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Biochemistry

시험관 내 시뮬레이션된 위장관액의 다중 하위 단계 교환 을 통한 단일 액적의 에멀젼 소화

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

OCTOPUS라는 별명을 가진 다중 하위 단계 교환으로 구현된 펜던트 드롭 표면 필름 균형은 원래 벌크 용액과 시뮬레이션된 위장관액의 순차적 하위 단계 교환을 통해 소화 상태를 모방할 수 있습니다. 시뮬레이션된 체외 소화는 소화된 계면층의 계면 장력을 현장에서 기록하여 모니터링됩니다.

Abstract

에멀젼은 현재 비만, 영양 강화, 음식 알레르기 및 소화기 질환과 같은 다양한 위장 상태를 해결하기 위해 영양소와 약물을 캡슐화하고 전달하는 데 사용되고 있습니다. 에멀젼이 원하는 기능, 즉 위장관 내의 특정 부위에 도달하거나, 지방 분해를 억제 / 지연하거나, 소화율을 촉진하는 능력은 궁극적으로 위장관의 효소 분해에 대한 감수성에 달려 있습니다. 수중유 에멀젼에서 지질 방울은 계면 층으로 둘러싸여 있으며, 여기서 유화제는 에멀젼을 안정화하고 캡슐화된 화합물을 보호합니다. 에멀젼의 맞춤형 소화율을 달성하는 것은 초기 구성에 따라 다르지만 위장 소화의 여러 단계에 따라 계면층의 진화를 모니터링해야 합니다. 다중 하위 상 교환으로 구현된 펜던트 드롭 표면 필름 저울은 맞춤형 정적 분해 모델을 적용하여 오일에 잠긴 단일 수성 액적에서 에멀 젼의 체외 소화를 시뮬레이션할 수 있습니다. 위장관을 통한 통과는 위장관의 각 구획 / 단계의 생리적 조건을 모방하여 원래의 액적 벌크 용액과 인공 배지의 하위 단계 교환에 의해 모방됩니다. 계면 장력의 동적 진화는 시뮬레이션된 전체 위장 소화에 걸쳐 현장에서 기록됩니다. 계면 확장 탄성 및 점도와 같은 소화 된 계면의 기계적 특성은 각 소화 단계 (구강, 위, 소장) 후에 측정됩니다. 각 소화기 매체의 구성은 위장 병리 및 유아 소화기 매체를 포함한 소화 상태의 특수성을 설명하도록 조정할 수 있습니다. 단백질 분해 및 지방 분해에 영향을 미치는 특정 계면 메커니즘이 확인되어 에멀젼의 계면 공학에 의해 소화를 조절하는 도구를 제공합니다. 얻은 결과는 낮은 알레르기 성, 제어 된 에너지 섭취 및 소화율 감소와 같은 맞춤형 기능을 갖춘 새로운 식품 매트릭스를 설계하기 위해 조작 될 수 있습니다.

Introduction

에멀젼 소화와 관련된 지방이 어떻게 소화되는지 이해하는 것은 맞춤형 기능성을 갖춘 제품을 합리적으로 설계하는 데 중요합니다1. 지방 소화를위한 기질은 기계적 작용에 의해 소비되고 입과 위장의 생체 계면 활성제와 혼합되면 지방이 유화되기 때문에 에멀젼입니다. 또한 인간이 소비하는 대부분의 지방은 이미 유화 (예 : 유제품)이며, 유아 또는 일부 노인의 경우 이것이 유일한 소비 형태입니다. 따라서 특정 소화 프로파일을 가진 에멀젼 기반 제품의 설계는 영양에서 매우 중요합니다1. 또한 에멀젼은 영양소, 약물 또는 친유성 생리 활성 물질2 을 캡슐화하고 전달하여 비만3, 영양 강화, 음식 알레르기 및 소화기 질환과 같은 다양한 위장 상태를 해결할 수 있습니다. 수중유 에멀젼에서, 지질 방울은 단백질, 계면활성제, 중합체, 입자 및 혼합물과 같은 유화제의 계면 층으로둘러싸여 있다4. 유화제의 역할은 두 가지입니다: 에멀젼5을안정화시키고 캡슐화 된 화합물을 특정 부위로 보호/운반합니다. 에멀젼의 맞춤형 소화율을 달성하는 것은 초기 구성에 따라 다르지만 위장관을 통과하는 동안 이 인터페이스의 지속적인 진화를 모니터링해야 합니다(그림 1).

Figure 1
그림 1: 주요 위장 상태를 해결하기 위해 에멀젼의 계면 공학을 적용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

지질 소화는 오일에 포함 된 트리글리 세라이드에 도달하고 가수 분해하기 위해 계면 층을 통해 유화 된 지질 방울의 오일-물 계면에 리파아제 (위 또는 췌장)를 흡착해야하기 때문에 궁극적으로 계면 과정입니다6. 이것은 그림 2에 도식화되어 있습니다. 위 리파아제는 기름-물 계면을 위해 위장의 펩신 및 인지질과 경쟁합니다 (그림 2, 위 소화). 그런 다음 췌장 리파아제/콜리파아제는 트립신/키모트립신, 인지질, 담즙염 및 소장의 소화 산물과 경쟁합니다. 프로테아제는 계면 범위를 변경하여 리파아제 흡착을 방지하거나 선호할 수 있는 반면, 담즙염은 표면 활성이 높고 나머지 유화제의 대부분을 대체하여 리파아제 흡착을 촉진합니다(그림 2, 장 소화). 결국, 지방 분해의 속도와 정도는 두께, 분자 간 / 분자 내 연결, 정전기 및 입체 상호 작용과 같은 초기 / 위 소화 에멀젼의 계면 특성에 따라 달라집니다. 따라서, 소화될 때 계면층의 진화를 모니터링하는 것은 리파아제 흡착 및 따라서 지질 소화에 영향을 미치는 계면 메커니즘 및 이벤트를 식별하는 실험 플랫폼을 제공합니다.

Figure 2
그림 2: 위장관 지질 소화에서 인터페이스의 역할을 보여주는 개략도. 펩신 가수 분해는 위상에서 계면 구성을 변화시키는 반면, 위 리파아제는 트리글리 세라이드를 가수 분해합니다. 소장에서 트립신/키모트립신은 계면 필름을 추가로 가수분해하는 반면, 지방분해는 BS/리파아제의 흡착, 트리글리세리드의 가수분해, BS 미셀/복합체의 가용화에 의한 지방분해 생성물의 탈착에 의해 진행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그라나다 대학 (UGR)의 펜던트 드롭 장비는 벌크 용액7의 아상 교환을 가능하게하는 특허 기술 인 동축 이중 모세관으로 구현됩니다. 펜던트 방울을 보유하는 모세관은 이중 미세 주입기의 각 채널에 독립적으로 연결된 두 개의 동축 모세관의 배열로 구성됩니다. 각각의 마이크로인젝터는 독립적으로 작동할 수 있어, 쓰루플로우(7)에 의해 적하된 내용물의 교환을 허용한다. 따라서, 하위 단계 교환은 내부 모세관과 함께 새로운 용액의 동시 주입과 동일한 유속을 사용하여 외부 모세관과 벌크 용액의 추출로 이루어진다. 이 공정은 계면 영역이나 액적의 부피를 방해하지 않고 벌크 용액을 대체 할 수있게합니다. 이 절차는 나중에 다중 하위 상 교환으로 업그레이드되어 액적 벌크 용액 8의 최대8 개의 순차적 하위 상 교환이 가능합니다. 이를 통해 벌크 용액을 다른 구획(입, 위, 소장)을 모방한 인공 배지와 순차적으로 교환하여 지질 매체에 현탁된 단일 수성 방울에서 소화 과정을 시뮬레이션할 수 있습니다. 전체 설정은 구성 요소의 세부 정보를 포함하여 그림 3에 나와 있습니다. 마이크로 인젝터의 주사기는 8 개의 비아 밸브에 연결되며, 각각은 그림 2에 설명 된 구성 요소가 포함 된 인공 소화액이 들어있는 마이크로 원심 분리 튜브에 연결됩니다.

Figure 3
그림 3: 모든 구성 요소가 있는 문어의 일반 보기. CCD 카메라, 현미경, 마이크로 포지셔너, 열 안정화 셀 및 이중 모세관은 8 개의 비아 밸브에 연결된 2 개의 주사기가있는 이중 마이크로 인젝터에 독립적으로 연결됩니다. 각 주사기는 모세관, 샘플이있는 4 개의 마이크로 원심 분리기 튜브 및 1 개의 배출물과 연결됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4A는 각각의 인공 소화액이 이중 모세관을 통한 서브상 교환에 의해 펜던트 방울에 주입되는 방법을 보여준다. 그림 2 에 자세히 설명된 각 소화 화합물은 위장관을 통과하는 통로를 시뮬레이션하여 동시에/순차적으로 적용할 수 있습니다. 인공 소화액에는 다양한 효소와 생물 계면 활성제가 포함되어있어 그림 4B에 표시된 것처럼 초기 유화제의 계면 장력을 변경합니다. UGR에서 개발된 소프트웨어 DINATEN( 재료 표 참조)은 초기 계면층이 체외에서 분해될 때 계면 장력의 진화를 실시간으로 기록합니다. 또한, 각 소화 단계 후에, 안정화 된 계면 층에 부피 / 계면 영역의 주기적 진동을 부과하고 계면 장력의 반응을 기록함으로써 계면 층의 팽창 탄성이 계산됩니다. 진동의 주기/주파수 및 진폭은 다양할 수 있으며 소프트웨어 CONTACTO를 사용한 이미지 처리는 확장 유변학적 매개변수8를 제공합니다.

Figure 4
그림 4: 소화 프로파일의 예 . (A) 초기 유화제 층은 펜던트 방울로 상이한 용액의 순차적 인 하위 단계 교환에 의해 미세 원심 분리기에 배치 된 인공 소화 매체를 받는다. (B) 인공 매체의 다양한 효소 / 생물 계면 활성제에 의해 시험관 내에서 소화됨에 따라 시간 (x 축)의 함수로서 초기 유화제의 계면 장력 (y 축)의 일반적인 진화. 일반 장액과의 최종 하위 단계 교환은 혼합 된 미셀에서 가용화에 의한 소화 된 지질의 탈착을 측정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 연구는 펜던트 드롭 장비9를 사용하여 계면층의 체외 소화를 측정하도록 설계된 일반적인 프로토콜을 제시합니다. 초기 계면층은 도 2에 도시된 바와 같이, 위장관을 통과하는 것을 모방하는 조건에 순차적으로 적용된다. 이러한 다양한 소화 매체는 미세 원심 분리기 튜브에 포함 된 다양한 용액의 하위 단계 교환에 의해 펜던트 방울에 주입됩니다 (그림 4A). 이러한 배지의 조성은 평가될 위장 상태, 즉 위/장 단백질 분해/지방 분해에 따라 맞춤화될 수 있으며, 누적 효과 및 시너지10을 측정할 수 있습니다. 각 구획에서 소화 과정을 모방하는 데 사용되는 실험 조건은 전해질 및 효소11의 pH와 양을 자세히 설명하는 INFOGEST에서 발표한 국제 합의 프로토콜을 따릅니다. 펜던트 드롭을 기반으로 한 실험 장치를 사용하면 시뮬레이션된 분해 과정 전반에 걸쳐 계면 장력을 현장에서 기록할 수 있습니다. 계면층의 팽창 유변학은 각 소화 단계가 끝날 때 계산됩니다. 이러한 방식으로, 각 유화제는 도 4B에 도시된 바와 같이, 소화된 계면의 특성을 설명하는 분해 프로파일을 제공한다. 이것은 소화 과정의 다른 단계에 대한 감수성 또는 저항에 관한 결론을 추출 할 수있게합니다. 일반적으로 인공 소화기에는 산/염기성 pH, 전해질, 프로테아제(위 및 장), 리파아제(위 및 장), 담즙염 및 인지질이 포함되어 있으며 각각의 소화액(위 또는 장)에 용해됩니다. 도 4B는 유화제의 계면 장력의 진화에 대한 일반적인 프로파일을 보여주며, 먼저 프로테아제 작용을 받은 후 리파아제를 받는다. 일반적으로, 계면층의 단백질 분해는 가수 분해 된 펩티드 9,12의 탈착으로 인해 계면 장력의 증가를 촉진하는 반면, 지방 분해는 담즙 염 및 리파아제(13)의 흡착으로 인한 계면 장력의 매우 가파른 감소를 초래한다. 장액과의 최종 하위 단계 교환은 흡착되지 않은/소화된 물질의 벌크 용액을 고갈시키고 가용성 화합물의 탈착 및 혼합 미셀에서 소화된 지질의 가용화를 촉진합니다. 이것은 기록 된 증가 된 계면 장력에 의해 정량화됩니다 (그림 4B).

요약하면, 단일 액적에서 시험관내 소화를 시뮬레이션하기 위해 펜던트 방울에 구현된 실험 설계는 소화 과정이 초기 계면층(10)에 순차적으로 적용될 때 누적 효과 및 시너지 효과를 측정할 수 있게 한다. 각각의 소화기 배지의 조성은 위장 병리 또는 유아 소화기 매체(14)를 포함하는 소화기 상태의 특수성을 설명하도록 용이하게 조정될 수 있다. 그런 다음 단백질 분해 및 지방 분해에 영향을 미치는 계면 메커니즘의 식별을 사용하여 에멀젼의 계면 공학에 의해 소화를 조절할 수 있습니다. 얻은 결과는 낮은 알레르기 성, 제어 된 에너지 섭취 및 소화율 감소 15,16,17,18,19와 같은 맞춤형 기능을 가진 새로운 식품 매트릭스를 설계하는 데 적용될 수 있습니다.

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Protocol

1. 표면 과학 실험에 사용되는 모든 유리 제품의 세척 순서

  1. 물(10%)에 희석한 농축 세척액( 재료 표 참조)으로 유리 제품을 문지릅니다.
  2. 일련의 수돗물, 프로판올, 증류수 및 초순수로 철저히 헹굽니다. 기내에서 건조하고 사용할 때까지 닫힌 캐비닛에 보관하십시오.

2. 샘플 준비

  1. INFOGEST 표준화 프로토콜11,20에 따라 인공 소화제를 준비하십시오 (재료 표 참조). 자세한 내용은 표 1을 참조하고 표면 활성 오염 및 샘플 희석을 방지하기 위한 계면 작업의 요구 사항에 대한 작은 조정을 포함합니다(1:10)10.
  2. 아래 단계에 따라 유화제 용액을 준비하십시오.
    1. 0.01 L의 농축 용액(1 kg· L-1) 유화제 또는 유화제의 혼합물( 재료 표 참조)을 초기 완충액(표 1)에 넣고 밤새 온화한 교반 하에 유지합니다.
    2. 0.1kg· L-1 (또는 필요에 따라) 인터페이스를 포화시킵니다. 이전에 발표 된 보고서21에 따라 일정한 계면 영역에서 1 시간의 흡착 후 계면 장력의 의사 고원에 도달합니다.
    3. 사용하기 전에 15분 동안 약하게 교반하십시오.
  3. 오일 상을 정화하십시오.
    1. 식물성 기름 (해바라기, 올리브, 트리 올레인 등)의 혼합물을 준비하십시오. 및 마그네슘 메타 실리케이트 수지 ( 재료 표 참조)는 대형 비커에서 2 : 1 w / w의 비율입니다. 최소 3시간 동안 약한 기계적 교반을 유지하십시오.
    2. 혼합물을 상업용 원심분리기에서 실온에서 30분 동안 8,000 x g 로 원심분리합니다( 재료 표 참조).
    3. 주사기 필터(0.2μm 공극 크기)로 진공 상태에서 오일 혼합물을 여과합니다( 재료 표 참조). 사용할 때까지 밀봉하고 질소로 거품을 낸 깨끗한 호박색 병에 보관하십시오.

3. 문어의 교정 및 청소

  1. 모세관(밸브 6/4)과 외부 출구(밸브 8-파란색)를 통해 주사기와 모든 밸브를 모두 청소하는 순서를 설정하여 모든 튜브를 초순수로 헹굽니다. 왼쪽 대화 상자에서 clean 버튼을 눌러이 작업을 수행하십시오 (보충 그림 1A).
  2. 물방울을 형성하여 상온에서 물의 표면장력(7)을 확인하고 5분 동안 실시간으로 측정하였다(보충 그림 1B, C).
    1. 차동 밀도를 공기-물(0.9982kg· L−1) 왼쪽 대화 상자, 보충 그림 1B.
  3. 깨끗한 큐벳(광학 유리)에 0.002L의 깨끗한 식물성 기름을 채우고 온도 조절 셀의 큐벳 홀더에 넣습니다(그림 3).
  4. 온도 조절기를 설정하고 37°C에서 온도 평형을 허용합니다.
  5. 실온에서 물-기름의 계면 장력 확인7.
    1. 차분 밀도를 식물성 기름-물 (올리브 오일 : 0.800 kg · L−1) (보충 그림 1C).
    2. 0.5 μL·s−1 의 속도로 40 μL를 주입하고 주입이 끝날 때까지 매초 실시간으로 측정합니다. 이것은 간단한 동적 프로세스입니다(보충 그림 1B, D).
    3. 계면 장력을 데이터 시트의 액적 부피의 함수로 플로팅합니다.
    4. 액적 부피 범위가 액적 부피와 무관한 계면 장력 값을 제공하는지 확인하십시오. 계면 영역을 액적 부피의 함수로 플로팅합니다.
    5. 아래 단계에 따라 두 단계(보충 그림 1B 및 보충 그림 2A)를 포함하는 프로세스를 프로그래밍합니다.
      1. 내부 주사기를 사용하여 이 일정한 계면 장력 범위 내에 포함된 부피를 주입합니다.
      2. 3.5.4단계에서 선택한 값으로 계면 영역을 일정하게 유지하고 5분 동안 계면 장력을 기록합니다7.

4. 각 소화 단계에 대해 DINATEN에서 하나의 실험 프로세스 프로그래밍

참고: 프로세스 매개변수에 대해서는 보충 그림 1B를 참조하십시오.

  1. 초기 제어를 수행합니다.
    1. 방울 형성의 경우 10μL(±5μL)의 유화제 용액을 모세관(밸브 6)에 주입합니다(보충 그림 2A).
    2. 20mm2(±10mm2)의 일정한 계면 영역21에서 1시간 동안 흡착을 기록합니다(보충 그림 2B).
    3. 확장 유변학8 을 기록한다(보충 그림 2C).
      1. 진동 진폭을 1.25μL, 주기 10초로 설정합니다.
      2. 선택한 계면 영역 (4.1.2 단계)에서 흡착을 10 초 동안 기록합니다.
      3. 4.1.3단계를 5초, 20초, 50초 및 100초의 다른 주기로 반복합니다.
  2. 위 소화를 기록하십시오.
    1. 선택된 계면 영역에서 흡착(21 )을 10초 동안 기록한다.
    2. 밸브 2 (sSGF) 및 위 효소 (표 1)의 액체와의 하위 상 교환7 (보충 그림 2D).
      1. 밸브 2에서 왼쪽 주사기를 채 웁니다. 왼쪽 주사기를 사용하여 밸브 6-모세관에 125μL를 5μL·s-1로 주입합니다.
      2. 오른쪽 주사기로 모세관에서 125μL를 5μL·s−1로 추출합니다. 오른쪽 주사기를 내려 밸브 8을 종료합니다. 4.2.2.1-4.2.2.2단계를 10번 반복하여 완전한 교환을 보장합니다.
    3. 단계 4.1.2에서 선택된 계면 영역에서 흡착(21 )을 1시간 동안 기록합니다(보충 그림 2B).
    4. 확장 유변학8 을 기록한다(보충 그림 2C).
      1. 진동 진폭을 1.25μL, 주기 10초로 설정합니다.
      2. 4.1.2단계에서 선택한 계면 영역의 흡착을 10초 동안 기록합니다. 다른 기간에 반복하십시오 : 5 초, 20 초, 50 초, 100 초.
  3. 장 소화를 기록하십시오.
    1. 단계 4.1.2에서 선택된 계면 영역에서 흡착(21 )을 10초 동안 기록합니다(보충 그림 2B).
    2. 밸브 3 (sSIF) 및 장 효소 / 담즙 염 / 인지질 (표 1)의 액체와의 하위 단계 교환7 (보충 그림 2D).
      1. 밸브 2에서 왼쪽 주사기를 채 웁니다. 왼쪽 주사기를 사용하여 밸브 6-모세관에 125μL를 5μL·s-1로 주입합니다. 오른쪽 주사기로 모세관에서 125μL를 5μL·s−1로 추출합니다.
      2. 오른쪽 주사기를 내려 밸브 8을 종료합니다. 4.3.2.1-4.3.2.2단계를 10번 반복하여 완전한 교환을 보장합니다.
    3. 단계 4.1.2에서 선택된 계면 영역에서 흡착(21 )을 1시간 동안 기록한다.
    4. 확장 유변학8 을 기록한다(보충 그림 2C).
      1. 진동 진폭을 1.25μL, 주기 10초로 설정합니다.
      2. 4.1.2단계에서 선택한 계면 영역의 흡착을 10초 동안 기록합니다.
      3. 다른 기간에 반복하십시오 : 5 초, 20 초, 50 초, 100 초.
  4. 아래 단계에 따라 탈착을 기록하십시오.
    1. 단계 4.1.2에서 선택된 계면 영역에서 흡착(21 )을 10초 동안 기록합니다(보충 그림 2B).
    2. 밸브 5 (sSIF)에서 액체와 아상 교환7 (표 1, 보충 그림 2D).
      1. 밸브 5에서 왼쪽 주사기를 채 웁니다. 왼쪽 주사기를 사용하여 밸브 5-모세관에 125μL를 주입합니다.5μL·s-1.
      2. 오른쪽 주사기로 모세관에서 125μL를 5μL·s−1로 추출합니다. 오른쪽 주사기를 내려 밸브 8을 종료합니다. 4.4.2.1-4.4.2.2단계를 10번 반복하여 완전한 교환을 보장합니다.
    3. 단계 4.1.2에서 선택된 계면 영역에서 흡착(21 )을 1시간 동안 기록합니다(보충 그림 2B).
    4. 확장 유변학8 을 기록한다(보충 그림 2C).
      1. 1.25 μL, 주기 10 초의 진폭을 유지하십시오.
      2. 4.1.2단계에서 선택한 계면 영역의 흡착을 10초 동안 기록합니다.
      3. 다른 기간(5초, 20초, 50초, 100초)에서 4.4.4단계를 반복합니다.

5. 실험 설정

  1. 미세 원심 분리 튜브에 인공 소화 매체를 채우고 해당 튜브로 각 밸브를 연결합니다.
  2. 밸브 2, 밸브 5, 밸브 3, 밸브 4 및 밸브 5에서 외부 출구(밸브 8)까지 청소하여 밸브 2-5의 튜브를 채우십시오(보충 그림 1A).
  3. 밸브 1에서 밸브 6 모세관까지 5 번 청소하여 밸브 1의 튜브를 채 웁니다.
  4. 모세관을 오일 상에 놓습니다. 왼쪽 주사기에 밸브 1을 장착합니다(초기 용액, 표 1).
  5. 단계 4.1-초기, 단계 4.2-위, 단계 4.3-장 및 단계 4.4-탈착을 순차적으로 시작하여 각 과정이 끝날 때 데이터를 저장합니다.

6. 이미지 처리 소프트웨어 CONTACTO 8을 사용한 확장 유변학적 파라미터 계산

참고: 자세한 내용은 Maldonado-Valderrama et al.8을 참조하십시오.

  1. 주어진 주파수와 진폭에서 영역 진동에 해당하는 이미지를 로드합니다(보충 그림 3A).
  2. 유변학(보충 그림 3B)을 누르고 팽창 파라미터(보충 그림 3C)를 얻습니다.
  3. 결과를 복사하여 데이터 스프레드 시트에 붙여넣습니다.

7. 실험 결과 플로팅

  1. 이전 단계 시간의 마지막 데이터를 추가하여 소화 과정의 각 단계에서 시간 열을 다시 계산합니다.
  2. 사용된 분해 과정의 각 단계에 대한 계면 장력 대 추가 시간을 플로팅합니다.
  3. 각 단계의 끝에서 얻은 최종 계면 장력/팽창 탄성 및 점도와 소화 단계(초기, 위 소화, 십이지장 소화 및 탈착)를 플로팅합니다.

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Representative Results

이 섹션에서는 문어로 측정한 소화 프로파일의 다양한 예를 보여줍니다. 시뮬레이션된 분해 프로파일 일치의 일반적인 모양은 그림 4B에 나와 있습니다. 계면 장력은 일반적으로 소화 프로파일에서 시간에 대해 표시됩니다. 고려되는 다양한 단계/소화 단계는 다양한 색상으로 표시됩니다. 첫 번째 단계는 초기 층을 형성하고 각 경우에 따라 유화제 또는 단백질 / 계면 활성제 / 폴리머의 흡착 단계에 해당합니다. 이어서, 상이한 소화액은 서브 페이즈 교환에 의해 새로운 배지를 함유하는 벌크 용액에 주입된다. 새로운 하위 단계는 초기 유화제 층의 계면 장력과 각 소화 단계가 끝날 때 측정되는 확장 유변학의 변화를 생성합니다. 소화 과정은 최대 8 개의 소화 단계로 구성 될 수 있습니다.

Figure 5
그림 5: 위 소화 프로파일의 예 . (A) 인간 혈청 알부민의 위 단백질 분해. 소화액은 T = 37 °C에서 실험 섹션에 자세히 설명 된 용액과의 하위 상 교환에 의해 적용됩니다. 파란색 : 단백질이있는 초기 완충액, 빨간색 : 펩신이있는 sSGF. 델 카스티요-산타엘라 외.12의 허가를 받아 증쇄됨. (B) 감귤류 펙틴의 위 지방 분해. 소화액은 T = 37 °C에서 실험 섹션에 자세히 설명 된 용액과의 하위 상 교환에 의해 적용됩니다. 파란색: 감귤류 펙틴이 함유된 초기 완충액, 노란색: 위 리파아제가 함유된 sSGF, 회색: sSGF. Infantes-Garcia et al.17의 허가를 받아 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5 는 유화제의 위장 소화에 대해 얻어진 일부 실험 결과를 나타낸 것이다. 그림 5A에서 인간 혈청 알부민(HSA)12 은 먼저 올리브 오일-물 계면에 흡착되어 계면 장력을 감소시켜 1시간 후에 고원에 도달합니다. 이 단계가 끝나면 유변학은 0.1Hz(10초)의 주파수(주기)에서 측정됩니다. 제 2 단계에서, 펩신을 갖는 sSGF는 서브 상 교환에 의해 첨가된다. 이것은 하나의 주사기로 볼륨을 도입하고 다른 주사기로 동일한 볼륨을 추출하는 것으로 구성됩니다. 이러한 방식으로, 방울의 면적은 변하지 않으며, 오일-물 계면에서 비가역적으로 흡착 된 성분을 유지합니다. 교환은 10-15 회 반복됩니다. sSGF 및 펩신과의 하위 단계 교환 동안, 초기 단백질 층을 희석시키는 단백질의 가수 분해로 인해 계면 장력이 증가합니다 (그림 5A). 그림 5B에서 감귤류 펙틴(CP)17은 40분 동안 트리글리세리드 오일-물에 흡착된 후 0.1Hz 에서 확장 유변학을 수행합니다. 제 2 단계에서, 위 리파아제와 함께 sSGF가 방울의 벌크에 주입되고; 반대로 단백질 분해는 리파아제의 흡착과 계면에 남아있는 지방산의 형성을 초래하여 계면 장력을 감소시킵니다. 탈착 단계는 친수성 생산 또는 지방 분해의 친 유성 제품의 가용화를 평가하는 세 번째 단계입니다. 도 5B 는 sSGF와의 서브페이즈 교환이 계면 장력의 널 응답을 제공한다는 것을 보여준다. 이것은 친 유성 소화 제품의 생산으로 해석 될 수 있으며, 이는 비가역적으로 흡착되고 용해되지 않고 계면에 고정되어 있습니다. 위 단계에서 담즙 염이 없으면 가용화 부족이 원인이됩니다. 지방 분해 정도는 도달 한 계면 장력의 값에 의해 정 성적으로 분석 될 수 있습니다.

Figure 6
그림 6: 장 소화 프로파일의 예. (A) 37°C에서 sSIF에서 담즙염(검은색 사각형), 리파아제(회색 삼각형) 및 리파아제+담즙염(주황색 마름모꼴)의 흡착-탈착 프로파일. Macierzanka et al.13의 허가를 받아 증쇄. (B) 이전에 흡착 된 F68 (짙은 녹색) 및 F127 (밝은 녹색)에 담즙 염 + 리파아제를 흡착하고 sSIF에서 담즙 염 (노란색)을 흡착합니다. 탈착: 담즙염(주황색), F68(진한 보라색) 및 F127(연한 보라색)에서 sSIF와 아상 교환. Torcello-Gómez et al.19의 허가를 받아 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6은 유화제의 장내 소화에 대해 얻어진 실험 결과를 나타낸 것이다. 위 소화와 달리 소장에 담즙염이 존재하면 sSIF와의 아상 교환 및 벌크 용액 고갈시 다양한 탈착 프로파일을 제공합니다. 도 6A는 순수 담즙염, 순수 리파아제, 및 혼합 리파아제/담즙염 8,9,10,13에 대해 수득된 탈착 프로파일을 나타낸다. 담즙염은 오일-물 계면에 가역적으로 흡착되며, 따라서 sSIF와의 아상 교환시 완전히 탈착되며, 이는 베어 오일-물 계면 8,13의 값에 도달하기 위한 계면 장력의 증가로 표시됩니다. 반대로, 리파아제는 sSIF에 의한 하위 단계 교환 후 계면 장력의 일정한 값에 의해 주어진 바와 같이 비가역적으로 흡착됩니다. 리파아제 및 담즙염의 혼합물은 sSIF에 의한 아상 교환시 계면 장력의 제한된 증가에 의해 중간 값으로 정량화 된 중간 탈착 프로파일을 제공한다. 나머지 계면층은 리파아제와 유리 지방산을 함유한다. 담즙 염은 아마도 계면으로부터 탈리되고 지방 분해에서 형성된 유리 지방산의 일부를 가용화시켰다. 도 6B는 Pluronic의 2개의 변이체: F127 및 F6819의 지방분해시 계면 장력의 진화를 보여준다. 도 6B는 리파아제 및 담즙염의 흡착 및 오일-물 계면에서 이전에 형성된 F68 및 F127의 계면 필름 상에 유리 지방산의 생성으로 인한 계면 장력의 급격한 감소를 보여준다. 탈착 단계는 sSIF와의 아상 교환으로 인한 계면 장력 증가를 나타내며, 이는 지방 분해 생성물의 가용화를 정량화합니다.

Figure 7
그림 7: 완전한 동적 위장 소화 프로파일의 예. (A) 공기-물 계면에서 AS-48 흡착 필름의 체외 분해 프로파일. 소화액은 T = 37 °C에서 실험 섹션에 자세히 설명 된 용액과의 하위 상 교환에 의해 적용됩니다. 대조군 : AS-48을 사용한 초기 완충액, 펩신 : 펩신을 사용한 sSGF, 트립신 : 트립신 + 키모 트립신을 사용한 sSIF, 탈착 : sSIF. 델 카스티요-산타엘라 외.18의 허가를 받아 증쇄됨. (B) 올리브 오일-물 계면에서 인간 및 소 혈청 알부민 흡착 필름의 시험관 내 소화 프로파일. 소화액은 T = 37 °C에서 실험 섹션에 자세히 설명 된 용액과의 하위 상 교환에 의해 적용됩니다. 대조군: HSA/BSA를 사용한 초기 완충액, 펩신: 펩신을 사용한 sSGF, 트립신: 트립신 + 키모트립신을 사용한 sSIF, 지방분해: 리파아제 및 담즙염을 사용한 sSIF, 탈착: sSIF. 표시된 곡선은 편차가 <5%인 대표적인 실험입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7은 시뮬레이션된 완전한 분해 프로파일의 예를 보여줍니다. 도 7A는 공기-물 계면(18)에서 흡착된 식품 생체보존제 AS-48의 소화 프로파일을 나타낸다. 소화 과정은이 펩타이드의 단백질 분해에 초점을 맞추도록 설계되었지만 기름의 지방 분해는 필요하지 않았으며 공기-물 계면에 있습니다. 따라서 그림 7A의 시뮬레이션된 소화는 제어/초기 필름, 펩시노분해, 트립시놀분해 및 탈착의 5단계로 구성됩니다. 실험 결과는이 박테리오신이 표면 장력이 변하지 않았기 때문에 펩신과 트립신 가수 분해 모두에 내성이 있음을 보여주었습니다. 따라서, AS-48은 시험관내 소화에 내성이 있는 우수한 식품 생체보존제로 간주되었다. 도 7B는 오일-물 계면(22)에서 흡착된 인간 및 소 혈청 알부민의 흡착된 층의 시험관내 소화 프로파일을 비교한다. 이 시뮬레이션은 이들 2개의 단백질(23)에 의해 안정화된 에멀젼의 소화율을 모방하고 커큐민4의 캡슐화를 평가하도록 설계되었다. 따라서 시뮬레이션된 소화는 제어/초기, 펩시놀분해, 트립시노분해, 지방분해 및 탈착의 5단계로 구성된 맞춤형 것입니다. 실험 결과는 펩신 소화 후 계면 장력이 증가하여 펩시 용해에 대한 감수성이 증가했음을 나타냅니다. 이것은 흡착시 소 변종의 전개가 증가하여 펩신에 민감한 부위가 노출되기 때문입니다. 그런 다음 트립신 분해와 지방 분해는 완전히 유사한 소화 프로파일을 제공했습니다 (그림 7B).

Figure 8
그림 8: 위장 소화의 최종 값의 예. (A) 계면 장력, (B) 팽창 탄성, (C) 올리브 오일-물 계면에서 β- 락토 글로불린 흡착 필름의 시험관 내 소화의 팽창 점도. 팽창 파라미터는 소화된 계면이 각 단계에서 평형화된 후 1Hz, 0.1Hz 및 0.01Hz에서 측정되었습니다. 소화액은 T = 37 °C에서 실험 섹션에 자세히 설명 된 용액과의 하위 상 교환에 의해 적용됩니다. 대조군 : 단백질이있는 초기 완충액, 펩신 : 펩신이있는 sSGF, 트립신 : 트립신 + 키모 트립신을 사용한 sSIF, 지방 분해 : 리파아제 및 담즙 염을 사용한 sSIF, 탈착 : sSIF. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

일반적으로, 상이한 소화된 계면층의 성질을 평가하고 비교하기 위해, 최종 계면 장력 및 소화된 계면에 대해 얻어진 팽창 탄성/점도가 설계된 소화 공정에서 고려되는 각 단계에 대해 플롯된다. 그림 8 은 1Hz, 0.1Hz 및 0.01Hz의 주파수에서 측정된 계면 장력(그림 8A), 팽창 탄성(그림 8B) 및 팽창 점도(그림 8C)를 보여줍니다. 플롯팅된 값은 오일-물 계면(16)에서 흡착된 β-락토글로불린의 각 소화 단계 후에 얻어졌다. 도 8A 는 단백질 분해(펩신 및 트립신)가 계면 장력에서 작은 증가를 생성하는 반면, 지방분해는 이 값을 감소시키고, 탈착은 다시 증가한다는 것을 보여준다. 팽창 탄성과 관련하여 단백질은 오일-물 계면에서 탄성 및 상호 연결된 필름을 형성합니다. 담즙 염의 존재는 탄성이 낮은 이동성이 높고 유체 계면 필름을 생성합니다. 마지막으로, 나머지 지방 분해 생성물은 탈착 후 응집 탄성 필름을 개발할 수 없습니다. 팽창 탄성은 진동 주파수에 따라 약간 증가합니다(그림 8B). 마지막으로, 도 8C 에 도시된 계면 필름의 팽창 점도는 더 낮은 주파수에서만 검출 가능하며, 계면에서 다층, 응집체 또는 다른 소산 구조의 존재를 검출한다. β-락토글로불린의 소화 프로파일을 펄스 처리된 β-락토글로불린에 대해 수득된 소화 프로파일과 비교한 결과, 이러한 유형의 물리적 처리를 받은 단백질의 소화율이 개선된 것으로 나타났다16.

초기 버퍼 0.00113 몰 L-1 NaH2PO4, pH 7.0
단순화된 모의 위액(sSGF) [NaH2PO4] = 0.00113 몰 L-1, [NaCl] = 0.15 몰 L-1, pH 3.0
단순화된 모의 장액(sSIF) [NaH2PO4] =0.00113 몰 L-1, [NaCl] = 0.15 몰 L-1,[CaCl2] = 0.003 몰 L-1, pH 7.0
위 효소 펩신 (50 ∙ 10 3 U L-1), 위 리파아제 (0.5 ∙ 103 U L-1)
장 효소 트립신 (2.5 ∙ 10 3 U L-1), 키모 트립신 (0.625 ∙ 10 3 U L-1), 췌장 리파아제 (50∙ 10 3 U L-1), 코 리파아제 (150 ∙ 10 3 U L-1)
담즙 염 혼합물 0.01 mol L-1 M. 담즙염 혼합물 : 타우로 콜산 나트륨 및 데 옥시 콜산 나트륨 (50/50) 또는 타우로 콜산 나트륨 및 글리코 데 옥시 콜산 나트륨 (50/50)

표 1 : 인공 소화기의 조성.

보충 그림 1: 컴퓨터 인터페이스 DINATEN의 기본 작동. (A) 컴퓨터 인터페이스 DINATEN의 일반적인 외관; 왼쪽 대화 상자에는 모든 밸브에 연결된 두 개의 주사기가 표시되고 주입/추출 및 세척을 제어합니다. 중앙 대화상자에는 명령, 드롭 이미지 및 결과가 있는 테이블이 포함되어 있습니다. (B) 실시간 계산은 시간의 함수로서 자동 측정을 제공한다. (c) 미분 밀도를 포함하는 좌측 명령. (D) 간단한 동적 공정으로 주입/추출 부피, 속도 및 포획 시간을 제어합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 각 소화 단계(프로세스)를 프로그래밍하기 위한 인터페이스. (A) 고정 부피 및 고정 주입 속도의 왼쪽 주사기로 방울 형성. (B) 일정한 계면 영역에서의 흡착 : 제어. (C) 고정 진폭, 주기 및 사이클 수를 갖는 유변학. (D) 아상 교환 : 동일한 속도로 두 주사기로 주입 및 추출합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 이미지 분석을 위한 소프트웨어를 사용한 팽창 파라미터 계산 CONTACTO. (A) 정해진 주기에서의 진동에 대응하는 영상의 분석. (b) 선택된 이미지의 계면 층의 팽창 파라미터 계산. (c) 팽창 분석으로부터의 결과를 보여주는 대화. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 기사에서는 펜던트 드롭 장비를 사용하여 계면층의 체외 분해를 측정하는 일반화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 문헌과의 비교를 용이하게 하기 위해 INFOGEST11,20 조화 프로토콜을 기반으로 하는 소화 완충액의 구성을 조정하여 실험의 특정 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 소화 효소 및 바이오 계면 활성제는 개별적으로, 순차적으로 또는 함께 첨가 될 수있다. 이 후자의 옵션은 계면층의 포화가 매우 낮은 계면 장력을 제공하여 다양한 현상을 방해하고 물방울이 떨어질 수 있으므로 주의해서 수행해야 합니다. 각 소화 성분의 효과를 분석 할 수 있도록 다른 소화 효소가 순차적으로 다른 농도로 첨가됩니다. 이러한 방식으로 각 구성 요소의 효과를 분석하고 체계화 할 수 있으며 순차적 인 첨가로 시너지 효과를 평가할 수 있습니다. 또한 물방울이 떨어지는 것을 방지하기 위해 일부 농도를 희석합니다9. 얻어진 결과는 단순화 된 시스템을 설명하기 위해 조건이 조정되기 때문에 유화 시스템에 직접 외삽 될 수 없습니다. 그러나, 계면 장력의 진화는 계면층이 소화됨에 따라 계면 커버리지의 진화를 보여준다(10). 유사하게, 팽창 유변학의 진화는 소화가 진행됨에 따라 계면의 기계적 특성에 대한 일부 정보를 제공합니다9. 이러한 결과에는 유화 시스템에 적용되도록 조정하고 신중하게 해석할 수 있는 유용한 정보가 포함되어 있습니다.

펜던트 드롭 장비를 사용하면 그림 2와 같이 계면 층에서 구체적으로 발생하는 현장 이벤트를 평가할 수 있습니다. 먼저, 하나의 단일 에멀젼 방울을 나타내는 초기 계면 층이 형성된다. 이 초기 층은 상이한 소화 조건을 거치며 수성 상에 상이한 성분의 존재로 인해 순차적으로 조성을 변화시킨다. 또한 리파아제는 오일 상에 접근하고 지방을 가수 분해하기 위해이 계면층을 극복해야합니다. 이러한 계면 이벤트는 처음에 생성된 동일한 계면 계층에서 평가되어야 합니다. 에멀젼을 체외 소화에 적용하면 다른 시간에 샘플링하고 소화될 때 에멀젼의 변화(액적 크기, 제타 전위)를 평가할 수 있지만 각 에멀젼 액적을 둘러싼 계면층의 현장 평가는 허용되지 않습니다. 따라서, 다중 서브 상 교환으로 구현 된 펜던트 드롭 장비는 에멀젼(14)의 계면 공학에 초점을 맞추는 보완적인 기술을 포함한다.

이 방법론의 첫 번째 한계는 물방울의 낙하를 방지하기 위해 희석되어야하는 여러 제품과 계면 층의 포화와 정확하게 관련됩니다. 또 다른 실험적 문제는 기포의 핵 형성을 피하기 위해 모든 인공 매체의 탈기이며, 이는 또한 모세관에서 액적 분리를 유발할 수 있습니다. 유화 시스템으로 외삽할 때 에멀젼 시스템과 비교하여 더 큰 오일-물 비율을 고려하는 것도 중요합니다. 마지막으로, 확장 유변학에는 소화 효소에 의해 형성되고 파괴되는 계면층 내의 분자간 및 분자 내 결합에 대한 정보가 포함되어 있지만 에멀젼 안정성을 해석하고 외삽하기는 어렵습니다. 전체적으로, 다중 하위 상 교환 장치로 구현된 펜던트 방울은 전기영동(22)을 통한 단백질 소화의 액적 크기 분포 및 제타 전위의 진화를 따르는 에멀젼12의 시험관 내 소화 연구를 보완하는 유용한 장비입니다. 성별 변화, 유아 소화 또는 소화 문제를 설명하기 위한 소화관의 수정은 실험 절차의 향후 적용을 포함합니다.

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Disclosures

저자는이 논문에보고 된 작업에 영향을 미칠 수있는 알려진 경쟁 재정적 이해 관계나 개인적인 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구는 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 및 "ERDF 유럽을 만드는 방법"이 자금을 지원하는 RTI2018-101309-B-C21 및 PID2020-631-116615RAI00 프로젝트의 자금 지원을 받았습니다. 이 연구는 그라나다 대학 (스페인)의 Biocolloid and Fluid Physics Group (ref. PAI-FQM115)의 지원을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

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References

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생화학 189호
<em>시험관 내</em> 시뮬레이션된 위장관액의 다중 하위 단계 교환 <em>을 통한</em> 단일 액적의 에멀젼 소화
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