियंत्रित मिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, 1,200 आरपीएम पर हिलें।
  11. लाइस-सी मिश्रण का एक अतिरिक्त 0.2 μg जोड़ें और 3 घंटे के लिए पचाएं।
  12. नमूना ट्यूबों को संक्षेप में घुमाएं और ट्यूबों को 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। चुंबकीय रैक पर रहते हुए ट्यूबों को साफ करने के लिए पेप्टाइड सुपरनैटेंट को स्थानांतरित करें। मोतियों को 50 mM Tris बफर (5 मिनट के लिए हिलाते हुए) के 50 μL के साथ धोएं और पेप्टाइड सुपरनैटेंट को मिलाएं।
  13. पीएच <3 प्राप्त करने के लिए पेप्टाइड सुपरनैटेंट युक्त ट्यूब में 10% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) का 30 आरएल जोड़ें।

6. पेप्टाइड डिसाल्टिंग और फ्रैक्शनेशन (2 घंटे)

  1. वैक्यूम पर एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल (एमईओएच) 3 एक्स के 200 μL के साथ रिवर्स-फेज ठोस चरण निष्कर्षण प्लेट (केवल उपयोग के लिए कुएं) को गीला करें। प्लेट को बराबर करने के लिए एचपीएलसी ग्रेड पानी 3x में 1% टीएफए का 200 μL जोड़ें।
  2. पेप्टाइड नमूनों को प्लेट में लोड करें, नमूना हानि को कम करने के लिए 3 बूंदों / सेकंड से कम प्रवाह गति के लिए वैक्यूम को धीरे-धीरे चालू करें।
  3. निष्कर्षण प्लेट को 1% टीएफए के 200 μL के साथ 3x धोएं। निष्कर्षण प्लेट को फिर से 1% टीएफए के 200 μL के साथ धोएं जिसमें 2% MeOH (v / v) हो। प्रवाह की गति 3 बूंदों /सेकंड से कम रखें।
  4. संग्रह प्लेट को 96-वेल संग्रह प्लेट के साथ बदलें। यदि कोई विभाजन की आवश्यकता नहीं है, तो पेप्टाइड नमूने 3x को 1% TFA के 100 μL के साथ 80% MeOH युक्त करें और एक नई नमूना ट्यूब में संयोजित करें। पेप्टाइड नमूनों को बिना किसी गर्मी के वैक्यूम कंसंट्रेटर में सुखाएं।
    नोट: यदि विभाजन वांछित है, तो पेप्टाइड नमूनों को बाद में एक अलग संग्रह प्लेट में क्रमशः 15%, 35%, 50% और 90% एमईओएच युक्त 1% टीएफए के 200 μL का उपयोग करके 4 अंशों में विभाजित किया जा सकता है।

7. कलरमेट्रिक पेप्टाइड परिमाणीकरण परख (वैकल्पिक) (1 एच)

  1. एलसी-एमएस ग्रेड पानी के 50 μL में पेप्टाइड नमूनों को पुन: निलंबित करें और पेप्टाइड परख करने के लिए 20 μL एलिकोट लें।
    नोट: यह चरण पेप्टाइड नमूने की एक बड़ी मात्रा का उपभोग करता है लेकिन एलसी-एमएस विश्लेषण से पहले पेप्टाइड एकाग्रता का सटीक परिमाणीकरण प्रदान कर सकता है। यह आमतौर पर बड़े पैमाने पर नमूना तैयार करने से पहले परीक्षण के लिए प्रति नमूना प्रकार केवल एक बार आयोजित किया जाता है।
  2. एलसी-एमएस ग्रेड पानी में पेप्टाइड मानक समाधान (कलरमेट्रिक परख किट में प्रदान किया गया) के सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। 50% अभिकर्मक ए, 48% अभिकर्मक बी और 2% अभिकर्मक सी को मिलाकर काम करने वाले अभिकर्मक तैयार करें।
  3. प्रत्येक पेप्टाइड मानक समाधान (तीन प्रतिकृतियां) के 20 μL और अज्ञात पेप्टाइड नमूने को 96-वेल माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करें। प्रत्येक कुएं में काम करने वाले अभिकर्मक का 180 μL जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और आरटी पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. एक माइक्रोप्लेट रीडर में 480 एनएम पर अवशोषण पढ़ें और पेप्टाइड मानक वक्र के आधार पर पेप्टाइड नमूनों की सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें।

8. एलसी-एमएस विश्लेषण

  1. एलसी बफर ए (2% एसिटोनिट्राइल और 0.1% फॉर्मिक एसिड, एलसी-एमएस ग्रेड) में पेप्टाइड नमूनों को फिर से निलंबित करें। किसी भी संभावित कणों से छुटकारा पाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  2. सुपरनैटेंट को एलसी-एमएस शीशियों में स्थानांतरित करें। नैनोएलसी-एमएस उपकरण का उपयोग करके नमूने का विश्लेषण करें।
    नोट: विस्तृत एलसी-एमएस / एमएस पैरामीटर उपकरण-निर्भर हैं और पहले 22,25,26 वर्णित किए गए हैं।
  3. 5 पीपीएमद्रव्यमान सटीकता के साथ अत्यधिक प्रचुर मात्रा में संदूषक पेप्टाइड चोटियों जैसे स्ट्रेप्टाविडिन और ट्रिप्सिन के लिए प्रतिधारण समय की एक सीमा के साथ एक कस्टम एलसी-एमएस बहिष्करण सूची उत्पन्न करें (उदाहरण के लिए, सामान्य स्ट्रेप्टाविडिन पेप्टाइड चोटियां एम / जेड 402.5435 [चार्ज 3], एम / जेड 603.3117 [चार्ज 2], एम / जेड 654.9733 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड 678.6812 [चार्ज 3], एम / जेड आदि।; सामान्य ट्रिप्सिन पेप्टाइड चोटियाँ m/z 421.7584 [चार्ज 2], m/z 523.2855 [चार्ज 2], और m/z 737.7062 [चार्ज 3]) हैं।

9. प्रोटिओमिक्स डेटा विश्लेषण

  1. प्रोटिओमिक्स डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर जैसे प्रोटिओम डिस्कवर, मैक्सक्वांट27, या एमएस-फ्रैगर28 के साथ एलसी-एमएस कच्चे डेटा का विश्लेषण करें। डेटा विश्लेषण के लिए दो FASTA पुस्तकालयों को शामिल करें: 1) एक स्विसप्रोट होमो सेपियन्स संदर्भ डेटाबेस; 2) एक नया उत्पन्न सार्वभौमिक संदूषक एफएएसटीए लाइब्रेरी (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), जो प्रोटिओमिक्स पहचान में सुधार और झूठी खोजों को कम करनेके लिए साबित हुआ था।
  2. प्रोटीन और पेप्टाइड स्पेक्ट्रल मिलान (पीएसएम) पहचान के लिए 1% झूठी खोज दर (एफडीआर) कटऑफ के साथ प्रोटिओमिक्स डेटा विश्लेषण पैरामीटर सेट करें। अधिकतम तीन छूटे हुए दरारों के साथ ट्रिप्सिन पाचन का चयन करें, सिस्टीन कार्बामिडोमिथाइलेशन का एक निश्चित संशोधन, और मेथिओनिन ऑक्सीकरण और प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटिलीकरण का एक चर संशोधन। लेबल-मुक्त परिमाणीकरण के लिए पेप्टाइड एमएस 1 पीक तीव्रता का उपयोग करें। निकटता लेबलिंग विविधताओं को कम करने के लिए पेप्टाइड तीव्रता को अंतर्जात बायोटिनिलेटेड कार्बोक्सिलेज, प्रोपियोनिल-सीओए कार्बोक्सिलेज (पीसीसीए) के लिए सामान्य करें, जैसा कि पहलेवर्णित है।
    नोट: पीसीसीए सामान्यीकरण को पीसीसीए प्रोटीन अनुक्रम फास्टा फ़ाइल को शामिल करके प्रोटिओम डिस्कवर सॉफ्टवेयर में चुना जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पीसीसीए सामान्यीकरण डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण में आयोजित किया जा सकता है।
  3. प्रोटिओमिक्स सॉफ्टवेयर से प्रोटीन-स्तर के परिणाम निर्यात करें। सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले दूषित प्रोटीन को हटा दें। केवल 1 पीएसएम या बिना परिमाणीकरण परिणाम वाले प्रोटीन को हटा दें। प्रोटीन जीन ऑन्कोलॉजी (जीओ) -एनरिचर30 के साथ और प्रोटीन नेटवर्क विश्लेषण स्ट्रिंग31 के साथ करें।

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Representative Results

यह लाइसोसोम प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स अध्ययन मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में लाइव न्यूरॉन्स में सीटू में गतिशील लाइसोसोमल माइक्रोएन्वायरमेंट को पकड़ने के लिए आयोजित किया गया था। विभिन्न समय बिंदुओं पर एचआईपीएससी और एचआईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की सेल आकृति विज्ञान चित्रा 2 ए में चित्रित किया गया है। मानव आईपीएससी ई 8 माध्यम में कॉलोनियों में बढ़ते हैं। आईपीएससी को डॉक्सीसाइक्लिन युक्त न्यूरॉन प्रेरण माध्यम में चढ़ाकर भेदभाव शुरू किया जाता है। 3 दिन के भेदभाव के दौरान प्रत्येक दिन न्यूराइट एक्सटेंशन अधिक दिखाई देते हैं। न्यूरॉन माध्यम में पीएलओ-लेपित प्लेटों पर स्विच करने के बाद, न्यूराइट न्यूरॉन्स के बीच एक नेटवर्क बनाते हैं, और अक्षीय एक्सटेंशन अधिक दृश्यमान हो जाते हैं क्योंकि न्यूरॉन्स 2 सप्ताह में परिपक्वता तक पहुंचते हैं। आई3न्यूरॉन्स में, एपेक्स जांच का स्थानीयकरण तेजी से एपेक्स सक्रियण के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मान्य है। बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को स्ट्रेप्टाविडिन (एसए) एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया जाता है, और लाइसोसोम को एंटी-एलएएमपी 1 एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया जाता है। विलय की गई छवि एलएएमपी 1-एपेक्स के चारा प्रोटीन (चित्रा 2 बी) के सही स्थानीयकरण को मान्य करती है।

बीड-अनुमापन परख इष्टतम बीड्स-टू-प्रोटीन अनुपात निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की मात्रा सभी बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को समृद्ध करने के लिए पर्याप्त हो, लेकिन एलसी-एमएस में गंभीर स्ट्रेप्टाविडिन संदूषण का कारण बनने के लिए इतनी अधिक न हो। इनपुट प्रोटीन नमूने के 50 μg के लिए आवश्यक मोतियों की इष्टतम मात्रा का चयन इस आधार पर किया जाता है कि वक्र का घातीय क्षय कहां समाप्त होता है (चित्रा 3A) जैसा कि चित्र 3A में दिखाया गया है, मोतियों-प्रोटीन इनक्यूबेशन सतह पर तैरने वाले से डॉट-ब्लॉट सिग्नल कम हो गए क्योंकि स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की बढ़ी हुई मात्रा के साथ अधिक बायोटिनिलेटेड प्रोटीन कैप्चर किए गए थे। अंतर्जात एलएएमपी 1-एपेक्स नमूनों के लिए, 5 μL स्ट्रेप्टाविडिन मोती इनपुट प्रोटीन के 50 μg के लिए इष्टतम थे ( चित्रा 3 ए में हाइलाइट किया गया है)। संवर्धन के बाद, स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों द्वारा कैप्चर किए गए प्रोटीन की मात्रा अज्ञात है। अतिरिक्त प्रोटियोलिटिक एंजाइम (ट्रिप्सिन) एलसी-एमएस में प्रचुर मात्रा में ट्रिप्सिन पेप्टाइड चोटियों के साथ एंजाइम ऑटोडाइजेस्टन को बढ़ा सकता है। अत्यधिक ट्रिप्सिन नमूनों में अधिक स्ट्रेप्टाविडिन पेप्टाइड्स को भी पचा सकता है। इसलिए, ऑन-बीड्स पाचन के लिए आवश्यक प्रोटीज की मात्रा को अनुकूलित किया जाना चाहिए। अकेले ट्रिप्सिन की तुलना में, ट्रिप्सिन / लाइस-सी मिश्रण के साथ ऑन-बीड्स पाचन के परिणामस्वरूप अधिक प्रोटीन और पेप्टाइड्स की पहचान हुई और कम छूटे हुए क्लीवेज (चित्रा 3 बी)। इसके अतिरिक्त, स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के प्रति 250 μL प्रोटीज का 1-1.5 μg पहचाने गए प्रोटीन की उच्चतम संख्या और छूटे हुए दरारों का सबसे कम प्रतिशत प्राप्त करने के लिए इष्टतम था (चित्रा 3 सी)। एक इष्टतम मोती-से-प्रोटीन अनुपात के साथ, मोतियों की समान मात्रा को बायोटिनिलेटेड प्रोटीन की समान मात्रा को पकड़ना चाहिए। इसलिए, इस अनुकूलित प्रोटीज राशि का उपयोग उन सभी प्रयोगों के लिए किया जा सकता है जो एक ही स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को समृद्ध करते हैं।

पेरोक्सीडेज-आधारित निकटता लेबलिंग एंजाइम बायोटिन-फिनोल इनक्यूबेशन और संक्षिप्त एच2ओ2 उपचार (1 मिनट) द्वारा सक्रिय होते हैं। यह कदम निकटता-लेबलिंग प्रोटिओमिक्स में भिन्नता का एक प्रमुख स्रोत है। हमने पहले पाया था कि सबसे प्रचुर मात्रा में, अंतर्जात बायोटिनिलेटेड कार्बोक्सिलेज, पीसीसीए के सामान्यीकरण से प्रयोगात्मक विविधताओं को काफी कम किया जा सकता है, जिससे विभिन्न प्रयोगात्मक बैचों (चित्रा 4)22 में निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक्स डेटा की तुलना की जा सकती है। अंतर्जात एलएएमपी 1-एपेक्स न्यूरॉन्स के लिए, एलएएमपी 1-एपेक्स जांच अभिव्यक्ति के बिना माता-पिता की रेखा का उपयोग नियंत्रण समूह के रूप में किया गया था। नियंत्रण न्यूरॉन्स को बायोटिन-फिनोल और एच2 ओ 2के साथ भी इलाज किया गया था। एलएएमपी 1-एपेक्स बनाम नियंत्रण समूह के प्रोटीन अनुपात का वितरण चित्रा 5 ए में चित्रित किया गया है। सभी अंतर्जात बायोटिनिलेटेड कार्बोक्सिलेज को स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों द्वारा समृद्ध किया गया था, लेकिन अपरिवर्तित रहे। जैसा कि जीओ-टर्म विश्लेषण और प्रोटीन नेटवर्क विश्लेषण (चित्रा 5 बी, सी) में दिखाया गया है, एंडोलाइसोसोमल तस्करी और परिवहन से संबंधित स्थिर लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और क्षणिक लाइसोसोमल इंटरएक्टर्स दोनों एलएएमपी 1-एपेक्स प्रोटिओमिक्स 32,33,34 में समृद्ध थे।

Figure 1
चित्रा 1: हाईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में लाइसोसोम निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक्स के लिए समग्र वर्कफ़्लो। संक्षेप: HIPSC = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; एलएएमपी 1 = लाइसोसोमल संबद्ध झिल्ली प्रोटीन 1; एपेक्स = एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज; डॉक्स = डॉक्सीसाइक्लिन; बीपी = बायोटिन-फिनोल; डीसीए = डिटर्जेंट-संगत प्रोटीन परख; एसए = स्ट्रेप्टाविडिन; एलसी-एमएस / एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री; पीसीसीए = प्रोपियोनिल-सीओए कार्बोक्सिलेज, एक अंतर्जात बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: HIPSC-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और LAMP1-APEX गतिविधि की माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग। (A) HIPSCs और HIPSC-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के विभिन्न चरणों की ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी छवियां। (बी) न्यूरॉन में एलएएमपी 1-एपेक्स गतिविधि की प्रतिदीप्ति इमेजिंग। स्ट्रेप्टाविडिन के खिलाफ सना हुआ बायोटिनिलेटेड सिग्नल नाभिक (होएचएसटी) के बाहर एलएएमपी 1 धुंधला होने के साथ कोलोकलाइज्ड होता है। स्केल सलाखों = (ए) 50 μm, (B) 1 μm। संक्षेप: HIPSC = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; एलएएमपी 1 = लाइसोसोमल संबद्ध झिल्ली प्रोटीन 1; एपेक्स = एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज; एसए = स्ट्रेप्टाविडिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: मोतियों-से-इनपुट प्रोटीन अनुपात और एंजाइमेटिक प्रोटीन पाचन का अनुकूलन प्रोटीन की पहचान में सुधार कर सकता है और हस्तक्षेप को कम कर सकता है। (A) मोतियों-अनुमापन परख का उदाहरण 50 μg इनपुट प्रोटीन और विभिन्न मात्रा में स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों का उपयोग करके डॉट-ब्लॉट परख से उत्पन्न होता है। (ख) ट्रिप्सिन/लाइस-सी मिश्रण के परिणामस्वरूप बेहतर प्रोटीन/पेप्टाइड पहचान हुई और अकेले ट्रिप्सिन की तुलना में कम छूटी हुई दरारें हुईं। (सी) ऑन-बीड्स पाचन के लिए ट्रिप्सिन / लिस-सी की मात्रा का अनुकूलन। इस आंकड़े को फ्रैंकनफील्ड एट अल.22 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक अंतर्जात बायोटिनाइलेटेड कार्बोक्सिलेज, पीसीसीए के लिए निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक्स डेटा का सामान्यीकरण, जैविक प्रतिकृति के बीच परिमाणीकरण भिन्नताओं को कम कर सकता है। इस आंकड़े को फ्रैंकनफील्ड एट अल.22 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त नाम: पीसीसीए = प्रोपियोनिल-सीओए कार्बोक्सिलेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: लाइसोसोम प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स ने न्यूरॉन्स में लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और लाइसोसोमल इंटरैक्शन प्रोटीन को समृद्ध किया। (ए) एलएएमपी 1-एपेक्स के प्रोटीन बहुतायत अनुपात का स्कैटर प्लॉट बनाम कोई एपेक्स नियंत्रण समृद्ध लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और अपरिवर्तित अंतर्जात बायोटिनिलेटेड प्रोटीन दिखाता है। (बी) लाइसोसोम में समृद्ध सेलुलर घटक साबित करने वाले प्रोटिओमिक्स परिणामों का जीओ-टर्म विश्लेषण। (सी) स्ट्रिंग प्रोटीन नेटवर्क विश्लेषण से पता चलता है कि प्रोटीन सीधे चारा प्रोटीन (एलएएमपी 1), लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और लाइसोसोमल इंटरएक्टर्स जैसे झिल्ली तस्करी प्रोटीन के साथ बातचीत करते हैं। इस आंकड़े को फ्रैंकनफील्ड एट अल.22 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: एलएएमपी 1 = लाइसोसोमल संबद्ध झिल्ली प्रोटीन 1; एपेक्स = एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज; जीओ = जीन ऑन्कोलॉजी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मध्यम/बफर घटक प्रोटोकॉल
बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (मैट्रिगेल) कोटिंग समाधान 1% बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स स्टॉक, 99% DMEM / F12 मध्यम 1.1, 1.2
विट्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान पीबीएस में 5 μg / mL अंतिम एकाग्रता 1.1
रॉक अवरोधक के साथ ई 8 पूर्ण माध्यम 98% E8 मध्यम, 2% E8 पूरक, 10 μM Y-27632 या 50 nM Chroman1 1.1
न्यूरॉन प्रेरण माध्यम एचईपीईएस के साथ 97% डीएमईएम / एफ 12, 1% एन 2 पूरक, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 1% एल-ग्लूटामाइन, 2 μg / mL डॉक्सीसाइक्लिन और रॉक अवरोधक (10 μM Y-27632 या 5 nM Chroman 1) 1.2
न्यूरॉन पीएलओ कोटिंग समाधान 0.1 मिलीग्राम / एमएल पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ), 100 एमएम बोरिक एसिड, 25 एमएम सोडियम टेट्राबोरेट, 75 एमएम सोडियम क्लोराइड, 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड 1.3
न्यूरॉन माध्यम 98% कॉर्टिकल न्यूरॉन माध्यम, 2% बी 27 पूरक, 10 एनजी / एमएल मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ), 10 एनजी / एमएल ग्लियल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (जीडीएनएफ), 10 एनजी / एमएल एनटी -3, 0.2 μg / mL लैमिनिन, 2 μg / mL doxycline 1.3
बुझने का बफर पीबीएस में 10 एमएम सोडियम एज़ाइड, 10 एमएम सोडियम एस्कॉर्बेट, 5 एमएम ट्रोलोक्स 2.2
सेल लाइसिस बफर 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% SDS, 1% Triton, 1 mM Tris (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड (TCEP), 10 mM सोडियम एजाइड, 10 mM सोडियम एस्कॉर्बेट, 5 mM TROLOX, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल 2.3
TBS-T 0.05% ट्वीन 20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7.5) 4.2
बफर ए 2% एसडीएस बफर 5.2
बफर बी 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X 5.6
बफर सी 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0.5% SDS, 0.5% Triton-X 5.6
बफर डी 2 एम यूरिया, 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल 5.6

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मीडिया और बफर की रचनाएँ।

समस्या प्रोटोकॉल समाधान/सुझाव
आईपीएससी संस्कृति प्लेट को छील रही है 1.1 विट्रोनेक्टिन कोटिंग एकाग्रता या समय बढ़ाएं।
कुछ आईपीएससी न्यूरॉन्स में अंतर नहीं करते थे 1.2 डी 0 विभेदन के दौरान आईपीएससी को पूरी तरह से अलग करने के लिए सेल डिटेचमेंट समाधान उपचार समय बढ़ाएं।
न्यूरॉन कल्चर प्लेट को छील देता है 1.3 माध्यम को धोना और बदलना कोमल और प्लेट की साइड की दीवार से होना चाहिए।
एसीटोन वर्षा के बाद प्रोटीन पूरी तरह से भंग नहीं होते हैं 2.7 प्रोटीन गोली के सूखने के समय को कम करें। विघटन में मदद करने के लिए लाइसिस बफर और सोनिकेट की मात्रा को संक्षेप में बढ़ाएं।
कमजोर स्ट्रेप्टाविडिन धुंधला संकेत 3 एच2 ओ 2उपचार समय को2-3 सेकंड तक बढ़ाएं और यहां तक कि वितरण के लिए प्लेट को घुमाएं।
मोतियों अनुमापन परख का कम संकेत 4.2 झिल्ली के पूरी तरह सूखने तक प्रतीक्षा करें और सिग्नल की तीव्रता को बढ़ाने के लिए एक ही स्थान पर अधिक सुपरनैटेंट जोड़ें (3x तक दोहरा सकते हैं)।
चुंबकीय मोती चुंबकीय रैक की ओर नहीं बढ़ते हैं 5 गैर-डिटर्जेंट युक्त बफर में चुंबकीय मोती की गतिशीलता कम हो जाती है। वॉश बफर डी में 4 एम या एलसी-एमएस-संगत डिटर्जेंट तक उच्च यूरिया एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है।
मोतियों को धोने के दौरान चुंबकीय मोतियों का नुकसान 5 ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला लेने से पहले चुंबकीय मोतियों (1 मिनट या उससे अधिक) पर नमूना ट्यूबों को रखे जाने पर प्रतीक्षा समय बढ़ाएं।
एलसी-एमएस में सिंगली चार्ज संदूषण चरम पर 6 पेप्टाइड सफाई पर्याप्त नहीं है। पेप्टाइड डिसाल्टिंग के दौरान धोने की मात्रा और समय बढ़ाएं।
पेप्टाइड परख कम संकेत 7 पेप्टाइड एकाग्रता बढ़ाने के लिए कम मात्रा में पेप्टाइड नमूनों को पुन: निलंबित करें।
एलसी-एमएस में भारी स्ट्रेप्टाविडिन सिग्नल 8 स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की मात्रा कम करें। यदि ट्रिप्सिन पीक भी प्रचुर मात्रा में है, तो ट्रिप्सिन की मात्रा को कम करें।
बहुत अधिक गैर-विशिष्ट लेबलिंग पृष्ठभूमि 9 स्ट्रेप्टाविडिन मोती धोना पर्याप्त नहीं था। प्रत्येक धोने के चरण के दौरान सभी अवशिष्ट तरल को हटा दें। मोतियों को धोने के लिए समय और मात्रा बढ़ाएं।

तालिका 2: समस्याओं और समाधानों का निवारण।

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Discussion

इस एलएएमपी 1-एपेक्स जांच का उपयोग करके, लाइसोसोमल झिल्ली पर और उसके पास प्रोटीन बायोटिनाइलेटेड और समृद्ध होते हैं। 100-1,200 एनएम के विशिष्ट लाइसोसोम व्यास को देखते हुए, यह विधि 10-20 एनएम लेबलिंग त्रिज्या के साथ उत्कृष्ट इंट्रासेल्युलर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है। एलएएमपी 1 एक प्रचुर मात्रा में लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और लाइसोसोम के लिए एक शास्त्रीय मार्कर है, जो अंतर्जात अभिव्यक्ति स्तर पर लाइसोसोमल एपेक्स लेबलिंग के लिए एक उत्कृष्ट चारा प्रोटीन के रूप में कार्य करता है। हालांकि, लाइसोसोम को लक्षित करने के लिए एलएएमपी 1 का उपयोग करते समय सीमाएं भी मौजूद हैं, क्योंकि एलएएमपी 1 देर से एंडोसोम और नॉनडिग्रेडेटिव लाइसोसोम35 में भी मौजूद है। अधिकांश लाइसोसोमल मार्कर देर से एंडोसोम में भी व्यक्त किए जाते हैं, जो अंततः लाइसोसोम में परिपक्व होते हैं। लाइसोसोम को लक्षित करने के लिए वैकल्पिक चारा प्रोटीन एलएएमपीटीओआर, एलएएमपी 2 और टीएमईएम 192 35,36,37 हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिक्रियाशील बायोटिन कण झिल्ली में प्रवेश नहीं करते हैं। इसलिए, अधिकांश लाइसोसोमल लुमेन-केवल प्रोटीन इस एलएएमपी 1-एपेक्स प्रोटिओमिक्स विधि में कैप्चर नहीं किए जाते हैं। लाइसोसोमल लुमेन प्रोटीन को पारंपरिक ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन विधि या लाइसोसोमल इम्यूनोप्यूरिफिकेशन 4,38 के माध्यम से लाइसोसोमल अलगाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, लाइसोसोमल अलगाव के दौरान लाइसोसोमल झिल्ली पर प्रोटीन बाधित हो सकते हैं और क्षणिक और गतिशील लाइसोसोमल इंटरैक्शन के लिए जानकारी खो सकते हैं। इसलिए, लाइसोसोमल प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग और लाइसोसोमल अलगाव को लाइसोसोम के बाहर और अंदर दोनों लाइसोसोमल गतिविधियों का एक पूर्ण स्नैपशॉट प्राप्त करने के लिए जोड़ा जा सकता है।

आईपीएससी-न्यूरॉन संस्कृति से परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, न्यूरॉन चढ़ाना घनत्व सभी जैविक प्रतिकृति और तुलना समूहों में सुसंगत होना चाहिए। न्यूरोनल परिपक्वता और स्वास्थ्य के समान स्तर भी इस कारण से महत्वपूर्ण हैं। एपेक्स सक्रियण के दौरान, कोशिकाओं के बायोटिन-फिनोल और एच2ओ 2 को गर्मसंस्कृति माध्यम के साथ पूर्व मिश्रण द्वारा आयोजित किया जाना चाहिए और फिर मिश्रण को कोशिकाओं में जोड़ना चाहिए, इसके बाद वितरण सुनिश्चित करने के लिए तत्काल, कोमल झटके। एच2 ओ 2का उपयोग कोशिका के गतिशील माइक्रोएन्वायरमेंट में ऑक्सीडेटिव तनाव और गड़बड़ी के बारे में चिंताओं को भी बढ़ाता है। यद्यपि प्रोटीन बहुतायत स्तर पर कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं पाया गया था, लेकिन एच 2 ओ 2-उपचारित बनाम नियंत्रणन्यूरॉन्स 22में मेथिओनिन ऑक्सीकरण के साथ अधिक पेप्टाइड्स को संशोधित किया गया था। इसलिए, एच2 ओ 2सक्रियण समय (1 मिनट) का सख्त नियंत्रण ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने और चारा प्रोटीन के आसपास एक विशिष्ट लेबलिंग त्रिज्या सुनिश्चित करने के लिए बायोटिन क्लाउड के प्रसार को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।

एचईके और यू 2 ओएस जैसे गैर-ध्रुवीकृत सेल लाइनों के लिए, मुक्त बायोटिन युक्त सुपरनैटेंट को हटाने के लिए निकटता लेबलिंग के बाद पेलेटिंग द्वारा कोशिकाओं को काटा जा सकता है। हालांकि, न्यूरॉन्स को सीधे प्लेट में सेल लाइसिस बफर जोड़कर और पेलेटिंग के दौरान न्यूराइट क्षति और नमूना हानि से बचने के लिए ट्यूबों में स्क्रैप करके काटा जाना चाहिए। मुक्त बायोटिन की उपस्थिति स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को संतृप्त कर सकती है। मुक्त बायोटिन को पूरी तरह से हटाने के लिए सेल लाइसिस के बाद न्यूरॉन्स और / या प्रोटीन वर्षा में बुझाने वाले बफर के साथ कई वॉश और इनक्यूबेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि विभिन्न चारा प्रोटीनों में अलग-अलग अभिव्यक्ति स्तर होते हैं, इसलिए प्रत्येक नई एपेक्स जांच के लिए एक डॉट ब्लॉट परख आयोजित करने की आवश्यकता होती है। एक बार इष्टतम मोती / प्रोटीन अनुपात निर्धारित होने के बाद, प्रोटीन और मोतियों की मात्रा की शुरुआती मात्रा एक ही एपेक्स जांच के लिए सभी प्रतिकृतियों के अनुरूप होनी चाहिए। एलएएमपी 1-एपेक्स बनाम साइटोसोलिक-एपेक्स जैसे विभिन्न जांचों की तुलना करते समय, मोतियों की समान मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, लेकिन विभिन्न एपेक्स जांच के लिए इष्टतम मोती / प्रोटीन अनुपात को प्रतिबिंबित करने के लिए शुरुआती प्रोटीन की मात्रा को भिन्न करते हैं। प्रयोगात्मक विविधताओं को और कम करने और थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए, सेल कल्चर (एसआईएलएसी) में अमीनो एसिड द्वारा स्थिर आइसोटोप लेबलिंग आयोजित की जा सकतीहै। मल्टीप्लेक्स आइसोबेरिक लेबलिंग का उपयोग टीएमटी / आईटीआरएक्यू / डिल्यू टैग20,40,41,42 के माध्यम से प्रोटीन पाचन के बाद पेप्टाइड्स को रासायनिक रूप से लेबल करने के लिए भी किया जा सकता है।

विभिन्न जीवों में सेलुलर और आणविक माइक्रोएन्वायरमेंट को पकड़ने के लिए निकटता लेबलिंग को व्यापक रूप से लागू किया गयाहै। हालांकि, निकटता लेबलिंग अभी भी कई तकनीकी चुनौतियों का सामना करती है, जैसे कि स्ट्रेप्टाविडिन संकेतों से संदूषण, एंजाइम सक्रियण के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग, और अंतर्जात बायोटिनिलेटेड माइटोकॉन्ड्रियल कार्बोक्सिलेज की उपस्थिति। इसलिए, निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक प्रयोगों के लिए सावधानीपूर्वक योजना और गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता होती है। शोधकर्ताओं को उनके निकटता लेबलिंग प्रयोग का समस्या निवारण करने में मदद करने के लिए, हम तालिका 2 में सामान्य समस्याओं और समाधानों के लिए एक संक्षिप्त मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं। हाल ही में, थिओल-क्लीवर बायोटिन25 का उपयोग करके एक क्लीवर प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग विधि विकसित की गई थी। इसलिए, बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को ऑन-बीड्स पाचन की आवश्यकता के बिना टीसीईपी जैसे कम करने वाले अभिकर्मक का उपयोग करके मोतियों से अलग किया जा सकता है। यह क्लीवर बायोटिन विधि नाटकीय रूप से स्ट्रेप्टाविडिन, अंतर्जात बायोटिनिलेटेड कार्बोक्सिलेज और गैर-विशिष्ट बंधन से हस्तक्षेप संकेतों को कम कर सकती है। चल रहे प्रयास लेबलिंग विशिष्टता और सटीकता में सुधार के लिए एलएएमपी 1-एपेक्स प्रोटिओमिक्स के लिए इस क्लीवरेबल बायोटिन विधि को लागू करेंगे। प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोब को अन्य उपकोशिकीय डिब्बों को लक्षित करने के लिए भी डिज़ाइन किया जा सकताहै। पहचाने गए प्रोटीन की मात्रा और प्रकार चारा प्रोटीन की प्रकृति, इसके इंट्रासेल्युलर वातावरण और निकटता लेबलिंग जांच के अभिव्यक्ति स्तर पर निर्भर हैं। यह अंतर्जात एलएएमपी 1-एपेक्स प्रोटिओमिक्स विधि मानव न्यूरॉन्स में गतिशील लाइसोसोमल गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करती है। विस्तृत प्रोटोकॉल और कार्यप्रणाली अनुकूलन अन्य निकटता लेबलिंग जांच और रासायनिक बायोटिनाइलेशन पर भी लागू होते हैं, जो प्रोटिओमिक्स समुदाय के लिए एक उपयोगी संसाधन के रूप में कार्य करते हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह अध्ययन एनआईएच अनुदान (R01NS121608) द्वारा समर्थित है। एएमएफ एआरसीएस-मेट्रो वाशिंगटन चैप्टर स्कॉलरशिप और बोरबॉन एफ स्क्रिबनर एंडोमेंट फैलोशिप को स्वीकार करता है। हम आणविक जीव विज्ञान समर्थन और आई3न्यूरॉन प्रौद्योगिकी विकास के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस) में माइकल वार्ड लैब को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture

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न्यूरोसाइंस अंक 184 प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग लाइसोसोम प्रोटिओमिक्स आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स एलएएमपी 1 एपेक्स प्रोटीन इंटरैक्शन लाइसोसोमल झिल्ली
प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स के साथ न्यूरोनल लाइसोसोम इंटरएक्टोम का लक्षण वर्णन
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Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).

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