Summary
通过多亚相交换（绰号OCTOPUS）实现的悬滴表面薄膜平衡允许通过将原始散装溶液与模拟的胃肠道液体进行顺序亚相交换来模拟消化条件。通过原位记录消化界面层的界面张力来监测模拟的体外消化。
Abstract
乳液目前正被用于封装和输送营养物质和药物，以解决不同的胃肠道疾病，如肥胖、营养强化、食物过敏和消化系统疾病。乳液提供所需功能的能力，即到达胃肠道内的特定部位，抑制/延缓脂解或促进消化率，最终取决于其在胃肠道中对酶降解的敏感性。在水包油乳液中，脂滴被界面层包围，乳化剂在其中稳定乳液并保护包封的化合物。实现乳液的定制消化率取决于其初始成分，但还需要监测这些界面层的演变，因为它们经历了胃肠道消化的不同阶段。通过多亚相交换实现的悬滴表面膜平衡允许通过应用定制的静态消解模型来模拟浸入油中的单个水滴中乳液的 体外 消解。通过原始液滴散装溶液与人工培养基的亚相交换来模拟通过胃肠道的运输，模拟胃肠道每个隔室/步骤的生理条件。界面张力的动态演变在整个模拟胃肠道消化过程中原 位 记录。在每个消化阶段（口腔、胃、小肠）后测量消化界面的机械性能，例如界面扩张弹性和粘度。可以调整每种消化介质的组成，以解释消化条件的特殊性，包括胃肠道病理和婴儿消化介质。确定了影响蛋白水解和脂肪分解的特定界面机制，为通过乳液的界面工程调节消化提供了工具。获得的结果可用于设计具有定制功能的新型食品基质，例如低过敏性、受控的能量摄入和降低消化率。
Introduction
了解脂肪的消化方式（涉及乳液消化）对于合理设计具有定制功能的产品非常重要1.脂肪消化的基质是乳液，因为脂肪在食用时通过机械作用并与口腔和胃中的生物表面活性剂混合而乳化。此外，人类消耗的大部分脂肪已经乳化（例如奶制品），对于婴儿或一些老年人来说，这是唯一的消费形式。因此，具有特定消化特性的乳液基产品的设计在营养学中非常重要1。此外，乳液可以封装和输送营养素、药物或亲脂性生物活性物质2 ，以解决不同的胃肠道疾病，如肥胖3、营养强化、食物过敏和消化系统疾病。在水包油乳液中，脂滴被蛋白质、表面活性剂、聚合物、颗粒和混合物等乳化剂的界面层包围4.乳化剂的作用是双重的：稳定乳液5 和保护/运输包封的化合物到特定部位。实现乳液的定制消化率取决于其初始组成，但还需要监测该界面在通过胃肠道的过程中的持续演变（图1）。
图 1：应用乳液的界面工程来解决一些主要的胃肠道疾病。 请点击此处查看此图的大图。
脂质消化最终是一个界面过程，因为它需要脂肪酶（胃或胰腺）通过界面层吸附到乳化脂滴的油水界面上，以到达并水解油中所含的甘油三酯成游离脂肪酸和单酰基甘油酯6。 图 2 对此进行了示意图。胃脂肪酶与胃中的胃蛋白酶和磷脂竞争油水界面（图2，胃消化）。然后，胰脂肪酶/大肠脂肪酶与胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶、磷脂、胆盐和小肠消化产物竞争。蛋白酶可以改变界面覆盖，防止或有利于脂肪酶吸附，而胆盐具有高度表面活性，并取代大部分剩余的乳化剂以促进脂肪酶吸附（图2，肠道消化）。最终，脂肪分解的速率和程度取决于初始/胃消化乳液的界面特性，例如厚度、分子间/分子内连接以及静电和空间位阻相互作用。因此，监测界面层在消化过程中的演变提供了一个实验平台，以确定影响脂肪酶吸附和脂质消化的界面机制和事件。
图 2：说明界面在胃肠道脂质消化中的作用的示意图。 胃蛋白酶水解改变胃期的界面组成，而胃脂肪酶水解甘油三酯。在小肠中，胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶进一步水解界面膜，而脂肪分解通过BS/脂肪酶的吸附，甘油三酯的水解以及脂解产物的解吸在BS胶束/复合物中溶解来进行。 请点击此处查看此图的大图。
格拉纳达大学（UGR）的悬垂滴落设备采用专利技术，即同轴双毛细管，可实现散装溶液7的亚相交换。保持垂滴的毛细管由两个同轴毛细管组成，这两个毛细管独立连接到双显微注射器的每个通道。每个微量注射器可以独立运行，允许通过通流7交换掉落的内容物。因此，亚相交换包括用内毛细管同时注入新溶液，以及使用相同的流速用外毛细管提取本体溶液。该过程允许更换本体溶液，而不会干扰界面区域或液滴的体积。该程序后来升级为多亚相交换，允许液滴本体溶液8的多达8次顺序亚相交换。这可以通过依次将散装溶液与模拟不同隔室（口腔、胃、小肠）的人工培养基交换，模拟悬浮在脂质介质中的单个水滴中的消化过程。整个设置如图 3所示，包括组件的详细信息。微量注射器中的注射器连接到八个通孔阀，每个通孔阀连接到装有人工消化液的微量离心管，其组件如图 2所示。
图 3：章鱼及其所有组件的一般视图。 CCD相机、显微镜、微定位器、热稳定细胞和双毛细管独立连接到双显微注射器，两个注射器连接到八个通孔阀。每个注射器与毛细管连接，四个带样品的微量离心管和一个放电。 请点击此处查看此图的大图。
图4A 显示了如何将每种人工消化液通过双毛细管的亚相交换注入垂液滴中。 图2 中详述的每种消化复合物可以同时/顺序应用，模拟通过胃肠道的通道。人工消化液含有不同的酶和生物表面活性剂，它们改变了初始乳化剂的界面张力，如图 4B所示。同样在UGR开发的DINATEN软件（见 材料表）实时记录了初始界面层在 体外消化时界面张力的演变。此外，在每个消化阶段之后，通过将体积/界面面积的周期性振荡施加到稳定的界面层上并记录界面张力的响应来计算界面层的膨胀弹性。振荡的周期/频率和幅度可以改变，使用软件CONTACTO进行图像处理可提供膨胀流变参数8。
图 4：消解曲线示例 。 （A）初始乳化剂层经受人工消化介质置于微量离心机中，通过将不同的溶液依次亚相交换到悬滴中。（B）初始乳化剂的界面张力（y轴）作为时间（x轴）的一般演变，因为它在 体外 被人工培养基中的各种酶/生物表面活性剂消化。与普通肠液的最终亚相交换通过溶解在混合胶束中测量消化脂质的解吸。 请点击此处查看此图的大图。
本研究介绍了旨在使用侧滴设备测量界面层体外消化的一般方案9.初始界面层依次暴露于模拟通过胃肠道的条件，如图2所示。通过微量离心管中包含的不同溶液的亚相交换将这些不同的消化介质注入悬滴中（图4A）。这些培养基的组成可以根据将要评估的胃肠道状况进行定制，即胃/肠蛋白水解/脂肪分解，从而可以测量累积效应和益处10。用于模拟每个隔室中消化过程的实验条件遵循INFOGEST发布的国际共识协议，详细说明了电解质和酶的pH和量11。基于悬滴的实验装置允许在整个模拟消解过程中原位记录界面张力。在每个消化步骤结束时计算界面层的膨胀流变性。通过这种方式，每种乳化剂都提供了一个消解曲线，说明消解界面的特性，如图4B所示。这允许提取有关其对消化过程不同阶段的敏感性或抵抗力的结论。一般来说，人工消化介质含有酸/碱性pH值，电解质，蛋白酶（胃和肠），脂肪酶（胃和肠），胆盐和磷脂，它们溶解在各自的消化液（胃或肠）中。图4B显示了乳化剂界面张力演变的一般特征，首先受到蛋白酶作用，然后是脂肪酶。通常，由于水解肽9，12的解吸，界面层的蛋白水解促进了界面张力的增加，而脂解由于胆盐和脂肪酶的吸附而导致界面张力的急剧降低13。与肠液的最终亚相交换耗尽未吸附/消化物质的本体溶液，并促进可溶性化合物的解吸和消化脂质在混合胶束中的溶解。这是通过记录的界面张力增加来量化的（图4B）。
总之，在悬滴中实施的实验设计以模拟单个液滴中的体外消化，允许测量当消化过程依次应用于初始界面层10时累积效应和协同作用。每种消化介质的组成可以很容易地调整，以解释消化条件的特殊性，包括胃肠道病理或婴儿消化介质14。然后，鉴定影响蛋白水解和脂肪分解的界面机制可用于通过乳液的界面工程调节消化。获得的结果可用于设计具有定制功能的新型食品基质，例如低过敏性、控制能量摄入和降低消化率15，16，17，18，19。
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Protocol
1. 表面科学实验中使用的所有玻璃器皿的清洁顺序
- 用稀释在水（10%）中的浓缩清洁溶液（见 材料表）擦洗玻璃器皿。
- 用一系列自来水、丙醇、蒸馏水和超纯水彻底冲洗。在机舱中干燥并存放在封闭的橱柜中直至使用。
2. 样品制备
- 根据INFOGEST标准化协议11，20 制备人工消化培养基（见 材料表）。有关详细信息，请参见表1，并包括对界面工作要求的小调整，以防止表面活性污染和样品稀释（ 1 ：10）10。
- 按照以下步骤制备乳化剂溶液。
- 准备0.01升（1公斤·L−1）乳化剂或乳化剂混合物（见 材料表）在初始缓冲液（表1）中，并在温和搅拌下保持过夜。
- 稀释至0.1公斤·L−1 （或根据需要）使接口饱和;在先前发表的报告21之后，在恒定界面区域吸附1小时后，界面张力达到假平台。
- 使用前保持轻度搅拌15分钟。
- 净化油相。
- 准备植物油（向日葵，橄榄，三油酸甘油酯等）的混合物。和偏硅酸镁树脂（见 材料表）在大烧杯中的比例为 2：1 w/w。在温和的机械搅拌下保持至少3小时。
- 在商用离心机中以8，000× g 在室温下将混合物离心30分钟（见 材料表）。
- 用注射器过滤器（0.2μm孔径）在真空下过滤油混合物（见 材料表）。储存在干净的琥珀色瓶中，密封并用氮气鼓泡直至使用。
3. 章鱼的校准和清洁
- 通过设置通过毛细管（阀门6/4）和外部出口（阀门8-蓝色）清洁注射器和所有阀门的顺序，用超纯水冲洗所有管道。通过按左侧对话框中的 清洁 按钮来执行此操作（补充图1A）。
- 通过形成水滴并实时测量5分钟来检查水在室温下的表面张力7 （补充图1B，C）。
- 将差分密度设置为空气-水 （0.9982 kg·L−1）在左侧对话框中， 补充图1B。
- 用0.002升清洁植物油填充干净的比色皿（光学玻璃），并将其放入恒温池的比色皿支架中（图3）。
- 设置恒温器并允许温度平衡在37°C。
- 检查室温下水油的界面张力7.
- 将差分密度设置为植物油-水（橄榄油：0.800 kg·L−1）（补充图1C）。
- 以0.5μL·s−1 的速率进样40μL，并每秒实时测量一次，直到进样结束。这是一个简单的动态过程（补充图1B，D）。
- 在数据手册中将界面张力绘制为液滴体积的函数。
- 检查液滴体积范围是否提供了与液滴体积无关的界面张力值。将界面面积绘制为液滴体积的函数。
- 按照以下步骤对包含两个步骤（补充图1B 和 补充图2A）的过程进行编程。
- 使用内部注射器，注入包含在此恒定界面张力范围内的体积。
- 将界面面积保持在步骤3.5.4中选择的值，并记录界面张力5分钟7。
4. 在 DINATEN 中为每个消化步骤编程一个实验过程
注意：有关工艺参数，请参见 补充图1B。
- 执行初始控制。
- 为了形成液滴，将 10 μL （±5 μL） 乳化剂溶液注入毛细管（阀门 6）（补充图 2A）。
- 记录在20mm 2（±10mm2）的恒定界面区域21处的吸附1小时（补充图2B）。
- 记录扩张流变学8 （补充图2C）。
- 将振荡幅度设置为 1.25 μL，周期 10 秒。
- 记录所选界面区域（步骤4.1.2）处的吸附10秒。
- 在不同的周期重复步骤4.1.3：5秒，20秒，50秒和100秒。
- 记录胃消化。
- 记录所选界面区域21 的吸附10秒。
- 与阀2中的液体（sSGF）和胃酶（表1）进行子相交换7（补充图2D）。
- 从阀门2填充左注射器。用左注射器在 5 μL·s−1 下将 125 μL 注入瓣膜 6 毛细管中。
- 用右注射器从毛细管中提取 125 μL，浓度为 5 μL·s−1。卸载右侧注射器以退出阀门 8。重复步骤4.2.2.1-4.2.2.2 10次，以确保完全交换。
- 在步骤4.1.2中记录所选界面区域21 处的吸附1小时（补充图2B）。
- 记录扩张流变学8 （补充图2C）。
- 将振荡幅度设置为 1.25 μL，周期 10 秒。
- 记录步骤4.1.2中所选界面区域的吸附10秒。在不同的周期重复：5秒，20秒，50秒，100秒。
- 记录肠道消化。
- 在步骤4.1.2中记录所选界面区域21 处的吸附10秒（补充图2B）。
- 与阀3中的液体（sSIF）和肠酶/胆盐/磷脂进行亚 相交换7（表1）（补充图2D）。
- 从阀门2填充左注射器。用左注射器在 5 μL·s−1 下将 125 μL 注入瓣膜 6 毛细管中。用右注射器从毛细管中提取 125 μL，浓度为 5 μL·s−1。
- 卸载右侧注射器以退出阀门 8。重复步骤4.3.2.1-4.3.2.2 10次，以确保完全交换。
- 记录步骤4.1.2中所选界面区域21 处的吸附1小时。
- 记录扩张流变学8 （补充图2C）。
- 将振荡幅度设置为 1.25 μL，周期 10 秒。
- 记录步骤4.1.2中所选界面区域的吸附10秒。
- 在不同的周期重复：5秒，20秒，50秒，100秒。
- 按照以下步骤记录解吸情况。
- 在步骤4.1.2中记录所选界面区域21 处的吸附10秒（补充图2B）。
- 在阀门5 （sSIF）中与液体进行子相交换7（表1， 补充图2D）。
- 从阀5填充左注射器。用左注射器在 5 μL·s−1 下将 125 μL 注入瓣膜 5 毛细管中。
- 用右注射器从毛细管中提取 125 μL，浓度为 5 μL·s−1。卸载右侧注射器以退出阀门 8。重复步骤4.4.2.1-4.4.2.2 10次，以确保完全交换。
- 在步骤4.1.2中记录所选界面区域21 处的吸附1小时（补充图2B）。
- 记录扩张流变学8 （补充图2C）。
- 保持 1.25 μL 的振幅，周期 10 秒。
- 记录步骤4.1.2中所选界面区域的吸附10秒。
- 在不同的周期重复步骤4.4.4：5秒，20秒，50秒，100秒。
5. 设置实验
- 用人工消化培养基填充微量离心管，并通过相应的管道将它们连接到相应的阀门。
- 通过清洁从阀门 2、阀门 3、阀门 4 和阀门 5 到外部出口（阀门 8）的管道，将管道填充到阀门 2-5 中（补充图 1A）。
- 通过从阀门 1 清洁到阀门 6 毛细管 5 次，将管道填充到阀门 1 中。
- 将毛细管放入油相中。用阀门1加载左注射器（初始溶液， 表1）。
- 开始依次处理步骤4.1-初始，步骤4.2-胃，步骤4.3-肠和步骤4.4-解吸，在每个过程结束时保存数据。
6. 使用图像处理软件 CONTACTO 8 计算膨胀流变参数
注：详见马尔多纳多-瓦尔德拉马等人8。
- 加载对应于给定频率和幅度的区域振荡的图像（补充图3A）。
- 按流变学（补充图3B）并获得膨胀参数（补充图3C）。
- 将结果复制粘贴到数据电子表格中。
7. 绘制实验结果
- 通过添加上一步时间的最后一个数据，重新计算消化过程每个步骤中的时间列。
- 绘制所用消解过程的每个步骤的界面张力与加法时间的关系图。
- 绘制每个步骤结束时获得的最终界面张力/膨胀弹性和粘度与消化阶段的关系：初始、胃消化、十二指肠消化和解吸。
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Representative Results
本节展示了使用章鱼测量的消化曲线的不同示例。模拟消解曲线匹配的一般外观如图 4B所示。界面张力通常在消解曲线中随时间表示。所考虑的不同阶段/消化步骤以不同的颜色表示。第一相形成初始层，对应于乳化剂或蛋白质/表面活性剂/聚合物的吸附相，具体取决于每种情况。然后，通过亚相交换将不同的消化液注入含有新培养基的本体溶液中。新的子相在初始乳化剂层的界面张力和每个消化步骤结束时测量的膨胀流变性中产生变化。消化过程最多可以包括八个消化步骤。
图5：胃消化概况示例 。 （A）人血清白蛋白的胃蛋白水解。消化培养基通过亚相交换与实验部分中详述的溶液在T = 37°C下施用。 蓝色：含蛋白质的初始缓冲液，红色：含胃蛋白酶的sSGF。经del Castillo-Santaella等人许可转载12。（B）柑橘果胶的胃脂肪分解。消化培养基通过亚相交换与实验部分中详述的溶液在T = 37°C下施用。 蓝色：含有柑橘果胶的初始缓冲液，黄色：含有胃脂肪酶的sSGF，灰色：sSGF。经Infantes-Garcia等人许可转载17。 请点击此处查看此图的大图。
图5 显示了乳化剂胃 消化 获得的一些实验结果。 在图5A中，人血清白蛋白（HSA）12 首先吸附到橄榄油 - 水界面上，降低界面张力，在1小时后达到平台。在此阶段结束时，在 0.1 Hz （10 s） 的频率（周期）下测量流变性。在第二步中，通过亚相交换加入带有胃蛋白酶的sSGF。这包括用一个注射器引入一个体积，同时用另一个注射器提取相同的体积。这样，液滴的面积不会改变，从而保持了油水界面处不可逆吸附的组分。交换重复10-15次。在与sSGF和胃蛋白酶的亚相交换期间，由于蛋白质的水解，界面张力增加，从而稀释了初始蛋白质层（图5A）。 在图5B中，柑橘果胶（CP）17吸附到甘油三酯油-水上40分钟，然后在0.1Hz 下进行膨胀流变。在第二步中，将带有胃脂肪酶的sSGF注射到大部分滴剂中;与蛋白水解相反，脂肪分解导致脂肪酶的吸附和脂肪酸的形成，脂肪酸保留在界面上，从而降低界面张力。解吸阶段是第三步，它评估亲水性的产生或脂解亲脂产物的溶解。 图5B 显示，与sSGF的亚相交换提供了界面张力的零响应。这可以解释为亲脂性消化产物的产生，其不可逆地吸附并且不溶解，仍然锚定在界面上。胃期缺乏胆盐是缺乏溶解的原因。脂肪分解的程度可以通过达到的界面张力值进行定性分析。
图 6：肠道消化概况示例 。 （A）37°C下胆盐（黑色方块），脂肪酶（灰色三角形）和脂肪酶+胆汁盐（橙色菱形）在sSIF中的吸附 - 解吸曲线。 经Macierzanka等人许可转载13。（B）胆盐+脂肪酶吸附到先前吸附的F68（深绿色）和F127（浅绿色）上，在sSIF中吸附胆盐（黄色）。解吸：在胆盐（橙色）、F68（深紫色）和F127（浅紫色）上与sSIF进行亚相交换。经Torcello-Gómez等人许可转载19。 请点击此处查看此图的大图。
图6显示了乳化剂肠道消化获得的实验结果。与胃消化相反，小肠中胆盐的存在在与sSIF的亚相交换和散装溶液的消耗时提供不同的解吸曲线。图6A显示了纯胆盐、纯脂肪酶和混合脂肪酶/胆汁盐8，9，10，13获得的解吸曲线。胆盐可逆地吸附到油水界面上，因此，它们在与sSIF的亚相交换时完全解吸，如界面张力的增加以达到裸油水界面的值8，13所示。相反，脂肪酶不可逆地吸附，如sSIF亚相交换后的界面张力恒定值所示。脂肪酶和胆盐混合物提供了中间解吸曲线，该曲线通过sSIF亚相交换时界面张力的有限增加到中间值来量化。剩余的界面层含有脂肪酶和游离脂肪酸。胆盐可能从界面解吸并溶解脂解中形成的一些游离脂肪酸。图6B显示了两种多聚龙体（F127和F6819）脂解时界面张力的演变。图6B显示了由于脂肪酶和胆盐的吸附以及游离脂肪酸在油水界面处先前形成的F68和F127界面膜上的产生而导致界面张力急剧降低。解吸步骤显示了与sSIF的亚相交换引起的界面张力增加，从而量化了脂解产物的溶解。
图 7：完整的动态胃肠道 消化曲线示例。 （A）AS-48吸附膜在空气-水界面的 体外 消化曲线。消化培养基通过亚相交换与实验部分中详述的溶液在T = 37°C下施用。 对照：AS-48的初始缓冲液，胃蛋白酶：sSGF与胃蛋白酶，胰蛋白酶：sSIF与胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶，解吸：sSIF。经del Castillo-Santaella等人许可转载18。（B）人血清和牛血清白蛋白在橄榄油-水界面吸附膜的 体外 消化曲线。消化培养基通过亚相交换与实验部分中详述的溶液在T = 37°C下施用。 对照：用HSA / BSA的初始缓冲液，胃蛋白酶：sSGF与胃蛋白酶，胰蛋白酶：sSIF与胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶，脂解：sSIF与脂肪酶和胆汁盐，解吸：sSIF。绘制曲线是偏差为 <5% 的代表性实验。 请点击此处查看此图的大图。
图 7 显示了完整的模拟消解配置文件的示例。图7A显示了吸附在空气-水界面18处的食品生物防腐剂AS-48的消化曲线。消化过程旨在专注于这种肽的蛋白水解，而不需要油的脂解，位于空气 - 水界面。因此，图7A中的模拟消化包括五个步骤：对照/初始膜、胃蛋白酶溶解、胰蛋白酶分解和解吸。实验结果表明，由于表面张力保持不变，该细菌素对胃蛋白酶和胰蛋白酶水解均有抵抗力。因此，AS-48被认为是一种耐体外消化的良好食品生物防腐剂。图7B比较了在油水界面22上吸附的人和牛血清白蛋白吸附层的体外消化曲线。该模拟旨在模拟由这两种蛋白质23稳定的乳液的消化率，并评估姜黄素4的包封。因此，定制模拟消化包括五个步骤：对照/初始、胃蛋白酶溶解、胰蛋白酶溶解、脂解和解吸。实验结果显示胃蛋白酶消化后界面张力增加，表明胃蛋白酶溶解的敏感性增加。这归因于牛变异体在吸附时展开增加，暴露了胃蛋白酶敏感的部位。然后，胰蛋白酶溶解和脂肪分解提供了完全相似的消化曲线（图7B）。
图8：胃肠道消化的最终值示例。 （A）界面张力，（B）膨胀弹性，（C）橄榄油-水界面处β-乳球蛋白吸附膜体 外 消解的膨胀粘度。在每一步中平衡消化界面后，在1 Hz、0.1 Hz和0.01 Hz处测量膨胀参数。消化培养基通过亚相交换与实验部分中详述的溶液在T = 37°C下施用。 对照：蛋白质初始缓冲液，胃蛋白酶：sSGF与胃蛋白酶，胰蛋白酶：sSIF与胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶，脂解：sSIF与脂肪酶和胆汁盐，解吸：sSIF。 请点击此处查看此图的大图。
通常，为了评估和比较不同消化界面层的性质，绘制了在设计消解过程中考虑的每个步骤的最终界面张力和为消化界面获得的膨胀弹性/粘度。图8显示了在1 Hz、0.1 Hz和0.01 Hz频率下测量的界面张力（图8A）、膨胀弹性（图8B）和膨胀粘度（图8C）。绘制的值是在吸附在油水界面处的β-乳球蛋白的每个消化步骤后获得的16.图8A显示蛋白水解（胃蛋白酶和胰蛋白酶）使界面张力略有增加，而脂肪分解降低该值，解吸再次增加。关于膨胀弹性，蛋白质在油水界面形成弹性和相互连接的膜。胆盐的存在会产生具有低弹性的高度流动性和流动性界面膜。最后，剩余的脂解产物在解吸后不能形成粘性弹性膜。膨胀弹性随着振荡频率而略有增加（图8B）。最后，图8C所示界面膜的膨胀粘度只能在较低频率下检测到，并且可以检测界面处是否存在多层、聚集体或其他耗散结构。将β-乳球蛋白的消化曲线与脉冲处理的β-乳球蛋白的消化谱进行比较，显示经受此类物理处理的蛋白质的消化率有所提高16。
| 初始缓冲区 | 0.00113 mol L-1 NaH2PO4， pH 7.0 | ||
| 简化模拟胃液 （sSGF） | [NaH2PO4] = 0.00113 mol L-1， [NaCl] = 0.15 mol L-1， pH 3.0 | ||
| 简化模拟肠液 （sSIF） | [NaH2PO4] =0.00113 mol L-1， [NaCl] = 0.15 mol L-1， [CaCl2] = 0.003 mol L-1， pH 7.0 | ||
| 胃酶 | 胃蛋白酶 （50 ∙ 10 3 U L-1），胃脂肪酶 （0.5 ∙ 103 U L-1） | ||
| 肠道酶 | 胰蛋白酶 （2.5 ∙ 10 3 U L-1）、胰凝乳蛋白酶 （0.625 ∙ 10 3 U L-1）、胰脂肪酶 （50∙ 10 3 U L-1）、共脂肪酶 （150 ∙ 10 3 U L-1） | ||
| 胆盐混合物 | 0.01摩尔L-1M .胆盐混合物：牛磺胆酸钠和脱氧胆酸钠（50/50）或牛磺胆酸钠和乙二氧胆酸钠（50/50） | ||
表1：人工消化培养基的组成。
补充图1：计算机接口DINATEN的基本操作。 （A）计算机接口DINATEN的一般外观;左侧对话框显示连接到所有阀门的两个注射器，并控制注射/提取和清洁。中央对话框包含命令、放置图像和包含结果的表格。（B）实时计算提供自动测量作为时间的函数。（C） 左命令包括差分密度。（D） 简单的动态过程控制进样/提取体积、速率和捕获时间。 请点击此处下载此文件。
补充图2：用于编程每个消化步骤（过程）的接口。 （A）用固定体积和固定注射速率的左注射器滴剂形成。（B）恒定界面面积的吸附：控制。（C） 具有固定振幅、周期和周期数的流变学。（D）亚相交换：用两个注射器以相同的速率注射和提取。 请点击此处下载此文件。
补充图3：使用图像分析软件CONTACTO计算膨胀参数。 （A）分析与固定周期振荡相对应的图像。（B）计算所选图像界面层的膨胀参数。（C） 显示扩张分析结果的对话框。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文介绍了使用悬垂滴剂设备测量界面层体外消化的通用方案。该方案可以通过调整消化缓冲液的组成来调整实验的具体要求，消化缓冲液基于INFOGEST11，20协调方案，以便于与文献进行比较。消化酶和生物表面活性剂可以单独、顺序或一起添加。后一种选择需要小心进行，因为界面层的饱和度会通过提供非常低的界面张力来阻碍不同的现象，并可能导致液滴下降。为了能够分析每种消化成分的效果，依次以不同的浓度添加不同的消化酶。通过这种方式，可以分析和系统化每个组件的效果，并通过顺序添加来评估协同作用。此外，为了防止液滴掉落，一些浓度被稀释9。获得的结果不能直接外推到乳化体系中，因为条件会进行调整以考虑简化的系统。然而，界面张力的演变显示了随着界面层被消化而界面覆盖的演变10。同样，随着消解过程的进行，膨胀流变学的演变提供了有关界面机械性能的一些信息9。这些结果包含有用的信息，可以进行调整和仔细解释以应用于乳化体系。
悬垂滴落设备可以评估专门发生在界面层的 原位 事件，如图 2所示。首先，形成初始界面层，代表单个乳液液滴。该初始层经受不同的消化条件，并且由于水相中存在不同的组分而依次改变其组成。此外，脂肪酶必须克服该界面层才能进入油相并水解脂肪。这些界面事件必须在最初创建的相同界面层上进行评估。对乳液进行 体外 消化将允许在不同时间取样并评估乳液在消解时的变化（液滴大小、zeta 电位），但不允许对每个乳液液滴周围的界面层进行 原位 评估。因此，通过多亚相交换实现的悬滴设备包括一种互补技术，以专注于乳液的界面工程14。
这种方法的第一个局限性恰恰与各种产品的界面层饱和度有关，需要稀释以防止液滴掉落。另一个实验问题是所有人造介质的脱气，以避免气泡成核，这也可能导致液滴从毛细管中分离。在外推乳化体系时，与乳化体系相比，考虑更大的油水比也很重要。最后，尽管膨胀流变学包含界面层内由消化酶形成和破坏的分子间和分子内缔合的信息，但很难解释和推断乳液稳定性。总之，使用多亚相交换装置实现的侧滴是补充乳液12体外消化研究的有用设备，这些研究遵循液滴尺寸分布的演变和蛋白质酶解的zeta电位22。改变消化道以解释性别变化，婴儿消化或消化问题包括实验程序的未来应用。
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Disclosures
作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报道的工作。
Acknowledgments
这项研究由项目RTI2018-101309-B-C21和PID2020-631-116615RAI00资助，由MCIN/AEI/10.13039/501100011033和“ERDF创造欧洲的方式”资助。这项工作（部分）得到了格拉纳达大学（西班牙）生物胶体和流体物理小组（参考PAI-FQM115）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | C4129 | Enzyme |
| Beta-lactoglobulin | Sigma-Aldrich | L0130 | Emulsfier |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Emulsfier |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Electrolyte |
| Centrifuge | Kronton instruments | Centrikon T-124 | For separating oil and resins |
| Citrus pectin | Sigma-Aldrich | P9135 | Emulsfier |
| co-lipase FROM PORCINE PANCREAS | Sigma | C3028 | Enzyme |
| CONTACTO | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| DINATEN | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| Gastric lipase | Lipolytech | RGE15-1G | Enzyme |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 70024-90-7 | Emulsifier |
| INFOGEST | http://www.proteomics.ch/IVD/ | ||
| Lipase from porcine pancreas, type II | Sigma-Aldrich | L33126 | Enzyme |
| Magnesium metasilicate resins | Fluka | 1343-88-0 | Resins to purify oil |
| Micro 90 | International products | M-9051-04 | Cleaner |
| NaCl | Sigma | 7647-14-5 | Electrolyte |
| NaH2PO4 | Scharlau | 10049-21-5 | To prepare buffer |
| OCTOPUS | Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) | Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange | |
| Olive oil | Sigma-Aldrich | 1514 | oil |
| Pancreatic from porcine pancreas | Sigma | P7545-25 g | Enzyme |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | Enzyme |
| Pluronic F127 | Sigma | P2443 | Emulsifier |
| Pluronic F68 | Sigma | P1300 | Emulsfier |
| Sodium deoxycholate | Sigma | Bile salts | |
| Sodium glycodeoxycholate | Sigma | C9910 | Bile salts |
| Sodium taurocholate | Sigma | 86339 | Bile salts |
| Syringe Filter | Millex-DP | SLGP033R | Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | Enzyme |
References
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