Summary
En neuronal lysosomnærhed mærkning proteomics protokol er beskrevet her for at karakterisere det dynamiske lysosomale mikromiljø i humant inducerede pluripotente stamcelleafledte neuroner. Lysosomale membranproteiner og proteiner, der interagerer med lysosomer (stabilt eller forbigående), kan nøjagtigt kvantificeres i denne metode med fremragende intracellulær rumlig opløsning i levende humane neuroner.
Abstract
Lysosomer kommunikerer ofte med en række biomolekyler for at opnå nedbrydning og andre forskellige cellulære funktioner. Lysosomer er kritiske for menneskets hjernefunktion, da neuroner er postmitotiske og er stærkt afhængige af autofagi-lysosomvejen for at opretholde cellulær homeostase. På trods af fremskridt i forståelsen af forskellige lysosomale funktioner er det teknisk udfordrende at fange den meget dynamiske kommunikation mellem lysosomer og andre cellulære komponenter, især på en måde med høj kapacitet. Her leveres en detaljeret protokol for den nyligt offentliggjorte endogene (knock-in) lysosomnærhedsmærkning proteomiske metode i humaninducerede pluripotente stamcelle (hiPSC) -afledte neuroner.
Både lysosomale membranproteiner og proteiner, der omgiver lysosomer inden for en radius på 10-20 nm, kan med sikkerhed identificeres og kvantificeres nøjagtigt i levende humane neuroner. Hvert trin i protokollen er beskrevet detaljeret, dvs. hiPSC-neuronkultur, nærhedsmærkning, neuronhøst, fluorescensmikroskopi, biotinyleret proteinberigelse, proteinfordøjelse, LC-MS-analyse og dataanalyse. Sammenfattende giver denne unikke endogene lysosomale nærhedsmærkningsproteomics-metode et højt gennemstrømnings- og robust analytisk værktøj til at studere de meget dynamiske lysosomale aktiviteter i levende menneskelige neuroner.
Introduction
Lysosomer er kataboliske organeller, der nedbryder makromolekyler via lysosomal-autofagivejen1. Udover nedbrydning er lysosomer involveret i forskellige cellulære funktioner såsom signaltransduktion, næringsstofføling og sekretion 2,3,4. Forstyrrelser i lysosomal funktion har været impliceret i lysosomale opbevaringsforstyrrelser, kræft, aldring og neurodegeneration 3,5,6,7. For postmitotiske og stærkt polariserede neuroner spiller lysosomer kritiske roller i neuronal cellulær homeostase, frigivelse af neurotransmitter og langdistancetransport langs axonerne 8,9,10,11. Imidlertid har undersøgelse af lysosomer i humane neuroner været en udfordrende opgave. Nylige fremskridt inden for inducerede pluripotente stamcelle (iPSC) -afledte neuronteknologier har gjort det muligt for kulturen af levende menneskelige neuroner, der tidligere var utilgængelige, og bygger bro over kløften mellem dyremodeller og menneskelige patienter til at studere den menneskelige hjerne12,13. Især integrerer den avancerede i3Neuron-teknologi stabilt neurogenin-2-transkriptionsfaktoren i iPSC-genomet under en doxycyclin-inducerbar promotor, hvilket får iPSC'er til at differentiere sig til rene kortikale neuroner i 2 uger14,15.
På grund af den meget dynamiske lysosomale aktivitet er det teknisk udfordrende at fange lysosomale interaktioner med andre cellulære komponenter, især på en måde med høj kapacitet. Nærhedsmærkningsteknologi er velegnet til at studere disse dynamiske interaktioner på grund af dens evne til at fange både stabile og forbigående / svage proteininteraktioner med enestående rumlig specificitet16,17. Konstrueret peroxidase eller biotin ligase kan genetisk smeltes sammen med agnproteinet. Ved aktivering produceres stærkt reaktive biotinradikaler for kovalent at mærke naboproteiner, som derefter kan beriges med streptavidinbelagte perler til nedstrøms bottom-up proteomics via væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) platforme 17,18,19,20,21.
En endogen lysosomal nærhedsmærkning proteomics metode blev for nylig udviklet til at fange det dynamiske lysosomale mikromiljø ii 3neuroner22. Konstrueret ascorbatperoxidase (APEX2) blev banket ind på C-terminalen af det lysosomale associerede membranprotein 1 (LAMP1) i iPSC'er, som derefter kan differentieres til kortikale neuroner. LAMP1 er et rigeligt lysosomalt membranprotein og en klassisk lysosomal markør23. LAMP1 udtrykkes også i sene endosomer, som modnes til lysosomer; Disse sene endosom-lysosomer og ikke-nedbrydende lysosomer omtales alle som lysosomer i denne protokol. Denne endogene LAMP1-APEX-sonde, udtrykt på det fysiologiske niveau, kan reducere LAMP1-fejllokalisering og overudtryksartefakter. Hundredvis af lysosomale membranproteiner og lysosomale interactors kan identificeres og kvantificeres med fremragende rumlig opløsning i levende menneskelige neuroner.
Her beskrives en detaljeret protokol for lysosomnærhedsmærkning af proteomics i humane iPSC-afledte neuroner med yderligere forbedringer fra den nyligt offentliggjorte metode22. Den overordnede arbejdsgang er illustreret i figur 1. Protokollen inkluderer hiPSC-afledt neuronkultur, nærhedsmærkningsaktivering i neuroner, validering af APEX-aktivitet ved fluorescensmikroskopi, bestemmelse af et optimalt streptavidin-perle-til-input-proteinforhold, berigelse af biotinylerede proteiner, proteinfordøjelse på perler, peptidafsaltning og kvantificering, LC-MS-analyse og proteomics-dataanalyse. Retningslinjer for fejlfinding og eksperimentelle optimeringer diskuteres også for at forbedre kvalitetskontrol og ydeevne for nærhedsmærkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af George Washington University biosikkerhed og etik komité. Sammensætningerne af medier og buffere, der anvendes i denne protokol, er angivet i tabel 1. De kommercielle produktoplysninger, der bruges her, findes i materialetabellen.
1. Human iPSC-afledt neuronkultur
- Human iPSC-kultur og LAMP1-APEX-sondeintegration (7 dage)
- Matrigel stamopløsning optøes i en isspand ved 4 °C natten over, aliquot 500 μL af opløsningen i kolde sterile rør, og aliquoterne opbevares ved -80 °C. Der fremstilles 50 ml overfladebehandlingsopløsning ved tilsætning af 500 μL af Matrigel-stammen til 49,5 ml koldt DMEM/F12-medium.
BEMÆRK: Hold Matrigel kold og brug forkølede koniske rør og pipettespidser for at forhindre polymerisation. Belægningsopløsningen kan opbevares ved 4 °C i 2 uger. - Overtræk en 10 cm cellekulturskål med 4 ml belægningsopløsning i 1 time i en 37 °C inkubator.
BEMÆRK: Vitronectin kan være en alternativ overfladebehandlingsopløsning ved 5 μg/ml koncentration og 2 timers belægning til iPSC-kultur. Vitronectin (enkelt proteinkomponent) er dyrere end Matrigel, men har mindre batchvariationer og renere baggrundssignaler end Matrigel, som ekstraheres fra musetumor med adskillige ekstracellulære matrixproteiner. Ikke-behandlet vævskulturplade er nødvendig til vitronectinbelægning. Matrigelbelægning fungerer til både behandlede og ikke-behandlede vævskulturplader. - Optøning og tallerken 1-3 millioner hiPSC'er på hver overtrukket 10 cm skål forudindlæst med 8 ml Essential E8 komplet medium suppleret med ROCK-hæmmer (endelig koncentration 10 μM Y-27632 eller 50 nM Chroman1).
BEMÆRK: Tilføjelse af ROCK-hæmmer (Y-27632 eller Chroman1) til stamcellekulturmediet minimerer dissociationsinduceret apoptose efter opdeling og kryogen konservering. Chroman1 har for nylig vist sig at være mere potent end Y-27632 til at hæmme både ROCK1 og ROCK224. - Skift til 10 ml E8 komplet medium uden ROCK-hæmmer, efter at iPSC'erne danner kolonier, typisk efter 1-2 dage. Bevar iPSC-kulturen i E8 komplet medium, og udskift supernatanten med frisk medium hver anden dag.
- Integrer nærhedsmærkningsenzymet, konstrueret ascorbatperoxidase (APEX2), i C-terminalen af endogent LAMP1-gen ved CRISPR-genomteknik. Du kan finde detaljerede trin til at generere en konstrueret stabil cellelinje i den tidligere publicerede metode (Frankenfield et al.). 22.
- Matrigel stamopløsning optøes i en isspand ved 4 °C natten over, aliquot 500 μL af opløsningen i kolde sterile rør, og aliquoterne opbevares ved -80 °C. Der fremstilles 50 ml overfladebehandlingsopløsning ved tilsætning af 500 μL af Matrigel-stammen til 49,5 ml koldt DMEM/F12-medium.
- Human iPSC-neuron differentiering (3 dage)
- Overtræk en 10 cm cellekulturskål natten over med 4 ml Matrigel-belægningsopløsning i en 37 °C inkubator inden differentiering.
- Vedligehold hiPSC'er indtil ~ 70% sammenløb. Vask forsigtigt hiPSC'erne med fosfatbufferet saltvand (PBS) 2x for at fjerne døde celler. Aspirer PBS og tilføj 3 ml Accutase til 10 cm skålen af celler. Ryst pladen for jævn fordeling og inkuber i 8 minutter i en 37 °C inkubator.
- Tilsæt 2 ml PBS for at vaske og løfte cellerne fra pladen og opsamling af al celleopløsning i et 15 ml konisk rør. Pellet cellerne ved centrifugering ved 300 × g i 5 min. Plade 2-4 × 106 hiPSC'er på en Matrigel-overtrukket plade forudindlæst med 8 ml varmt neuroninduktionsmedium (tabel 1). Jævnt fordelt cellerne og anbring dem i en 37 °C inkubator.
BEMÆRK: Neurondifferentiering er drevet af en doxycyclin-inducerbar transkriptionsfaktor, neurogenin-2 (NGN2), som blev overudtrykt i denne stabile hiPSC-cellelinje15. - Vask hiPSC'er forsigtigt med PBS på dag 1 af differentiering for at fjerne dødt celleaffald. Udskift med 10 ml varmt induktionsmedium uden ROCK-hæmmer.
- Skift med varmt induktionsmedium uden ROCK-hæmmer hver dag indtil dag 3 af differentiering.
BEMÆRK: Neuroner er klar til at blive omlagt til neuronalt medium.
- Plating neuroner og vedligeholdelse af neuronkultur (10 dage)
- Der fremstilles 0,1 mg/ml poly-L-ornithin(PLO)-overfladebehandlingsopløsning i Boratbuffer (tabel 1).
- Overtræk en cellekulturskål med PLO-belægningsopløsningen i en 37 °C inkubator i mindst 1 time eller natten over inden plettering af dag 3-neuroner. Vask fadet med 4 ml sterilt vand tre gange og lad det lufttørre helt inde i biosikkerhedsskabet.
- Dissociere dag 3 neuroner fra hver 10 cm skål med 3 ml accutase og plade 8-10 millioner celler på hver 10 cm PLO-belagt skål forudindlæst med varmt kortikalt neuronmedium (tabel 1).
- Udfør en halv-medium ændring hver 2-3 dage med varmt neuronmedium, indtil i3neuroner når modning om 2 uger efter differentiering.
2. In situ nærhed mærkning og neuron lysis (2 timer)
- Der fremstilles 500 mM biotin-phenol (BP) stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevares ved -20 °C. På dagen for nærhedsmærkning fortyndes BP-stamopløsningen med varmt neuronmedium og behandles neuronerne i en endelig koncentration på 500 μM i 30 minutter i en 37 ° C inkubator.
BEMÆRK: Doxycyclin tilsættes i neuronmediet, som aktiverer APEX-enzymekspression. Doxcyclin skal tilsættes mindst 24 timer før nærhedsmærkningseksperimentet. - Start mærkningsreaktionen ved at tilføjeH2O2ved en endelig koncentration på 1 mM i neuronkulturen og inkuberes i nøjagtigt 1 min. Opsæt straks mediet og skyl 3 gange med slukningsbuffer (tabel 1).
BEMÆRK: H2O2-opløsning skal gøres frisk inden mærkningsreaktionen. H2O 2-aktiveringen skal være nøjagtigt 1 minut for at reducere eksperimentel variation og minimere oxidativ stress forårsaget af langvarig H2 O2-behandling. - Vip pladen for at opsuge hele den resterende buffer. Tilsæt iskolde cellelysisbuffer (tabel 1) direkte på neuronpladen. Brug 100 μL cellelysebuffer pr. 1 million neuroner. Hvirvl pladen for tilstrækkelig cellelysis og læg den på is.
- Skrab cellelysaterne i kolde 1,5 ml rør. Sonicate i et iskoldt vandbad ved hjælp af en badesonikator (>100 W) i 15 minutter med skiftevis 40 s på, 20 s off cyklusser.
BEMÆRK: Tilstrækkeligt lyset proteinopløsning skal være klar uden pellets eller overdrevne bobler. Tilstrækkelig sonikering af cellelysat er afgørende for at forskyde nukleinsyrer og reducere cellelysatets klæbrighed for at reducere uspecifik binding i nedstrømsprocedurer. En sonde sonikator kan også bruges til at give stærkere og hurtigere cellelysis, men vask sonden mellem prøver er nødvendig for at minimere krydskontaminering og prøvetab. - Der tilsættes kold acetone (-20 °C) til prøven ved et 4 gange volumen lysisbuffer. Hvirvel kort og inkuberes ved -20 °C i 3 timer.
- Centrifuge ved 16.500 × g i 10 minutter ved 2 °C. Fjern supernatanten uden at forstyrre proteinpillen. Pelleten vaskes med 1 ml -20 °C acetone 2x og supernatanten fjernes efter centrifugering.
- Tør proteinpillen med en vakuumkoncentrator i 1 min. Tilsæt cellelysebuffer for at opløse pelleten fuldstændigt. Sonicate kort, hvis det er nødvendigt. Prøverne opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Acetoneudfældning kan fjerne restbiotin-phenol i prøven, hvilket kan forstyrre nedstrøms berigelse af biotinylerede proteiner.
3. Fluorescensmikroskopi til validering af APEX-lokalisering og aktivitet (1,5 dage)
- Inkubere i3neuroner, der udtrykker endogen LAMP1-APEX med 500 μM BP i 30 minutter ved 37 °C. Aktivér mærkningen med 1 mM H2O2-behandling i kun 1 s for at begrænse diffusionen af biotinsky.
- Fix cellerne straks med 4% paraformaldehyd i slukningsbufferen og vask forsigtigt 3x med PBS.
BEMÆRK: For en 10 cm skål er der brug for 4-6 ml til en tilstrækkelig vask. - Bloker og gennemtræng cellerne ved hjælp af 3% æselserum og 0,1% saponin i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Inkubere cellerne med primært anti-LAMP1-antistof (musens monoklonale H3A4, 1:1.000) natten over ved 4 °C.
- Vask neuronerne 3 x forsigtigt med PBS. Inkuber neuronerne med anti-mus AF561 sekundært antistof (1:1.000) og Streptavidin-680 (1:1.000) i 1 time ved RT.
- Vask 2x med PBS og inkuberes med Hoechst eller 4',4-diamidino-2-phenylindol (DAPI) nuklear markør i 10 minutter ved RT. Skyl cellerne 2x med PBS.
- Visualiser de faste neuroner under et fluorescensmikroskop. Overhold biotinylerede proteiner farvet med streptavidin og colokaliseret med LAMP1-farvning uden for kernen for at validere den korrekte placering af APEX-aktivitet.
4. Bestemmelse af streptavidin perler-til-input proteinforhold (1,5 dage)
- Udfør vaskemiddelkompatibelt proteinassay (DCA) for at bestemme totale proteinkoncentrationer i cellelysater
- Proteinstandarden for bovin serumalbumin (BSA) opløses i cellelysebufferen i en koncentration på 4 mg/ml. Der fremstilles en række BSA-proteinstandardopløsninger (0,2-2 mg/ml, 5 fortyndinger) ved hjælp af cellelysebufferen.
- Der overføres 5 μL fra hver proteinprøve, BSA-proteinstandardopløsning og blindcellelysisbuffer i tre eksemplarer i hver brønd i en 96-brøndsplade.
- Der tilsættes 2 μL reagens S pr. 1 ml reagens A for at få reagens A'. Der tilsættes 25 μL reagens A' til hver brønd. Der tilsættes 200 μL reagens B til hvert hul. Bland og pop bobler, hvis de er til stede.
- Inkuber den 96-brønds plade ved RT i 15 minutter, læs absorbansen ved 750 nm i en mikropladelæser, og kvantificer koncentrationerne af proteinprøver baseret på BSA-standardkurven.
- Perler titrering dot blot assay (1,5 dage)
- Overfør en række streptavidin magnetiske perler opslæmning (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) til PCR-strimmelrør. Sæt PCR-strimmelrørene på et magnetisk stativ, vask perlerne 3x med 100 μL 2% SDS-buffer, og fjern vaskebufferen helt, mens du er på magnetstativet.
- Der tilsættes 50 μg proteinprøve til hvert rør. Tilsæt mere lysisbuffer til et samlet volumen på 80 μL. Luk hvert rør tæt og drej ved 4 °C natten over.
- Centrifuge PCR-strimlen rør kort på en stationær mikrocentrifuge. Placer PCR-strimmelrørene på et magnetisk stativ i 1 min. Der anbringes 2 μL supernatant fra hvert rør på en tør nitrocellulosemembran, og membranen tørres helt.
BEMÆRK: Hvis signalintensiteten er lav, kan mere end 2 μL ses på membranen. Volumenet kan øges ved at spotte flere gange på samme sted, efter at membranen er lufttørret mellem hver gang. Et Bio-Dot apparat kan også bruges. - Inkuber membranen i blokerende buffer (TBS) i 1 time. Inkuber membranen i Streptavidin Alexa Fluor 680 konjugat (1:1.000 i blokerende buffer) i 1 time. Vask derefter membranen med TBS-T (tabel 1) 5x.
BEMÆRK: Et alternativ til dot blot-analysen er western blotting ved hjælp af et streptavidin-antistof. - Mål det fluorescerende signal for hver prik på membranen under 680 nm bølgelængde, og generer et spredningsplot med fluorescerende signal over mængden af perler. Vælg det optimale volumen af perler, der er nødvendigt for 50 μg inputproteinprøve baseret på, hvor kurvens eksponentielle henfald slutter.
BEMÆRK: Fluorescensintensitet repræsenterer overflod af biotinylerede proteiner i supernatanten, som skal falde med stigende mængder perler.
5. Berigende biotinylerede proteiner og fordøjelse på perler (3 dage)
- Overfør proteinlysatprøver fra -80 ° C og soniker prøverne i 1,5 ml rør i 30 s i en badsonikator for hurtigt at optø opløsningerne. Hvirvel og læg prøverørene på is.
- Overfør 250 μL streptavidin (SA) magnetisk perleopslæmning til hvert 1,5 ml rør. Sæt rørene på et magnetisk stativ, vask perlerne 3x med 1 ml vaskebuffer A (2% SDS), og fjern den resterende buffer.
- Baseret på resultaterne af dot blot-analysen og DC-proteinassayet beregnes mængden af proteinprøve (μg), der er nødvendig for 250 μL af streptavidin magnetiske perler gylle.
BEMÆRK: I denne endogent udtrykte LAMP1-APEX-sonde er der brug for 5 μL perler til 50 μg inputprotein. Derfor tilsættes 2,5 mg total protein til 250 μL perler. Mindre end 250 μL SA-perler kan anvendes til begrænset inputprøvemateriale. - Der tilsættes cellelysisbuffer til røret, der indeholder den magnetiske perlelysatblanding, til et samlet volumen på 1 ml og roteres ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Prøver fra forskellige grupper eller replikater bør normaliseres til samme proteinkoncentration, volumen og mængde perler for at reducere eksperimentelle variationer. - Drej alle rørene kort ned på en bordplade mikrocentrifuge og læg rørene på et magnetisk stativ i 1 min. Fjern supernatanten, mens du er på magnetstativet.
BEMÆRK: Det er vigtigt at vente i 1 minut efter at have placeret prøverørene på magnetstativet hver gang. Dette kan minimere perletab på grund af den usynlige lille mængde perler, der stadig bevæger sig mod magneten i opløsningen. - Vask perlerne 2x med 1 ml vaskebuffer A ved RT (5 minutters rotation hver gang). Gentag processen med hver vaskebuffer 2x sekventielt ved 4 °C. (buffer B, buffer C og buffer D; Tabel 1).
BEMÆRK: En høj koncentration af SDS-opløsning kan udfældes ved kolde temperaturer. Den første vask skal udføres på RT. - Sæt rørene på magnetstativet. Vask perlerne 2x med buffer D for helt at fjerne resterende vaskemiddel. Resuspender perlerne i 100 μL 50 mM Tris-buffer, og tilsæt 5 mM TCEP (endelig koncentration) for at inkubere i 30 minutter ved 37 °C i en temperaturstyret mixer, og ryst ved 1.200 o/min.
- Der tilsættes 15 mM iodoacetamid (IAA, endelig koncentration) til hvert rør, og der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C i en temperaturstyret mixer, idet der rystes ved 1.200 o/min i mørke (blanderhætte på).
BEMÆRK: IAS er lysfølsom og bør gøres frisk 5 min før dette trin. - Der tilsættes 5 mM TCEP (endelig koncentration) for at slukke overskydende IAS. Der inkuberes i 10 minutter ved 37 °C i en temperaturstyret mixer med omrystning ved 1.200 o/min (blanderhætte af).
- Centrifuge prøverørene kort og læg dem på et magnetisk stativ i 1 minut for at fjerne supernatanten. Der tilsættes 200 μL 5 mM TCEP i 50 mM Tris-buffer for at suspendere perlerne igen. Der tilsættes 1 μg Trypsin/Lys-C-blanding til prøven, og der inkuberes i 14 timer ved 37 °C i en temperaturstyret mixer, idet der omrystes ved 1.200 o/min.
- Tilsæt yderligere 0,2 μg Trypsin/Lys-C-blanding og fordøjes i 3 timer.
- Drej prøverørene kort ned og læg rørene på et magnetisk stativ i 1 min. Overfør peptidsupernatanten for at rense rørene, mens du er på et magnetisk stativ. Vask perlerne med 50 μL 50 mM Tris buffer (ryst i 5 min) og kombiner peptidsupernatanterne.
- Tilsæt 30 μL 10% trifluoreddikesyre (TFA) til røret indeholdende peptidsupernatant for at få pH <3.
6. Peptidafsaltning og fraktionering (2 timer)
- Våd den omvendte fase fastfaseekstraktionsplade (kun brøndene til brug) med 200 μL HPLC-methanol (MeOH) 3x på vakuummanifolden. Tilsæt 200 μL 1% TFA i HPLC-vand 3x for at ækvilibrere pladen.
- Læg peptidprøverne i pladen, og tænd langsomt vakuumet for en strømningshastighed lavere end 3 dråber / s for at minimere prøvetab.
- Udsugningspladen vaskes 3x med 200 μL 1% TFA. Udsugningspladen vaskes igen med 200 μL 1% TFA indeholdende 2% MeOH (v/v). Hold strømningshastigheden lavere end 3 dråber / s.
- Udskift opsamlingspladen med en 96-brønds opsamlingsplade. Hvis der ikke er behov for fraktionering, elueres peptidprøverne 3x med 100 μL 1% TFA indeholdende 80% MeOH og kombineres i et nyt prøverør. Tør peptidprøverne i en vakuumkoncentrator uden varme.
BEMÆRK: Hvis fraktionering ønskes, kan peptidprøver elueres i 4 fraktioner efterfølgende ved hjælp af 200 μL 1% TFA indeholdende henholdsvis 15%, 35%, 50% og 90% MeOH i en anden opsamlingsplade.
7. Kolorimetrisk peptidkvantificeringsassay (valgfrit) (1 time)
- Resuspender peptidprøver i 50 μL vand af LC-MS-kvalitet, og tag 20 μL aliquots for at udføre peptidassayet.
BEMÆRK: Dette trin bruger en stor mængde peptidprøve, men kan give en nøjagtig kvantificering af peptidkoncentrationen før LC-MS-analyse. Dette udføres typisk kun én gang pr. prøvetype til test før storstilet prøveforberedelse. - Forbered serielle fortyndinger af peptidstandardopløsningerne (tilvejebragt i kolorimetriske analysesæt) i LC-MS-kvalitetsvandet. Arbejd reagenset ved at blande 50% reagens A, 48% reagens B og 2% reagens C.
- 20 μL af hver peptidstandardopløsning (tre replikater) og den ukendte peptidprøve overføres til en mikroplade med 96 brønde. Tilsæt 180 μL arbejdsreagens til hver brønd, bland godt og inkuber pladen i 30 minutter ved RT.
- Absorbansen ved 480 nm i en mikropladelæser aflæses, og koncentrationerne af peptidprøver baseret på peptidstandardkurven aflæses.
8. LC-MS analyse
- Peptidprøverne genudsættes i LC-buffer A (2 % acetonitril og 0,1 % myresyre, LC-MS-kvalitet). Centrifuge ved 16.500 × g i 10 minutter ved 4 °C for at slippe af med eventuelle partikler.
- Overfør supernatanten til LC-MS hætteglas. Analyser prøverne ved hjælp af et nanoLC-MS-instrument.
BEMÆRK: Detaljerede LC-MS/MS-parametre er instrumentafhængige og er tidligere beskrevet22,25,26. - Generer en brugerdefineret LC-MS-ekskluderingsliste med en række retentionstider for meget rigelige forurenende peptidtoppe såsom streptavidin og trypsin med 5 ppm massenøjagtighed 22 (f.eks. er almindelige streptavidinpeptidtoppe m/z 402.5435 [ladning 3], m/z 603.3117 [opladning 2], m/z 654.9733 [opladning 3], m/z 678.6812 [opladning 3], m/z 1017.5182 [opladning 2], osv.; Almindelige trypsinpeptidtoppe er m/z 421.7584 [ladning 2], m/z 523.2855 [ladning 2] og m/z 737.7062 [ladning 3]).
9. Proteomics dataanalyse
- Analyser LC-MS rådata med proteomics dataanalysesoftware som Proteome Discoverer, MaxQuant27 eller MS-Fragger28. Medtag to FASTA-biblioteker til dataanalyse: 1) en Swissprot Homo Sapiens referencedatabase; 2) et nyligt genereret universelt forurenende FASTA-bibliotek (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), som viste sig at forbedre proteomics-identifikation og mindske falske opdagelser29.
- Konfigurer proteomics-dataanalyseparametrene med en 1% falsk opdagelsesrate (FDR) cutoff for protein- og peptidspektral matchning (PSM) identifikationer. Vælg trypsinfordøjelse med maksimalt tre ubesvarede spaltninger, en fast modifikation af cysteincarbamidomethylering og en variabel modifikation af methioninoxidation og protein N-terminal acetylering. Brug peptid MS1-spidsintensiteter til etiketfri kvantificering. Normaliser peptidintensiteterne til den endogene biotinylerede carboxylase, propionyl-CoA carboxylase (PCCA), for at reducere variationer i nærhedsmærkning, som beskrevet tidligere22.
BEMÆRK: PCCA-normalisering kan vælges i Proteome Discoverer-software ved at inkludere en PCCA-proteinsekvens FASTA-fil. Alternativt kan PCCA-normalisering udføres i downstream-dataanalysen. - Eksporter proteinniveauresultater fra proteomics-softwaren. Fjern forurenende proteiner inden statistisk analyse29. Fjern proteiner med kun 1 PSM eller intet kvantificeringsresultat. Udfør proteingenontologi (GO)-termanalyse med Enrichr30 og proteinnetværksanalyse med STRING31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne lysosom-nærhedsmærkning proteomics-undersøgelse blev udført i humane iPSC-afledte neuroner for at fange det dynamiske lysosomale mikromiljø in situ i levende neuroner. Cellemorfologier af hiPSC'er og hiPSC-afledte neuroner på forskellige tidspunkter er illustreret i figur 2A. Humane iPSC'er vokser i kolonier i E8-medium. Differentiering initieres ved at plettere iPSC'er i doxycyclinholdigt neuroninduktionsmedium. Neurite-udvidelser bliver mere synlige hver dag i løbet af 3-dages differentieringen. Efter at have skiftet til PLO-belagte plader i neuronmedium danner neuritterne et netværk mellem neuroner, og aksonale forlængelser bliver mere synlige, når neuronerne når modning om 2 uger. Ii 3neuroner valideres lokaliseringen af APEX-sonden ved fluorescensmikroskopi efter hurtig APEX-aktivering. Biotinylerede proteiner farves ved hjælp af streptavidin (SA) antistof, og lysosomer farves ved anvendelse af anti-LAMP1 antistof. Det flettede billede validerer den korrekte lokalisering af LAMP1-APEX til agnproteinet (figur 2B).
Perletitreringsanalysen er afgørende for at bestemme det optimale perle-til-protein-forhold, så mængden af streptavidinperler er nok til at berige alle de biotinylerede proteiner, men ikke så overdreven til at forårsage alvorlig streptavidinforurening i LC-MS. Det optimale volumen af perler, der er nødvendigt for 50 μg inputproteinprøve, vælges ud fra, hvor kurvens eksponentielle henfald slutter (figur 3A) Som vist i figur 3A faldt prik-blot-signaler fra perleproteininkubationssupernatanten, da flere biotinylerede proteiner blev fanget med øgede mængder af streptavitinperlerne. For endogene LAMP1-APEX-prøver var 5 μL streptavidinperler optimale til 50 μg inputprotein (fremhævet i figur 3A). Efter berigelse er mængden af protein fanget af streptavidinperlerne ukendt. Overskydende proteolytisk enzym (trypsin) kan øge enzymets autodigestion med rigelige trypsintoppe i LC-MS. Overdreven trypsin kan også fordøje flere streptavidinpeptider i prøverne. Derfor bør mængden af protease, der er nødvendig til fordøjelsen af perler, optimeres. Sammenlignet med trypsin alene resulterede fordøjelsen på perler med Trypsin / Lys-C-blanding i identifikation af flere proteiner og peptider og færre ubesvarede spaltninger (figur 3B). Derudover var 1-1,5 μg protease pr. 250 μL streptavidin magnetiske perler optimalt for at opnå det højeste antal identificerede proteiner og den laveste procentdel af ubesvarede spaltninger (figur 3C). Med et optimalt forhold mellem perler og protein skal den samme mængde perler fange den samme mængde biotinylerede proteiner. Derfor kan denne optimerede proteasemængde bruges til alle eksperimenter, der beriger biotinylerede proteiner ved hjælp af de samme streptavidin magnetiske perler.
Peroxidasebaserede nærhedsmærkningsenzymer aktiveres ved biotin-phenolinkubation og kortH2O2-behandling(1 min). Dette trin er en vigtig kilde til variation i nærhedsmærkning proteomics. Vi har tidligere fundet ud af, at normalisering til den mest rigelige, endogene biotinylerede carboxylase, PCCA, kan reducere eksperimentelle variationer betydeligt, hvilket muliggør sammenligning af nærhedsmærkning proteomics-data på tværs af forskellige eksperimentelle batcher (figur 4)22. For endogene LAMP1-APEX neuroner blev forældrelinjen uden LAMP1-APEX sondeekspression anvendt som en kontrolgruppe. Kontrolneuroner blev også behandlet med biotin-phenol ogH2O2. Fordelingen af proteinforhold mellem LAMP1-APEX og kontrolgruppen er illustreret i figur 5A. Alle de endogene biotinylerede carboxylaser blev beriget med streptavidinbelagte perler, men forblev uændrede. Som vist i GO-termanalysen og proteinnetværksanalysen (figur 5B, C) blev både stabile lysosomale membranproteiner og forbigående lysosomale interactors relateret til endolysosomal handel og transport beriget i LAMP1-APEX proteomics32,33,34.
Figur 1: Samlet arbejdsgang for lysosomnærhed mærkning proteomics i hiPSC-afledte neuroner. Forkortelser: hiPSC = menneskeinduceret pluripotent stamcelle; LAMP1 = lysosomalt associeret membranprotein 1; APEX = ascorbatperoxidase; dox = doxycyclin; BP = biotin-phenol; DCA = vaskemiddelkompatibelt proteinassay; SA = streptavidin; LC-MS/MS = væskekromatografi-tandem massespektrometri; PCCA = propionyl-CoA carboxylase, et endogent biotinyleret protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikroskopisk billeddannelse af hiPSC-afledte neuroner og LAMP1-APEX-aktivitet. (A) Brightfield-mikroskopibilleder af forskellige stadier af hiPSC'er og hiPSC-afledte neuroner. (B) Fluorescensbilleddannelse af LAMP1-APEX-aktivitet i neuronen. Biotinylerede signaler farvet mod streptavidin colocalize med LAMP1 farvning uden for kernen (HOECHST). Skalabjælker = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Forkortelser: hiPSC = menneskeinduceret pluripotent stamcelle; LAMP1 = lysosomalt associeret membranprotein 1; APEX = ascorbatperoxidase; SA = streptavidin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Optimering af proteinforholdet mellem perler og input og enzymatisk proteinfordøjelse kan forbedre proteinidentifikationer og reducere interferens . (A) Eksempel på perletitreringsanalyse er resultatet af dot-blot-assay ved anvendelse af 50 μg inputprotein og forskellige mængder streptavidinperler. (B) Trypsin / Lys-C-blanding resulterede i bedre identifikation af protein / peptid og færre ubesvarede spaltninger end trypsin alene. (C) Optimering af mængden af Trypsin/Lys-C til fordøjelse på perler. Dette tal er blevet ændret fra Frankenfield et al.22. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Normalisering af nærhedsmærkning proteomics-data til en endogent biotinyleret carboxylase, PCCA, kan reducere kvantificeringsvariationer blandt biologiske replikater. Dette tal er blevet ændret fra Frankenfield et al.22. Forkortelse: PCCA = propionyl-CoA carboxylase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Lysosomnærhed mærkning proteomics beriget lysosomale membranproteiner og lysosomale interagerende proteiner i neuroner. (A) Spredningsplot af proteinforekomstforhold mellem LAMP1-APEX versus ingen APEX-kontrol, der viser berigede lysosomale membranproteiner og uændrede endogene biotinylerede proteiner. (B) GO-term analyse af proteomics resultater, der viser beriget cellulær komponent ved lysosomet. (C) STRING-proteinnetværksanalyse, der viser, at proteiner interagerer direkte med agnproteinet (LAMP1), lysosomale membranproteiner og lysosomale interactors såsom membranhandelsproteiner. Dette tal er blevet ændret fra Frankenfield et al.22. Forkortelser: LAMP1 = lysosomalt associeret membranprotein 1; APEX = ascorbatperoxidase; GO = genontologi. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Medium/buffer | Komponent | Protokol | ||
| Kældermembranmatrix (Matrigel) belægningsopløsning | 1% kældermembranmatrix lager, 99% DMEM / F12 medium | 1.1, 1.2 | ||
| Vitronectin belægning opløsning | 5 μg/ml slutkoncentration i PBS | 1.1 | ||
| E8 komplet medium med ROCK-hæmmer | 98% E8 medium, 2% E8 supplement, 10 μM Y-27632 eller 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Neuron induktion medium | 97% DMEM / F12 med HEPES, 1% N2 supplement, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1% L-glutamin, 2 μg / ml doxycyclin og ROCK-hæmmer (10 μM Y-27632 eller 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| Neuron PLO belægning opløsning | 0,1 mg/ml Poly-L-Ornithin (PLO), 100 mM borsyre, 25 mM natriumtetraborat, 75 mM natriumchlorid, 1 M natriumhydroxid | 1.3 | ||
| Neuron medium | 98% kortikalt neuronmedium, 2% B27 supplement, 10 ng / ml hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF), 10 ng / ml glialafledt neurotrofisk faktor (GDNF), 10 ng / ml NT-3, 0.2 μg / ml Laminin, 2 μg / ml doxycyclin | 1.3 | ||
| Sluk buffer | 10 mM natriumazid, 10 mM natriumascorbat, 5 mM TROLOX i PBS | 2.2 | ||
| Cellelysis buffer | 50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Triton, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), 10 mM natriumazid, 10 mM natriumascorbat, 5 mM TROLOX, proteasehæmmercocktail | 2.3 | ||
| Tbs-T | 0,05% Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Buffer A | 2% SDS-buffer | 5.2 | ||
| Buffer B | 50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 2% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer C | 50 mM Tris-HCI, 250 mM NaCl, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer D | 2 m urinstof, 50 mM Tris-HCI | 5.6 | ||
Tabel 1: Sammensætninger af medier og buffere anvendt i denne protokol.
| Problem | Protokol | Løsning/forslag | ||||
| iPSC-kultur skræller af pladen | 1.1 | Forøg koncentrationen eller tiden for vitronectinbelægning. | ||||
| Nogle iPSC'er differentierede sig ikke til neuroner | 1.2 | Forøg behandlingstiden for celleopløsningen for fuldstændigt at adskille iPSC'er under d0-differentiering. | ||||
| Neuronkultur skræller af pladen | 1.3 | Vask og skift af mediet skal være skånsomt og fra pladens sidevæg. | ||||
| Proteiner opløses ikke fuldstændigt efter acetoneudfældning | 2.7 | Reducer tørretiden for proteinpillen. Forøg volumenet af lysisbuffer og sonikat kort for at hjælpe opløsningen. | ||||
| Svage streptavidin farvningssignaler | 3 | Forøg H2O 2 behandlingstid til at være2-3 s og hvirvl pladen for jævn fordeling. | ||||
| Lavt signal om perlertitreringsanalyse | 4.2 | Vent, indtil membranen er helt tørret, og tilsæt mere supernatant til det samme sted (kan gentage op til 3x) for at forbedre signalintensiteten. | ||||
| Magnetiske perler, der ikke pelleterer mod magnetisk rack | 5 | Magnetisk perlemobilitet falder i ikke-vaskemiddelholdig buffer. Højere urinstofkoncentration op til 4 M eller LC-MS-kompatibelt vaskemiddel kan bruges i vaskebuffer D. | ||||
| Magnetiske perler tab under perler vask | 5 | Forøg ventetiden, når prøverør placeres på magnetperlerne (1 minut eller længere), før du tager supernatant fra rørene. | ||||
| Enkeltvis ladet forurening topper i LC-MS | 6 | Peptidoprydning ikke tilstrækkelig. Forøg vaskevolumener og tider under peptidafsaltning. | ||||
| Peptid assay lavt signal | 7 | Resuspender peptidprøver i lavere volumen for at øge peptidkoncentrationen. | ||||
| Overvældende streptavidin signaler i LC-MS | 8 | Reducer mængden af streptavidin perler. Hvis trypsintoppen også er rigelig, skal du reducere trypsinmængden. | ||||
| For mange uspecifikke mærkningsbaggrunde | 9 | Streptavidin perler vask var ikke tilstrækkelig. Fjern al resterende væske under hvert vasketrin. Forøg tid og volumen til perlevask. | ||||
Tabel 2: Fejlfinding af problemer og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af denne LAMP1-APEX-sonde biotinyleres proteiner på og nær lysosomalmembranen og beriges. I betragtning af den typiske lysosomdiameter på 100-1.200 nm giver denne metode fremragende intracellulær opløsning med en mærkningsradius på 10-20 nm. LAMP1 er et rigeligt lysosomalt membranprotein og en klassisk markør for lysosomer, der tjener som et fremragende agnprotein til lysosomal APEX-mærkning på det endogene ekspressionsniveau. Der findes dog også begrænsninger, når man bruger LAMP1 til at målrette lysosomer, da LAMP1 også er til stede i sene endosomer og ikke-nedbrydelige lysosomer35. De fleste lysosomale markører udtrykkes også i sene endosomer, som til sidst modnes til lysosomer. Alternative agnproteiner til at målrette lysosomer er LAMPTOR, LAMP2 og TMEM19235,36,37. Det er vigtigt at bemærke, at reaktive biotinradikaler ikke trænger ind i membranen. Derfor fanges de fleste lysosomale lumenproteiner ikke i denne LAMP1-APEX proteomics-metode. Lysosomale lumenproteiner kan opnås ved lysosomal isolering via den traditionelle gradientcentrifugeringsmetode eller lysosomal immunpurificering 4,38. Proteiner på den lysosomale membran kan imidlertid forstyrres under lysosomal isolering og miste informationen for forbigående og dynamiske lysosomale interaktioner. Derfor kan lysosomal nærhedsmærkning og lysosomal isolering kombineres for at opnå et komplet øjebliksbillede af lysosomale aktiviteter både udenfor og inde i lysosomer.
For at minimere variabilitet fra iPSC-neuronkultur skal neuronbelægningstætheden være konsistent på tværs af alle biologiske replikater og sammenligningsgrupper. De samme niveauer af neuronal modning og sundhed er også kritiske af denne grund. Under APEX-aktivering skal tilsætning af biotin-phenol ogH2O22til cellerne udføres ved forudgående blanding med varmt dyrkningsmedium og derefter tilsættes blandingen til cellerne efterfulgt af øjeblikkelig, blid omrystning for at sikre jævn fordeling. Anvendelsen afH2O2giver også anledning til bekymring over oxidativ stress og forstyrrelser i cellens dynamiske mikromiljø. Selvom der ikke blev fundet signifikante ændringer på proteinoverflodsniveauet, blev flere peptider modificeret med methioninoxidation iH2O2-behandledeversus kontrolneuroner22. Derfor er streng kontrol af H2O2-aktiveringstiden (1 min) afgørende for at minimere oxidativ stress og reducere diffusionen af biotinsky for at sikre en specifik mærkningsradius omkring agnproteinet.
For ikke-polariserede cellelinjer som HEK og U2OS kan celler høstes ved pelletering efter nærhedsmærkning for at fjerne supernatanten indeholdende frit biotin. Imidlertid skal neuroner høstes ved direkte at tilføje cellelysebuffer til pladen og skrabe i rør for at undgå neuritskader og prøvetab under pelletering. Tilstedeværelsen af frit biotin kan mætte streptavidinperlerne. Den fuldstændige fjernelse af frit biotin kan opnås ved flere vasker og inkubation med slukningsbuffer i neuroner og / eller proteinudfældning efter cellelyse. Da forskellige agnproteiner har forskellige ekspressionsniveauer, skal der udføres et prikblot-assay for hver ny APEX-sonde. Når det optimale forhold mellem perler og protein er bestemt, skal mængden af startprotein og perlevolumen være konsistent for alle replikater for den samme APEX-sonde. Når man sammenligner forskellige sonder, såsom LAMP1-APEX versus cytosolisk-APEX, anbefales det at bruge det samme volumen perler, men varierer mængden af startprotein for at afspejle de optimale perler / proteinforhold for forskellige APEX-sonder. For yderligere at reducere eksperimentelle variationer og øge gennemstrømningen kan stabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) udføres39. Multiplexed isobarisk mærkning kan også bruges til kemisk mærkning af peptider efter proteinfordøjelse via TMT / iTRAQ / DiLeu tags 20,40,41,42.
Nærhedsmærkning er blevet anvendt bredt til at fange det cellulære og molekylære mikromiljø i forskellige organismer43. Nærhedsmærkning står dog stadig over for mange tekniske udfordringer, såsom forurening fra streptavidinsignaler, brugen af hydrogenperoxid til enzymaktivering og tilstedeværelsen af endogene biotinylerede mitokondriecarboxylaser. Derfor kræver nærhedsmærkning proteomiske eksperimenter omhyggelig planlægning og kvalitetskontrol. For at hjælpe forskere med at fejlfinde deres nærhedsmærkningseksperiment giver vi en kort vejledning til almindelige problemer og løsninger i tabel 2. Senest blev der udviklet en spaltet nærhedsmærkningsmetode ved hjælp af thiol-spaltet biotin25. Biotinylerede proteiner kan derfor spaltes af perler ved hjælp af et reducerende reagens som TCEP uden behov for fordøjelse på perler. Denne spaltebare biotinmetode kan dramatisk reducere interferenssignaler fra streptavidin, endogent biotinylerede carboxylaser og uspecifik binding. Løbende bestræbelser vil anvende denne spaltbare biotinmetode til LAMP1-APEX proteomics for at forbedre mærkningsspecificitet og nøjagtighed. Nærhedsmærkningssonder kan også designes til at målrette mod andre subcellulære rum44. Mængden og typen af identificerede proteiner afhænger af agnproteinets art, dets intracellulære miljø og ekspressionsniveauet for nærhedsmærkningssonden. Denne endogene LAMP1-APEX proteomics-metode giver et værdifuldt værktøj til at studere den dynamiske lysosomale aktivitet i humane neuroner. Den detaljerede protokol- og metodeoptimering gælder også for andre nærhedsmærkningssonder og kemisk biotinylering, der tjener som en nyttig ressource for proteomics-samfundet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse understøttes af NIH-bevillingen (R01NS121608). A.M.F. anerkender ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship og Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi takker Michael Ward-laboratoriet ved National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) for molekylærbiologisk støtte og i3Neuron-teknologiudviklingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
