Summary
O artigo descreve o método de isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente dos rins de camundongos transgênicos expressando o vírus símio termolábil 40 e mitocôndrias fotoativáveis,excisadas por PhAM. Descrevemos o procedimento para isolamento de glomérulos de rins inteiros usando contas, etapas de digestão, semeadura e cultura de GECs-CD31 positivos.
Abstract
A disfunção das células endoteliais glomerulares (GEC) pode iniciar e contribuir para a quebra da barreira de filtração glomerular. O aumento do estresse oxidativo mitocondrial tem sido sugerido como um mecanismo que resulta em disfunção GEC na patogênese de algumas doenças glomerulares. Historicamente, o isolamento dos GECs dos modelos in vivo tem sido notoriamente desafiador devido às dificuldades em isolar culturas puras dos glomérulos. Os GECs têm requisitos complexos de crescimento in vitro e uma vida útil muito limitada. Aqui, descrevemos o procedimento de isolamento e cultura de GECs condicionalmente imortalizados com mitocôndrias fluorescentes, possibilitando o rastreamento de eventos de fissão e fusão mitocondriais. Os GECs foram isolados dos rins de um camundongo duplo transgênico expressando o TAg termolábil SV40 (do camundongo Immorto), promovendo condicionalmente a proliferação e suprimindo a diferenciação celular, e uma proteína fluorescente fotoconversível (Dendra2) em todas as mitocôndrias (do camundongo mitocôndrias fotoativáveis [PhAMexcised]). A linhagem celular estável gerada permite a diferenciação celular após a inativação do gene imortalizante SV40 TAg e a fotoativação de um subconjunto de mitocôndrias, causando uma mudança na fluorescência do verde para o vermelho. O uso de mitoDendra2-GECs permite imagens ao vivo dos eventos de distribuição, fusão e fissão das mitocôndrias fluorescentes sem corar as células.
Introduction
O glomérulo é crítico para a filtração sanguínea, restringindo a passagem de moléculas grandes através da barreira de filtração glomerular 1,2. O glomérulo contém quatro tipos de células: células epiteliais parietais, podócitos (células epiteliais viscerais), células endoteliais glomerulares (GEC) e células mesangiais3. O endotélio glomerular é caracterizado por uma estrutura vascular única, de acordo com a presença de fenestras necessárias para grandes volumes de filtração4. A superfície apical do endotélio glomerular é coberta com uma camada de glicocálice carregada negativamente e uma camada chamada camada superficial endotelial que cria um espaço entre o endotélio e o sangue. Essa estrutura proporciona alta seletividade de carga, restringindo a passagem de moléculas carregadas negativamente, como a albumina, e prevenindo a adesão de leucócitos e plaquetas5.
Os GECs são muito sensíveis a alterações metabólicas, como a hiperglicemia associada ao meio diabético. De fato, o diabetes leva ao aumento da circulação de substâncias nocivas, à saturação das vias metabólicas da glicose e à perturbação do equilíbrio redox celular 3,6. Além disso, o aumento das espécies reativas de oxigênio induz disfunção mitocondrial, o que afeta a função endotelial7.
O objetivo geral do protocolo atual é isolar células endoteliais glomerulares imortalizadas com características mitocondriais fluorescentes. De fato, a cultura celular de GECs primários tem um ciclo proliferativo limitado e senescência precoce8. Além disso, a presença de mitocôndrias fluorescentes ajuda a examinar eventos de fissão e fusão em resposta à hiperglicemia ou a qualquer outro tratamento. Como método alternativo, outros laboratórios utilizaram o h-TERT para imortalizar células in vitro9.
O método aqui descrito permite o isolamento de células endoteliais mitoDendra2 imortalizadas condicionalmente de animais de 4 a 6 semanas de idade (Figura 1). Este protocolo detalhado descreve o uso de camundongos transgênicos (H-2K b-tsA58) abrigando o vírus símio 40 grande antígeno tumoral (SV40 TAg) gene10,11 para a geração de células termolábeis condicionalmente imortalizadas. O produto do gene tsA58 TAg é funcional à temperatura permissiva de 33 °C sob o controle do promotor de flanco induzível de 5' do gene H-2Kb do camundongo, que é aumentado acima dos níveis basais após a exposição ao interferon gama (IFNγ), mantendo, portanto, o fenótipo de proliferação condicional12. O H-2Kb é rapidamente degradado à temperatura não permissiva de 37 °C na ausência de IFNγ, removendo a função imortalizante do tsA58Tag nas células e permitindo que as células desenvolvam um fenótipo mais diferenciado13,14,15. O cruzamento opcional de camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com camundongos PhAM, que expressam uma Dendra2-verde específica para mitocôndrias (subunidade VIII da citocromo c oxidase), permite a detecção ao vivo de mitocôndrias fluorescentes16. A fluorescência verde Dendra2 muda para fluorescência vermelha após a exposição a um laser de 405 nm16. Quando as mitocôndrias se fundem após a fotocomutação, formam formas alongadas que aparecem amarelas pela troca de material verde e amarelo ou aparecem vermelhas quando sofrem fissão 7,17. Os mitoDendra2-GECs são uma ótima ferramenta para estudar as respostas celulares das mitocôndrias GEC a diferentes estímulos.
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Protocol
Todos os procedimentos animais descritos aqui foram aprovados pela IACUC na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai. Usamos três camundongos machos (camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com mitocôndrias fotoativáveis [PhAM]) comprados do laboratório Jackson e mantidos em uma dieta normal de ração.
1. Condições de trabalho e preparação
- Limpe o espaço de trabalho dentro do exaustor de fluxo laminar usando 70% de etanol e luz UV-C.
- Prepare os amortecedores de lavagem do talão. Fazer tampão 1 usando fosfato de sódio 0,1 M em pH 7,4-8,0, tampão 2 usando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio suplementado com 0,1% de antígeno sérico bovino (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 e tampão-3 usando 0,2 M Tris com 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Concentrador de partículas magnéticas
- Preparação de contas magnéticas
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture suavemente 200 μL de esferas magnéticas (4 x 108 contas) com 200 μL de tampão-1.
NOTA: Prepare 200 μL de grânulos magnéticos por rato 1 dia antes da colheita de tecidos. As contas serão usadas para colher os glomérulos. - Coloque o tubo em um concentrador de partículas magnéticas por 1 min e, em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Remova o tubo do ímã e ressuspenda as contas lavadas em 200 μL de buffer-1.
- Coloque o tubo que contém as contas magnéticas no concentrador de partículas magnéticas durante 1 min e aspirar suavemente o sobrenadante.
- Inative os grupos tosil livre lavando as contas magnéticas 2x, 5 min cada, usando 200 μL de buffer-2, colocando o tubo no concentrador de partículas magnéticas e descartando o buffer.
- Incubar as esferas magnéticas em 200 μL de tampão-3 durante 24 h a 4 °C, ou durante 4 h a 37 °C, para inactivar os restantes grupos tosil livres. Coloque o tubo no concentrador magnético por 1 min, aspirar suavemente o sobrenadante e descartá-lo.
- Lavar as contas magnéticas 1x com 200 μL de tampão-2 durante 5 min a 4 °C. Coloque o tubo de volta no concentrador magnético por 1 min e aspirar suavemente o sobrenadante. Retire o tubo do concentrador magnético e ressuspenda as contas magnéticas em 200 μL de tampão 2 para obter 4 x 108 contas/mL.
NOTA: Nesta fase, é possível deixar as contas a 4 °C por até 15 dias.
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture suavemente 200 μL de esferas magnéticas (4 x 108 contas) com 200 μL de tampão-1.
3. Isolamento das células glomerulares renais do rato
- Preparar o material de perfusão: seringa de 30 ml, agulha de borboleta de 25 G. Prepare o material de isolamento: prato estéril de 10 cm, bisturi, concentrador de partículas magnéticas, filtro celular de 40 μm, filtro de célula de 100 μm.
- Prepare 100 mL de 1x solução salina balanceada de Hank (HBSS) suplementada com antibióticos a 1% e ajuste o pH para 7,35. Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm e mantenha-a sob o capô para evitar a contaminação.
- Misture 200 μL de grânulos magnéticos da etapa 2.1.6 com 20 mL de 1x HBSS.
NOTA: Para cada rato, serão necessários 200 μL de grânulos diluídos em 20 ml de HBSS 1x. - Preparar uma alíquota de 1 ml de colagenase tipo II (125 CDU/mg) a 1 mg/ml em 1x solução de HBSS, pH 7,35. Pré-aqueça o RPMI com meio FCS a 10% em banho-maria a 37 °C. Pré-aqueça o meio de cultura de células endoteliais a 37 °C (ver Tabela de Materiais para mais detalhes).
NOTA: O RPMI será usado para neutralizar a colagenase. - Pré-revestir dois poços de uma placa de 6 poços com 2 mL de colágeno IV de 10 μg/mL (1 mL/poço) por 45 min à temperatura ambiente. Lave a placa 3x com 1x PBS para remover o ácido acético usado para diluir o colágeno. Use as placas revestidas imediatamente ou armazene-as a 2-8 °C por até 4 semanas.
NOTA: Selar a(s) placa(s) com uma película transparente é preferível para evitar a secagem. O revestimento de colágeno facilita a fixação das células à placa. - Limpar e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos da Figura 2 utilizando etanol a 70% e, posteriormente, autoclavá-los por 30 min. Limpe o espaço de trabalho cirúrgico com etanol a 70%.
- Anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (10 mg/mL de cetamina e 1 mg/mL de xilazina). Para confirmar que o animal está totalmente anestesiado, verifique se há o reflexo de pinça do dedo do pé.
- Fixe as patas do mouse com agulhas de 19 G para mantê-lo no lugar em uma plataforma de dissecação. Limpe o tórax e o abdômen com etanol a 70% e abra o abdômen ao longo do tórax com uma tesoura a (Figura 2).
- Inserir uma agulha de borboleta no ventrículo esquerdo (Figura 3A) e injectar cerca de 100 μL da solução do talão (a partir do passo 1.2) para expandir a circulação sanguínea.
- Romper cuidadosamente a veia cava inferior abaixo dos rins com uma agulha de 19 G (Figura 3A). Continue a perfusão iniciada na etapa 3.9.
NOTA: Alternativamente, uma mini bomba pode ser usada na velocidade: 18.0+, tempo: 5 min. Uma boa perfusão é importante para colher um grande número de contas magnéticas portadoras de glomérulos. Este é um procedimento de não-sobrevivência / terminal. - Retirar suavemente o tecido adiposo com pinça e extirpar ambos os rins com tesoura cirúrgica fina c (Figura 2) e colocá-los em uma placa com 1 mL de 1x HBSS sobre gelo. Pice o rim com uma tesoura b (Figura 2) e, em seguida, com um bisturi estéril a pedaços pequenos de 1 mm, como mostra a Figura 3B.
- Em seguida, incubar o rim picado com 1 mL de colagenase tipo II a partir do passo 3.4 por 35 min a 37 °C com inclinação suave usando um agitador horizontal. O tecido deve ser completamente digerido após esta etapa, como mostra a Figura 3C.
- Adicione 4 mL de RPMI com FBS a 10% (a partir da etapa 3.4) para neutralizar a colagenase. Filtre o tecido digerido através de um filtro de células estéreis de 100 μm para um tubo de 50 ml. Use o fundo de um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL para agitar o tecido digerido contra o coador para permitir que os glomérulos passem.
- Enxaguar o filtro celular com 15 mL de 1x HBSS e, em seguida, centrifugar o fluxo a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente. Neste ponto, o pellet contém três camadas; as contas com glomérulos são visíveis na camada intermediária do tubo, a camada superior consiste em estruturas menores, como túbulos, e a camada inferior são detritos (Figura 3D).
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e a camada branca superior. O pelotão restante contém as contas que ostentam os glomérulos e detritos (Figura 3D). Ressuscite o pellet com 1,5 mL de 1x HBSS e transfira para um tubo de 2 mL.
- Colocar o tubo no concentrador magnético (Figura 3E), aspirar o sobrenadante e, em seguida, lavar as contas 2x com 1 mL de 1x HBSS; nesta fase, coloque 20 μL da suspensão celular em uma lâmina para verificar a presença de glomérulos ao microscópio (Figura 3F; um glomérulo [seta preta] e algumas contas [setas amarelas] na suspensão).
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, ressuspender o pellet em meio de crescimento de células endoteliais (Tabela de Materiais) e transferi-lo para um tubo limpo de 2 mL. Adicione 2 μL de IFNγ (100 U/mL) ao tubo e coloque as células em um poço de uma placa de 6 poços. Incubar as células a 33 °C.
- Após 3 dias de cultura, trocar cuidadosamente o meio pipetando 1 mL do meio e substituindo-o por 1 mL de meio fresco. Nesta fase, as células são heterogêneas com uma mistura de células glomerulares (Figura 4G).
NOTA: Na cultura de crescimento em crescimento, haverá uma mistura de células glomerulares e algumas esferas magnéticas (Figura 4G). Observe que todas as células devem mostrar mitocôndrias verdes e fluorescentes. - Após 7 dias de cultura, aspirar completamente o meio e substituí-lo por um meio fresco de 2 mL de crescimento de células endoteliais suplementado com IFNγ (100 U/mL). Nesta fase, as células começam a proliferar, mas ainda são heterogêneas (Figura 4A).
- Após 10 dias de cultura, quando as células atingirem ~80% de confluência, passar as células usando tripsina conforme descrito na etapa 5.1 e, em seguida, transferi-las para um frasco T25 revestido com colágeno IV.
- Após 1 semana (total ~21 dias de cultura), passar as células para um frasco de T75 revestido com colagénio IV.
4. Preparação de contas para isolamento de células endoteliais
- Comece revestindo as contas anti-rato de ovelhas com um anticorpo CD31 anti-ratode rato 3,18,19. Utilizar 10 μL de grânulos para cada balão T75.
- Lave 10 μL de grânulos 3x com 200 μL de 1x PBS suplementado com 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Coloque o tubo no ímã concentrador para pipetar o tampão de lavagem de cada vez.
- Ressuspender as esferas em 200 μL de PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Adicionar 4,8 μL de anticorpo CD31 anti-rato 7,18,19 no rato, colocar o tubo num agitador horizontal e misturar suavemente durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, manter o tubo a 4 °C durante a noite.
5. Isolando as células endoteliais glomerulares com esferas revestidas com CD31
- Adicionar 3 ml de tripsina a 0,25% a um balão de T75 e incubar as células a 37 °C durante 5 minutos. Neutralizar a tripsina com 3 mL de meio de crescimento endotelial, transferir as células para um tubo de 15 mL e, em seguida, centrifugar a 200 x g por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e lavar as células em 1 mL de PBS contendo 1% de BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
- Ressuspender o pellet em 200 μL de grânulos revestidos preparados na etapa 4 e adicionar 800 μL de PBS contendo 1% de BSA, 2 mM de EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células durante 45 min com agitação contínua a 37 °C, 5% de CO2.
- Coloque o tubo no concentrador magnético e lave as células 4x com 1x PBS contendo 1% de BSA, 2 mM de EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Ressuspender as células em 3 mL de meio de crescimento endotelial suplementado com 100 U/mL de IFNγ.
- Placa de 1,5 mL de células/poço em poços revestidos de colágeno IV em uma placa de 6 poços. Cultivar as células em condições permissivas a 33 °C.
NOTA: As células isoladas expressam o vírus símio 40 (SV40) grande antígeno T tsA58, permitindo a ativação da proliferação contínua a 33 °C (condição permissiva). - Após 4 dias em cultura, retirar 750 μL do meio e substituí-lo pelo mesmo volume de meio fresco suplementado com 100 U/mL de IFNγ.
- Após 10 dias a 14 dias de cultura, verificar se há colônias de GECs CD31 positivas em crescimento (Figura 4C) que expressam mitocôndrias fluorescentes usando um microscópio de epifluorescência com filtro de 488 nm.
- Após 21 dias de cultura, as células podem ter atingido 80%-90% de confluência; transferi-los para um balão T25. Após atingir a confluência, as células podem ser mantidas com meio de crescimento RPMI e FCS a 10%.
NOTA: Antes de atingir a confluência, as células podem parecer heterogêneas (Figura 4B). No entanto, uma vez que são confluentes, adquirem uma morfologia de paralelepípedos. - Nesta fase, as células podem ser criopreservadas. Ao atingir 80% de confluência, adicionar 3 mL de tripsina a 0,25% às células e incubá-las a 37 °C por 5 min. Neutralizar a tripsina com um volume igual de meio de crescimento suplementado com 10% de FBS.
- Centrífuga a 200 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 mL de meio de congelamento (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquotar as células em tubos criogênicos e armazená-las em temperatura de vapor de nitrogênio líquido.
6. Cultivando os mitoDendra2-GECs
- Descongelar as células da crioalíquota, a partir da etapa 5.10, em banho-maria a 37 °C e transferi-las para um tubo de 15 mL com 10 mL de meio de crescimento endotelial pré-aquecido.
- Centrifugar a suspensão a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Retirar o meio e transferir o pellet para o balão de cultura celular T25 cm2 revestido de colagénio IV com meio de crescimento de células endoteliais pré-aquecido suplementado com 100 U/ml de IFNγ e incubar a 33 °C.
- Mude o meio no dia seguinte. Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, geralmente após 5 dias, transfira-as para um frasco de cultura de células T75 cm2 .
- Para diferenciar as células para o fenótipo endotelial, transfira as células para condições não permissivas a 37 °C em meios de crescimento sem IFNγ.
7. Passaging de mitoDendra2-GECs
- Retirar o meio, lavar as células com PBS e adicionar 3 ml de solução quente de tripsina-EDTA a 0,25% (balão de T75 cm2 ), incubar a 37 °C durante 5 min.
- Quando as células estiverem descoladas, adicione 5 mL de meio de crescimento e pipeta para cima e para baixo. Centrifugar a suspensão a 200 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente e transferir as células para um novo balão ou placa revestida de colagénio IV.
NOTA: A passagem deve ser feita uma vez por semana na proporção de 1:4.
8. Caracterização de mitoDendra2-GECs
- Realizar coloração por imunofluorescência para CD31 em células diferenciadas 7,18,19,20 (Figura 4D). Use outros marcadores, como vWF e Isolectin-B4, bem como20.
- Para confirmar a especificidade mitocondrial do Dendra2, rotular as células com marcadores mitocondriais específicos, incubando as células em meio de crescimento contendo 100 nM de rastreador mitocondrial por 30 min a 37 °C, 5% de CO2.
- Retire o meio e lave as células suavemente com meio pré-aquecido sem vermelho de fenol para realizar imagens ao vivo.
NOTA: Alternativamente, as células podem ser fixadas usando fixadores de formaldeído (4%) por 30 minutos, seguido de lavagem várias vezes em PBS. As células fixas podem ser armazenadas a 4 °C em 1x PBS até a utilização. Uma confirmação com citometria de fluxo também é possível: células de rótulo com anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. Os GECs devem corar negativamente para marcadores de podócitos (sinaptopodina, Nphs1, Podxl), marcadores de células mesangiais (PDGFRβ, angiotensinogênio) e marcadores celulares tubulares (Aquaporina, Aminopeptidase-N). Esses marcadores servem como controles negativos. Devido à expressão de Dendra2 mitocondrial específica dessas células, evite usar o canal FITC.
9. Imagem de células vivas de alterações estruturais das mitocôndrias em resposta ao estresse oxidativo ou glicose elevada
- Placa 1 x 105 GECs em um prato de fundo de vidro de 35 mm revestido com colágeno IV usando meio de crescimento de células endoteliais (Tabela de Materiais). Após 24 h, mude para meio sem vermelho de fenol. As células têm mitocôndrias verdes e fluorescentes.
- Ajuste a câmara ambiental a 37 °C, 5% de umidade e 5% de CO2 1 h antes do início do experimento.
- Sob um microscópio confocal, use uma objetiva de 40x/1,2 W para ajustar o foco e selecionar a região de interesse. Incubar as células com 2mL de glicose de 5 mM ou 25 mM por 60 min.
- Expor as células a um laser de 405 nm (4% de potência do laser) para fotoconverter uma subpopulação de mitocôndrias de verde para vermelho (Figura 5A-B, D-E).
- Use o laser de 561 nm para excitar Dendra2 no estado não convertido para visualizar a fluorescência vermelha. Consulte o protocolo detalhado de comutação de fotos, conforme descrito anteriormente16. Os eventos de fusão aparecem como fluorescência amarela após vários minutos devido à fusão da matriz verde e da matriz vermelha (Figura 4C, F).
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Representative Results
Neste artigo, um protocolo detalhado para o isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes estáveis (mitoDendra2-GECs) é descrito (Figura 1). O uso de camundongos jovens de 6 a 10 semanas de idade é essencial para obter um número substancial de células saudáveis. Após 3 dias de cultura, as células começam a crescer lentamente a partir dos glomérulos isolados, como mostra a Figura 3G. Após 7 dias, as células são heterogêneas, apresentando outros tipos de células glomerulares, como podócitos, células epiteliais parietais e células mesangiais (Figura 4A). Após atingir 70% a 80% de confluência, outras células glomerulares foram removidas utilizando-se uma seleção positiva de células endoteliais com esferas magnéticas marcadas com CD31 (Figura 4B-C). Os mitoDendra2-GECs expressaram CD31 (Figura 4D) e foram negativos para o marcador podocitário como mostrado pela coloração negativa da sinaptopópode (Figura 4E-F).
A característica mitocondrial fluorescente nos mitoDendra2-GECs permite estudar a morfologia das mitocôndrias sob várias condições in vitro. Aqui, testamos o efeito da glicose elevada (25mM) sobre a estrutura mitocondrial de mitoDendra2-GECs (Figura 5D-F). Em comparação com as mitocôndrias alongadas visíveis em células sob glicose normal (5mM; Figura 5A-C), fragmentação ou fissão das mitocôndrias induzida por glicose elevada, observada por mitocôndrias proeminentes em forma de esferoide (Figura 5E). Além disso, usamos um laser de 405 nm para fotoconverter uma subpopulação selecionada de mitocôndrias em uma única mitoDendra2-GEC viva (Figura 5A,D). Na Figura 5B e na Figura 5E, é apresentada a foto-comutação bem-sucedida das mitocôndrias de verde (488nm) para vermelho (561 nm) na área selecionada. É importante ressaltar que permitiu testemunhar os eventos de fusão em mitoDendra2-GECs cultivados sob glicose normal, como pode ser observado pela fluorescência verde e vermelha mesclada amarela como resultado da fusão da matriz mitocondrial (Figura 5C). Em contraste, no mitoDendra2-GEC tratado com glicose elevada, as mitocôndrias estavam fragmentadas e estavam principalmente vermelhas (Figura 5F), sugerindo que, no período de tempo testado, os eventos de fissão/fusão foram retardados ou inibidos devido aos danos causados pelo tratamento com alta glicose, o que é consistente com relatos anteriores18,19.
Figura 1: Descrição representativa do isolamento murino do GEC. O diagrama representa as etapas significativas do isolamento do GEC, a partir da perfusão do coração de camundongos com contas magnéticas para isolar os glomérulos renais, a digestão da colagenase, a cultura de células glomerulares e, finalmente, a purificação do GEC usando contas revestidas com CD31. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Descrição da dissecção renal. Imagem representativa de todos os instrumentos cirúrgicos estéreis necessários para a dissecção. Tesouras (a) são necessárias para abrir a pele do rato, e um par separado de tesouras (b,c) são necessárias para isolar o rim. Pinças (d) e (e) são necessárias para segurar a pele. A pinça (f) é necessária para coletar o rim dissecado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Descrição da colheita dos glomérulos . (A) Perfundir o ventrículo esquerdo com a solução de esferas HBSS usando uma seringa de 20 mL. Perfurar a veia cava inferior com uma agulha de 19 G. (B) Após a perfusão, retire a gordura do rim e corte-a em pedaços de 1 mm. (C) Digerir o tecido com colagenase tipo II. (D) Após digestão e centrifugação, formam-se três camadas; as contas com os glomérulos estão na camada intermediária, como indicado pela seta preta. (E) Separe as contas isoladas que ostentam os glomérulos usando o concentrador magnético. (F) Imagem representativa de glomérulos recém-isolados. (G) Células em crescimento de glomérulos isolados após 3 dias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ensaio mitocondrial in vitro. (A) Células glomerulares após 3 dias de cultura. (B) GEC após 7 dias. (D) Purificação de GEC com contas marcadas com CD31. Imagem microscópica da coloração CD31. (E) GECs são negativos para sinaptopodina. (F) Podócitos corados com sinaptopodina (488 nm, fluorescência verde) como controle negativo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem microscópica da fusão mitocondrial fluorescente in vitro. As imagens foram obtidas com microscópio confocal com objetiva de água 40x. (A-B) A área selecionada (círculo vermelho) foi iluminada com uma linha de 405 nm (4% de potência do laser) para 300 iterações de branqueamento a uma velocidade de 6,3-12,61/pixel, conforme descrito anteriormente16. (A-C) Células em meios de crescimento contendo 5 mM de glicose; a fluorescência verde (488 nm) mostra mitocôndrias saudáveis. (B,E) As mitocôndrias foram fotocomutadas para o vermelho (567 nm). (C) A fluorescência amarela detecta um evento de fusão ativa de GEC tratado com glicose 5mM. (D) As células foram tratadas com glicose elevada de 25 mM por 30 min. A fluorescência verde mostra mitocôndrias fragmentadas e (E) uma porção que foi foto-comutada para vermelho. (F) A figura mostra um evento de fusão diminuído, como mostrado pela fluorescência amarela reduzida. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As mitocôndrias são críticas para o metabolismo celular, homeostase e respostas ao estresse, e sua disfunção está ligada a muitas doenças, incluindo doenças renais. As mitocôndrias têm papel na geração patológica de espécies reativas excessivas de oxigênio (EROs), na regulação dos níveis intracelulares de cálcio, nas vias de morte celular e na dinâmica citoesquelética21,22,23.
O isolamento de GECs murinos é um desafio devido ao seu pequeno número, tamanho, fatores matriciais e natureza interdependente com outras células glomerulares que são essenciais para sua sobrevivência. O presente artigo apresenta um protocolo detalhado para o isolamento GEC de camundongos. Especificamente, usamos camundongos transgênicos como uma ferramenta para obter linhagens celulares condicionalmente imortalizadas com alto potencial de proliferação. Os camundongos transgênicos, expressando o vírus símio 40 (SV40) grande antígeno T tsA58, permitem a ativação da proliferação contínua sob condições permissivas a 33 °C e foram aqui cruzados com os camundongos excisados PHAM expressando fluorescência mitocondrial específica. Os camundongos duplos transgênicos ofereceram uma excelente ferramenta para estudar a estrutura das mitocôndrias. De fato, camundongos excisados PHAM possuem Dendra2 verde específico mitocondrial (subunidade VIII da citocromo c oxidase), permitindo a detecção ao vivo de mitocôndrias fluorescentes e a observação de eventos de fissão e fusão através de foto-comutação verde-vermelho16.
O protocolo consiste em três etapas significativas: a extração de glomérulos usando contas, a proliferação de células glomerulares e a subsequente purificação do GEC usando contas CD31 uma vez que as células estão em cultura. O uso de apenas uma digestão com colagenase é suficiente para isolar as células glomerulares. Outros protocolos fazem uso de uma segunda digestão com DNAse e proteinase24. No entanto, notamos melhores rendimentos celulares com apenas uma etapa de digestão. A DNAse pode permanecer ativa e retardar a proliferação das células. Além disso, o GEC poderia ser isolado usando peneiramento diferencial como descrito anteriormente20, o que nem sempre é fácil quando se utilizam rins de camundongos.
É crucial autoclavar todas as ferramentas cirúrgicas antes de iniciar o isolamento dos rins e dos glomérulos para evitar a contaminação. Além disso, é importante filtrar e complementar as soluções com antibióticos para eliminar qualquer fonte de contaminantes. De fato, as infecções por micoplasma podem causar citopatologia que, consequentemente, interfere em todos os parâmetros medidos em cultura celular25.
O isolamento dos glomérulos depende da perfusão intracardíaca de contas. Certamente, a perfusão lenta com 20 mL de 1x contas contendo HBSS é essencial para colher um alto número de glomérulos. As contas ficarão presas nos glomérulos, o que facilita sua purificação usando um concentrador magnético. As contas podem ser preparadas e armazenadas a 4 °C por até 15 dias antes de serem usadas para facilitar o procedimento experimental.
Além disso, digerir glomérulos com agitação contínua é crucial para dissociar um bom número de glomérulos do rim. Por outro lado, o isolamento de GECs murinos é um desafio devido ao seu pequeno tamanho e à presença de outras células glomerulares. Portanto, o isolamento gradual dos glomérulos, o crescimento de todas as células glomerulares em cultura e o subsequente uso de esferas revestidas com CD31 para purificar as células endoteliais são vitais, especificamente para a obtenção de números mais significativos de GECs viáveis e condicionalmente proliferativos. No entanto, é necessária a validação da pureza das células com imunocoloração e citometria de fluxo.
Além disso, o protocolo descreve a caracterização do fenótipo GEC e o ensaio de fusão/fissão das mitocôndrias in vitro. Os mitoDendra2-GECs são uma excelente ferramenta para estudar as respostas celulares das mitocôndrias GEC a diferentes estímulos in vitro sem a necessidade de transfecção ou coloração.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Professor Cijiang He e ao Dr. Fu Jia por seus insights sobre o isolamento de células endoteliais de camundongos e agradecem ao Professor Mone Zaidi por fornecer aos camundongosexcisados PhAM e discussões valiosas. Os autores também gostariam de agradecer o CORE de Microscopia na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai e a equipe pela orientação que recebemos. Este trabalho foi apoiado por doações do subsídio R01DK097253 do National Institutes of Health e do subsídio CDMRP do Departamento de Defesa E01 W81XWH2010836 ao I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
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