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Biochemistry

In vitro Digestión de emulsiones en una sola gota a través del intercambio multifásico de fluidos gastrointestinales simulados

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

Un balance colgante de película de superficie de gota implementado con un intercambio multisubfase, apodado OCTOPUS, permite imitar las condiciones digestivas mediante el intercambio secuencial de subfases de la solución a granel original con fluidos gastrointestinales simulados. La digestión in vitro simulada se monitoriza registrando in situ la tensión interfacial de la capa interfacial digerida.

Abstract

Las emulsiones se utilizan actualmente para encapsular y administrar nutrientes y medicamentos para abordar diferentes afecciones gastrointestinales como la obesidad, la fortificación de nutrientes, las alergias alimentarias y las enfermedades digestivas. La capacidad de una emulsión para proporcionar la funcionalidad deseada, es decir, alcanzar un sitio específico dentro del tracto gastrointestinal, inhibir / retrasar la lipólisis o facilitar la digestibilidad, depende en última instancia de su susceptibilidad a la degradación enzimática en el tracto gastrointestinal. En las emulsiones de aceite en agua, las gotas de lípidos están rodeadas por capas interfaciales, donde los emulsionantes estabilizan la emulsión y protegen el compuesto encapsulado. Lograr una digestibilidad adaptada de las emulsiones depende de su composición inicial, pero también requiere monitorear la evolución de esas capas interfaciales a medida que se someten a diferentes fases de la digestión gastrointestinal. Una balanza de película de superficie de gota colgante implementada con un intercambio multisubfase permite simular la digestión in vitro de emulsiones en una sola gota acuosa sumergida en aceite mediante la aplicación de un modelo de digestión estática personalizado. El tránsito a través del tracto gastrointestinal es imitado por el intercambio de subfases de la solución a granel de gotitas original con medios artificiales, imitando las condiciones fisiológicas de cada compartimento / paso del tracto gastrointestinal. La evolución dinámica de la tensión interfacial se registra in situ a lo largo de toda la digestión gastrointestinal simulada. Las propiedades mecánicas de las interfaces digeridas, como la elasticidad dilatacional interfacial y la viscosidad, se miden después de cada fase de digestión (oral, gástrico, intestino delgado). La composición de cada medio digestivo se puede ajustar para tener en cuenta las particularidades de las afecciones digestivas, incluidas las patologías gastrointestinales y los medios digestivos infantiles. Se identifican los mecanismos interfaciales específicos que afectan la proteólisis y la lipólisis, proporcionando herramientas para modular la digestión mediante la ingeniería interfacial de emulsiones. Los resultados obtenidos pueden manipularse para diseñar matrices de nuevos alimentos con funcionalidades personalizadas como baja alergenicidad, ingesta de energía controlada y disminución de la digestibilidad.

Introduction

Comprender cómo se digiere la grasa, lo que implica la digestión en emulsión, es importante para diseñar racionalmente productos con funcionalidad personalizada1. El sustrato para la digestión de grasas es una emulsión ya que la grasa se emulsiona al consumirla por acción mecánica y mezclándola con biosurfactantes en la boca y el estómago. Además, la mayor parte de la grasa consumida por los humanos ya está emulsionada (como los productos lácteos), y en el caso de los bebés o algunas personas mayores, esta es la única forma de consumo. Por lo tanto, el diseño de productos a base de emulsión con perfiles de digestión específicos es muy importante en nutrición1. Además, las emulsiones pueden encapsular y administrar nutrientes, medicamentos o bioactivos lipofílicos2 para abordar diferentes afecciones gastrointestinales como la obesidad3, la fortificación de nutrientes, las alergias alimentarias y las enfermedades digestivas. En las emulsiones de aceite en agua, las gotas de lípidos están rodeadas por capas interfaciales de emulsionantes como proteínas, surfactantes, polímeros, partículas y mezclas4. El papel de los emulsionantes es doble: estabilizar la emulsión5 y proteger/transportar el compuesto encapsulado a un sitio específico. Lograr una digestibilidad adaptada de las emulsiones depende de su composición inicial, pero también requiere monitorear la evolución continua de esta interfaz durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Aplicación de la ingeniería interfacial de emulsiones para abordar algunas de las principales afecciones gastrointestinales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La digestión de lípidos es, en última instancia, un proceso interfacial porque requiere la adsorción de lipasas (gástricas o pancreáticas) en la interfaz aceite-agua de gotitas de lípidos emulsionadas a través de la capa interfacial para alcanzar e hidrolizar los triglicéridos contenidos en el aceite en ácidos grasos libres y monoacilglicéridos6. Esto se esquematiza en la Figura 2. La lipasa gástrica compite con la pepsina y los fosfolípidos en el estómago por la interfaz aceite-agua (Figura 2, digestión gástrica). Luego, la lipasa/colipasa pancreática compite con tripsina/quimotripsina, fosfolípidos, sales biliares y productos digestivos en el intestino delgado. Las proteasas pueden alterar la cobertura interfacial, impidiendo o favoreciendo la adsorción de lipasa, mientras que las sales biliares son altamente activas en superficie y desplazan la mayor parte del emulsionante restante para promover la adsorción de lipasa (Figura 2, digestión intestinal). Eventualmente, la velocidad y el alcance de la lipólisis dependen de las propiedades interfaciales de la emulsión inicial / gástrica digerida, como el grosor, las conexiones intermoleculares / intramoleculares y las interacciones electrostáticas y estéricas. En consecuencia, el monitoreo de la evolución de la capa interfacial a medida que se digiere ofrece una plataforma experimental para identificar los mecanismos interfaciales y los eventos que afectan la adsorción de la lipasa y, por lo tanto, la digestión de los lípidos.

Figure 2
Figura 2: Diagrama esquemático que ilustra el papel de las interfaces en la digestión de lípidos gastrointestinales. La hidrólisis de pepsina altera la composición interfacial en la fase gástrica, mientras que la lipasa gástrica hidroliza los triglicéridos. En el intestino delgado, la tripsina/quimotripsina hidroliza aún más la película interfacial, mientras que la lipólisis procede por la adsorción de BS/lipasas, la hidrólisis de triglicéridos y la desorción de productos lipolíticos por solubilización en las micelas/complejo BS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El equipo de caída colgante de la Universidad de Granada (UGR) se implementa con una tecnología patentada, el doble capilar coaxial, que permite el intercambio subfásico de la solución a granel7. El capilar, que sostiene la gota colgante, consiste en una disposición de dos capilares coaxiales que están conectados independientemente a cada canal de un microinyector doble. Cada microinyector puede funcionar de forma independiente, lo que permite el intercambio del contenido caído por flujopasante 7. En consecuencia, el intercambio de subfases consiste en la inyección simultánea de la nueva solución con el capilar interno y la extracción de la solución a granel con el capilar externo utilizando el mismo caudal. Este proceso permite el reemplazo de la solución a granel sin perturbar el área interfacial o el volumen de la gota. Este procedimiento se actualizó posteriormente a un intercambio multifásico, que permite hasta ocho intercambios secuenciales de subfase de la solución masiva de gotas8. Esto permite la simulación del proceso digestivo en una sola gota acuosa suspendida en medios lipídicos mediante el intercambio secuencial de la solución a granel con medios artificiales que imitan los diferentes compartimentos (boca, estómago, intestino delgado). Toda la configuración se representa en la Figura 3, incluidos los detalles de los componentes. Las jeringas en el microinyector están conectadas a las ocho válvulas vías, cada una conectada a un tubo de microcentrífuga que contiene el líquido digestivo artificial con los componentes descritos en la Figura 2.

Figure 3
Figura 3: Vista general del OCTOPUS con todos los componentes. La cámara CCD, el microscopio, el microposicionador, la célula termoestabilizada y el doble capilar se conectaron independientemente a un microinyector doble con dos jeringas conectadas a ocho válvulas vías. Cada jeringa se conecta con capilar, cuatro tubos de microcentrífuga con muestra y una descarga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 4A muestra cómo cada uno de los fluidos digestivos artificiales se inyecta en la gota colgante por intercambio de subfases a través del doble capilar. Cada compuesto digestivo detallado en la Figura 2 se puede aplicar simultáneamente/secuencialmente, simulando el paso a través del tracto gastrointestinal. Los fluidos digestivos artificiales contienen diferentes enzimas y biosurfactantes, que alteran la tensión interfacial del emulsionante inicial, como se esquematiza en la Figura 4B. El software DINATEN (ver Tabla de materiales), también desarrollado en la UGR, registra la evolución de la tensión interfacial en tiempo real a medida que se digiere in vitro la capa interfacial inicial. Además, después de cada fase digestiva, la elasticidad dilatacional de la capa interfacial se calcula imponiendo oscilaciones periódicas de volumen / área interfacial sobre la capa interfacial estabilizada y registrando la respuesta de la tensión interfacial. El período/frecuencia y la amplitud de la oscilación pueden variarse, y el procesamiento de imágenes con el software CONTACTO proporciona los parámetros reológicos dilatacionales8.

Figure 4
Figura 4: Ejemplos de perfiles de digestión . (A) La capa emulsionante inicial se somete a medios digestivos artificiales colocados en la microcentrífuga mediante el intercambio secuencial de subfase de las diferentes soluciones en la gota colgante. (B) La evolución general de la tensión interfacial (eje y) del emulsionante inicial en función del tiempo (eje x) a medida que es digerido in vitro por las diversas enzimas/biosurfactantes en los medios artificiales. Un intercambio final de subfases con líquido intestinal simple mide la desorción de lípidos digeridos por solubilización en micelas mixtas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este estudio presenta el protocolo general diseñado para medir la digestión in vitro de capas interfaciales con equipo de gota colgante9. La capa interfacial inicial se somete secuencialmente a condiciones que imitan el paso a través del tracto gastrointestinal, como se muestra en la Figura 2. Estos diferentes medios digestivos se inyectan en la gota colgante mediante el intercambio de subfases de las diferentes soluciones contenidas en los tubos de microcentrífuga (Figura 4A). La composición de estos medios puede ser personalizada dependiendo de las condiciones gastrointestinales que serán evaluadas, a saber, proteólisis/lipólisis gástrica/intestinal, permitiendo medir efectos acumulativos y sinergias10. Las condiciones experimentales utilizadas para imitar el proceso de digestión en cada compartimento siguen el protocolo de consenso internacional publicado por INFOGEST que detalla el pH y las cantidades de electrolitos y enzimas11. El dispositivo experimental basado en gota colgante permite registrar la tensión interfacial in situ durante todo el proceso de digestión simulado. La reología dilatacional de la capa interfacial se calcula al final de cada paso digestivo. De esta manera, cada emulsionante ofrece un perfil de digestión que ilustra las propiedades de las interfaces digeridas, como se muestra en la Figura 4B. Esto permite extraer conclusiones sobre su susceptibilidad o resistencia a las diferentes etapas del proceso digestivo. En general, los medios digestivos artificiales contienen pH ácido/básico, electrolitos, proteasas (gástricas e intestinales), lipasas (gástricas e intestinales), sales biliares y fosfolípidos, que se disuelven en sus respectivos fluidos digestivos (gástricos o intestinales). La figura 4B muestra un perfil genérico de la evolución de la tensión interfacial de un emulsionante, primero sometida a la acción de la proteasa, seguida de las lipasas. En general, la proteólisis de la capa interfacial promueve un aumento de la tensión interfacial debido a la desorción de péptidos hidrolizados9,12, mientras que la lipólisis resulta en una reducción muy pronunciada de la tensión interfacial debido a la adsorción de sales biliares y lipasas 13. Un intercambio final de subfases con líquido intestinal agota la solución a granel de material no adsorbido / digerido y promueve la desorción de compuestos solubles y la solubilización de lípidos digeridos en micelas mixtas. Esto se cuantifica por el aumento de la tensión interfacial registrado (Figura 4B).

En resumen, el diseño experimental implementado en la gota colgante para simular la digestión in vitro en una sola gota permite medir los efectos acumulativos y las sinergias a medida que el proceso de digestión se aplica secuencialmente a la capa interfacial inicial10. La composición de cada medio digestivo puede ajustarse fácilmente para tener en cuenta las particularidades de las condiciones digestivas, incluidas las patologías gastrointestinales o los medios digestivos infantiles14. Luego, la identificación de los mecanismos interfaciales que afectan la proteólisis y la lipólisis se puede utilizar para modular la digestión mediante la ingeniería interfacial de emulsiones. Los resultados obtenidos se pueden aplicar en el diseño de matrices de nuevos alimentos con funcionalidades personalizadas como baja alergenicidad, ingesta de energía controlada y disminución de la digestibilidad 15,16,17,18,19.

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Protocol

1. Secuencia de limpieza para toda la cristalería utilizada en la experimentación científica de superficies

  1. Frote la cristalería con una solución de limpieza concentrada (consulte la Tabla de materiales) diluida en agua (10%).
  2. Enjuague bien con una secuencia de agua del grifo, propanol, agua destilada y agua ultrapura. Secar en una cabina y almacenar en un gabinete cerrado hasta su uso.

2. Preparación de la muestra

  1. Preparar los medios digestivos artificiales según los protocolos estandarizados INFOGEST 11,20 (ver Tabla de Materiales). Para más detalles, véase la Tabla 1 e incluir pequeñas adaptaciones a los requisitos del trabajo interfacial para evitar la contaminación tensioactiva y la dilución de muestras (1:10)10.
  2. Prepare la solución emulsionante siguiendo los pasos a continuación.
    1. Preparar 0,01 L de una solución concentrada de (1 kg· L-1) emulsionante o una mezcla de emulsionantes (ver Tabla de materiales) en un tampón inicial (Tabla 1) y mantener bajo agitación suave durante la noche.
    2. Diluir a 0,1 kg· L−1 (o según sea necesario) para saturar la interfaz; alcanzar una pseudo meseta en la tensión interfacial después de 1 h de adsorción en un área interfacial constante siguiendo el informe previamente publicado21.
    3. Mantener bajo agitación leve durante 15 minutos antes de su uso.
  3. Purificar la fase oleosa.
    1. Preparar una mezcla de aceite vegetal (girasol, oliva, trioleína, etc.) y resinas de metasilicato de magnesio (ver Tabla de materiales) en una proporción de 2:1 p/p en un vaso de precipitados grande. Mantener bajo agitación mecánica leve durante al menos 3 h.
    2. Centrifugar la mezcla a 8.000 x g durante 30 min a temperatura ambiente en una centrífuga comercial (ver Tabla de materiales).
    3. Filtrar la mezcla de aceite al vacío con un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,2 μm) (ver Tabla de materiales). Almacenar en botellas ámbar limpias selladas y burbujeadas con nitrógeno hasta su uso.

3. Calibración y limpieza del pulpo

  1. Enjuague todos los tubos con agua ultrapura estableciendo una secuencia de limpieza tanto de las jeringas como de todas las válvulas a través de un capilar (válvulas 6/4) y hasta la salida externa (válvula de color azul 8). Para ello, pulse el botón de limpieza del cuadro de diálogo de la izquierda (Figura suplementaria 1A).
  2. Compruebe la tensión superficial7 del agua a temperatura ambiente formando una gota de agua y midiendo en tiempo real durante 5 min (Figura suplementaria 1B, C).
    1. Ajuste la densidad diferencial a aire-agua (0,9982 kg· L−1) en el cuadro de diálogo de la izquierda, Figura suplementaria 1B.
  3. Llene la cubeta limpia (vidrio óptico) con 0,002 L de aceite vegetal limpio y colóquela en el soporte de la cubeta en la celda termostática (Figura 3).
  4. Ajuste el termostato y permita el equilibrio de temperatura a 37 °C.
  5. Compruebe la tensión interfacial del agua-aceite a temperatura ambiente7.
    1. Ajuste la densidad diferencial a aceite vegetal-agua (aceite de oliva: 0.800 kg· L−1) (Figura complementaria 1C).
    2. Inyecte 40 μL a una velocidad de 0,5 μL·s−1 y mida en tiempo real cada segundo hasta el final de la inyección. Se trata de un proceso dinámico sencillo (Figura suplementaria 1B, D).
    3. Trazar la tensión interfacial en función del volumen de gotas en una hoja de datos.
    4. Compruebe que el rango de volumen de gotas proporciona un valor para la tensión interfacial independiente del volumen de gotas. Trazar el área interfacial en función del volumen de gotas.
    5. Programe un proceso que contenga dos pasos (Figura suplementaria 1B y Figura complementaria 2A) siguiendo los pasos a continuación.
      1. Con una jeringa interior, inyecte un volumen contenido dentro de este rango de tensión interfacial constante.
      2. Mantener constante la zona interfacial en el valor seleccionado en el paso 3.5.4 y registrar la tensión interfacial durante 5 min7.

4. Programación de un proceso experimental en DINATEN para cada paso digestivo

NOTA: Para los parámetros de proceso, consulte la Figura suplementaria 1B.

  1. Realice el control inicial.
    1. Para la formación de gotas, inyecte 10 μL (±5 μL) de solución emulsionante en el capilar (válvula 6) (Figura complementaria 2A).
    2. Registrar la adsorción en un área interfacial constante21 de 20 mm 2 (±10 mm2) durante 1 h (Figura complementaria 2B).
    3. Registrar la reología dilatacional8 (Figura complementaria 2C).
      1. Ajuste la amplitud de oscilación a 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registrar la adsorción en la zona interfacial seleccionada (paso 4.1.2) durante 10 s.
      3. Repita el paso 4.1.3 en diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s y 100 s.
  2. Registrar la digestión gástrica.
    1. Registre la adsorción21 en el área interfacial seleccionada durante 10 s.
    2. Intercambio subfásico7 con líquido en válvula 2 (sSGF) y enzimas gástricas (Tabla 1) (Figura complementaria 2D).
      1. Llene la jeringa izquierda de la válvula 2. Inyectar 125 μL en la válvula 6-capilar con la jeringa izquierda a 5 μL·s−1.
      2. Extraer 125 μL del capilar con la jeringa derecha a 5 μL·s−1. Descargue la jeringa correcta para salir de la válvula 8. Repita los pasos 4.2.2.1-4.2.2.2 10 veces para asegurar el intercambio completo.
    3. Registrar la adsorción21 en el área interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 1 h (Figura complementaria 2B).
    4. Registrar la reología dilatacional8 (Figura complementaria 2C).
      1. Ajuste la amplitud de oscilación a 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registrar la adsorción del área interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 10 s. Repita en diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  3. Registrar la digestión intestinal.
    1. Registrar la adsorción21 en el área interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 10 s (Figura complementaria 2B).
    2. Intercambio subfásico7 con líquido en válvula 3 (sSIF) y enzimas intestinales/sales biliares/fosfolípidos (Tabla 1) (Figura complementaria 2D).
      1. Llene la jeringa izquierda de la válvula 2. Inyectar 125 μL en la válvula 6-capilar con la jeringa izquierda a 5 μL·s−1. Extraer 125 μL del capilar con la jeringa derecha a 5 μL·s−1.
      2. Descargue la jeringa correcta para salir de la válvula 8. Repita los pasos 4.3.2.1-4.3.2.2 10 veces para asegurar un intercambio completo.
    3. Registrar la adsorción21 en el área interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 1 h.
    4. Registrar la reología dilatacional8 (Figura complementaria 2C).
      1. Ajuste la amplitud de oscilación a 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registrar la adsorción en la zona interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 10 s.
      3. Repita en diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  4. Registre la desorción siguiendo los pasos a continuación.
    1. Registrar la adsorción21 en el área interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 10 s (Figura complementaria 2B).
    2. Intercambio de subfase7 con líquido en válvula 5 (sSIF) (Tabla 1, Figura complementaria 2D).
      1. Llene la jeringa izquierda de la válvula 5. Inyectar 125 μL en la válvula 5-capilar con la jeringa izquierda a 5 μL·s−1.
      2. Extraer 125 μL del capilar con la jeringa derecha a 5 μL·s−1. Descargue la jeringa correcta para salir de la válvula 8. Repita los pasos 4.4.2.1-4.4.2.2 10 veces para asegurar un intercambio completo.
    3. Registrar la adsorción21 en el área interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 1 h (Figura complementaria 2B).
    4. Registrar la reología dilatacional8 (Figura complementaria 2C).
      1. Mantener la amplitud de 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registrar la adsorción en la zona interfacial seleccionada en el paso 4.1.2 durante 10 s.
      3. Repita el paso 4.4.4 en diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.

5. Configuración del experimento

  1. Llene los tubos de microcentrífuga con los medios de digestión artificial y conecte cada uno de ellos a la válvula respectiva mediante el tubo correspondiente.
  2. Llene el tubo de las válvulas 2-5 limpiando desde la válvula 2, la válvula 3, la válvula 4 y la válvula 5 hasta la salida externa (válvula 8) (Figura suplementaria 1A).
  3. Llene el tubo en la válvula 1 limpiando de la válvula 1 a la válvula 6-capilar 5 veces.
  4. Coloque el capilar en la fase oleosa. Cargue la jeringa izquierda con la válvula 1 (solución inicial, Tabla 1).
  5. Comience a procesar secuencialmente el paso 4.1-inicial, el paso 4.2-gástrico, el paso 4.3-intestinos y el paso 4.4-desorción, guardando los datos al final de cada proceso.

6. Cálculo de los parámetros reológicos dilatacionales con el software de procesamiento de imágenes CONTACTO8

NOTA: Para más detalles, véase Maldonado-Valderrama et al.8.

  1. Cargue las imágenes correspondientes a la oscilación del área a una frecuencia y amplitud dadas (Figura complementaria 3A).
  2. Pulse Reología (Figura complementaria 3B) y obtenga los parámetros dilatacionales (Figura complementaria 3C).
  3. Copie y pegue los resultados en la hoja de cálculo de datos.

7. Trazar los resultados experimentales

  1. Recalcula la columna de tiempo en cada uno de los pasos del proceso de digestión añadiendo los últimos datos de la hora del paso anterior.
  2. Trazar la tensión interfacial frente al tiempo aditivo para cada uno de los pasos del proceso de digestión utilizado.
  3. Trazar la tensión interfacial final / elasticidad dilatacional y la viscosidad obtenida al final de cada paso frente a la fase de digestión: inicial, digestión gástrica, digestión duodenal y desorción.

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Representative Results

Esta sección muestra diferentes ejemplos de perfiles de digestión medidos con el pulpo. La apariencia general de las coincidencias del perfil de digestión simulado se muestra en la Figura 4B. La tensión interfacial generalmente se representa contra el tiempo en el perfil de digestión. Las diferentes fases / pasos de digestión considerados están representados en diferentes colores. La primera fase forma la capa inicial y corresponde a la fase de adsorción del emulsionante o proteína/tensioactivo/polímero, dependiendo de cada caso. Luego, los diferentes fluidos digestivos se inyectan por intercambio de subfases en una solución a granel que contiene los nuevos medios. La nueva subfase produce cambios en la tensión interfacial de la capa emulsionante inicial y en la reología dilatacional medida al final de cada paso digestivo. El proceso de digestión puede comprender un máximo de ocho pasos digestivos.

Figure 5
Figura 5: Ejemplo de perfiles de digestión gástrica. (A) Proteólisis gástrica de albúmina sérica humana. Los medios digestivos se aplican por intercambio de subfases con soluciones detalladas en la sección experimental a T = 37 °C. Azul: tampón inicial con proteína, rojo: sSGF con pepsina. Reproducido con permiso de del Castillo-Santaella et al.12. (B) Lipólisis gástrica de pectina cítrica. Los medios digestivos se aplican por intercambio de subfases con soluciones detalladas en la sección experimental a T = 37 °C. Azul: tampón inicial con pectina cítrica, amarillo: sSGF con lipasa gástrica, gris: sSGF. Reproducido con permiso de Infantes-Garcia et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 5 muestra algunos resultados experimentales obtenidos para la digestión gástrica de emulsionantes. En la Figura 5A, la albúmina sérica humana (HSA)12 se adsorbe primero en la interfaz aceite de oliva-agua, disminuyendo la tensión interfacial para alcanzar una meseta después de 1 h. Al final de esta fase, la reología se mide a 0,1 Hz (10 s) de frecuencia (período). En el segundo paso, sSGF con pepsina se agrega por intercambio de subfase. Consiste en introducir un volumen con una jeringa mientras se extrae el mismo volumen con la otra jeringa. De esta manera, el área de la gota no cambia, manteniendo los componentes adsorbidos irreversiblemente en la interfaz aceite-agua. El intercambio se repite entre 10-15 veces. Durante el intercambio de subfases con sSGF y pepsina, la tensión interfacial aumenta debido a la hidrólisis de la proteína, que diluye la capa proteica inicial (Figura 5A). En la Figura 5B, la pectina cítrica (CP)17 se adsorbe en el aceite de triglicéridos durante 40 min, seguida de reología dilatacional a 0,1 Hz. En el segundo paso, sSGF con lipasa gástrica se inyecta en la mayor parte de la gota; A diferencia de la proteólisis, la lipólisis da como resultado la adsorción de lipasa y la formación de ácidos grasos, que permanecen en la interfaz, reduciendo la tensión interfacial. La fase de desorción es el tercer paso, que evalúa la producción de productos hidrófilos o la solubilización de productos lipofílicos de lipólisis. La figura 5B muestra que el intercambio de subfases con sSGF proporciona una respuesta nula de la tensión interfacial. Esto puede interpretarse como la producción de productos digestivos lipofílicos, que se adsorben irreversiblemente y no se solubilizan, permaneciendo anclados en la interfaz. La ausencia de sales biliares en la fase gástrica es responsable de la falta de solubilización. El grado de lipólisis puede ser analizado cualitativamente por el valor de la tensión interfacial alcanzada.

Figure 6
Figura 6: Ejemplo de perfiles de digestión intestinal . (A) Perfiles de adsorción-desorción de sales biliares (cuadrados negros), lipasa (triángulos grises) y lipasa + sales biliares (romboides naranjas) en sSIF a 37 °C. Reproducido con permiso de Macierzanka et al.13. (B) Adsorción de sales biliares + lipasa sobre F68 previamente adsorbidas (verde oscuro) y F127 (verde claro), adsorción de sales biliares (amarillo) en sSIF. Desorción: intercambio de subfases con sSIF en sales biliares (naranja), F68 (púrpura oscuro) y F127 (púrpura claro). Reproducido con permiso de Torcello-Gómez et al.19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 6 muestra los resultados experimentales obtenidos para la digestión intestinal de emulsionantes. A diferencia de la digestión gástrica, la presencia de sales biliares en el intestino delgado ofrece diferentes perfiles de desorción tras el intercambio de subfases con sSIF y el agotamiento de la solución a granel. La Figura 6A muestra los perfiles de desorción obtenidos para sales biliares puras, lipasa pura y sales mixtas lipasa/bilis 8,9,10,13. Las sales biliares se adsorben reversiblemente en la interfaz aceite-agua, y por lo tanto, se desorban completamente en el intercambio de subfases con sSIF, como lo indica el aumento de la tensión interfacial para alcanzar el valor de la interfaz aceite-agua desnuda 8,13. Por el contrario, la lipasa se adsorbe irreversiblemente, dada por el valor constante de la tensión interfacial después del intercambio de subfases por sSIF. La mezcla de lipasa y sales biliares proporciona un perfil de desorción intermedio cuantificado por un aumento limitado de la tensión interfacial tras el intercambio de subfases por sSIF a un valor intermedio. La capa interfacial restante contiene lipasa y ácidos grasos libres. Las sales biliares posiblemente se desoraron de la interfaz y solubilizaron algunos de los ácidos grasos libres formados en la lipólisis. La figura 6B muestra la evolución de la tensión interfacial tras la lipólisis de dos variantes de Pluronic: F127 y F6819. La Figura 6B muestra una fuerte disminución de la tensión interfacial debido a la adsorción de lipasa y sales biliares y la producción de ácidos grasos libres sobre películas interfaciales previamente formadas de F68 y F127 en la interfaz aceite-agua. La etapa de desorción muestra el aumento de la tensión interfacial causado por el intercambio de subfases con sSIF, que cuantifica la solubilización de productos lipolíticos.

Figure 7
Figura 7: Ejemplo de perfiles dinámicos completos de digestión gastrointestinal. (A) Perfil de digestión in vitro de película adsorbida AS-48 en la interfaz aire-agua. Los medios digestivos se aplican por intercambio de subfases con soluciones detalladas en la sección experimental a T = 37 °C. Control: tampón inicial con AS-48, pepsina: sSGF con pepsina, tripsina: sSIF con tripsina + quimotripsina, desorción: sSIF. Reproducido con permiso de del Castillo-Santaella et al.18. (B) Perfil de digestión in vitro de películas adsorbidas con albúmina sérica humana y bovina en la interfaz aceite de oliva y agua. Los medios digestivos se aplican por intercambio de subfases con soluciones detalladas en la sección experimental a T = 37 °C. Control: tampón inicial con HSA/BSA, pepsina: sSGF con pepsina, tripsina: sSIF con tripsina + quimotripsina, lipólisis: sSIF con lipasa y sales biliares, desorción: sSIF. Las curvas trazadas son experimentos representativos con desviaciones <5%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 7 muestra ejemplos de perfiles de digestión simulados completos. La Figura 7A muestra el perfil de digestión del bioconservante alimentario AS-48 adsorbido en la interfaz aire-agua18. El proceso digestivo fue diseñado para centrarse en la proteólisis de este péptido, mientras que la lipólisis del aceite no era necesaria, estando en la interfaz aire-agua. Por lo tanto, la digestión simulada en la Figura 7A comprende cinco pasos: control / película inicial, pepsinólisis, tripsinólisis y desorción. Los resultados experimentales mostraron que esta bacteriocina es resistente tanto a la hidrólisis de pepsina como a la tripsina, ya que la tensión superficial se mantuvo sin cambios. En consecuencia, AS-48 se consideró un buen bioconservante alimentario resistente a la digestión in vitro . La Figura 7B compara los perfiles de digestión in vitro de capas adsorbidas de albúminas séricas humanas y bovinas adsorbidas en la interfaz aceite-agua22. Esta simulación fue diseñada para imitar la digestibilidad de emulsiones estabilizadas por estas dos proteínas23 y evaluar la encapsulación de la curcumina4. Por lo tanto, la digestión simulada se personalizó y comprendió cinco pasos: control / inicial, pepsinólisis, tripsinólisis, lipólisis y desorción. Los resultados experimentales mostraron un aumento de la tensión interfacial después de la digestión de la pepsina, lo que indica una mayor susceptibilidad a la pepsinólisis. Esto se atribuyó al aumento del despliegue de la variante bovina tras la adsorción, exponiendo sitios susceptibles a la pepsina. Luego, la tripsinólisis y la lipólisis proporcionaron perfiles de digestión completamente similares (Figura 7B).

Figure 8
Figura 8: Ejemplo de valores finales de digestión gastrointestinal. (A) Tensión interfacial, (B) elasticidad dilatacional, (C) viscosidad dilatacional de la digestión in vitro de la película adsorbida de β-lactoglobulina en la interfaz aceite de oliva-agua. Los parámetros dilatacionales se midieron a 1 Hz, 0,1 Hz y 0,01 Hz después de que la interfaz digerida se equilibró en cada paso. Los medios digestivos se aplican por intercambio de subfases con soluciones detalladas en la sección experimental a T = 37 °C. Control: tampón inicial con proteína, pepsina: sSGF con pepsina, tripsina: sSIF con tripsina + quimotripsina, lipólisis: sSIF con lipasa y sales biliares, desorción: sSIF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En general, con el fin de evaluar y comparar la naturaleza de diferentes capas interfaciales digeridas, se grafica la tensión interfacial final y la elasticidad/viscosidad dilatacional obtenida para las interfaces digeridas para cada uno de los pasos considerados en el proceso de digestión diseñado. La Figura 8 muestra la tensión interfacial (Figura 8A), la elasticidad dilatacional (Figura 8B) y la viscosidad dilatacional (Figura 8C), medida a frecuencias de 1 Hz, 0,1 Hz y 0,01 Hz. Los valores trazados fueron obtenidos después de cada paso digestivo de β-lactoglobulina adsorbida en la interfaz aceite-agua16. La figura 8A muestra que la proteólisis (pepsina y tripsina) produce pequeños aumentos en la tensión interfacial, mientras que la lipólisis reduce este valor y la desorción aumenta nuevamente. En cuanto a la elasticidad dilatacional, la proteína forma películas elásticas e interconectadas en la interfaz aceite-agua. La presencia de sales biliares produce películas interfaciales altamente móviles y fluidas con baja elasticidad. Finalmente, los productos lipolíticos restantes no pueden desarrollar una película elástica cohesiva después de la desorción. La elasticidad dilatacional aumenta ligeramente con la frecuencia de oscilación (Figura 8B). Finalmente, la viscosidad dilatacional de las películas interfaciales que se muestran en la Figura 8C solo es detectable a la frecuencia más baja y detecta la existencia de múltiples capas, agregados u otras estructuras disipativas en la interfaz. La comparación del perfil digestivo de la β-lactoglobulina con el perfil de digestión obtenido para la β-lactoglobulina tratada con pulsos mostró una mejor digestibilidad de las proteínas sometidas a este tipo de tratamiento físico16.

Búfer inicial 0.00113 mol L-1 NaH2PO4, pH 7.0
Fluido gástrico simulado simplificado (sSGF) [NaH2PO4] = 0.00113 mol L-1, [NaCl] = 0.15 mol L-1, pH 3.0
Fluido intestinal simulado simplificado (sSIF) [NaH 2 PO4] =0.00113 mol L-1, [NaCl] = 0.15 mol L-1, [CaCl2] = 0.003 mol L-1, pH 7.0
Enzimas gástricas pepsina (50 ∙ 10 3 U L-1), lipasa gástrica (0,5 ∙ 103 U L-1)
Enzimas intestinales tripsina (2.5 ∙ 10 3 U L-1), quimotripsina (0.625 ∙ 10 3 U L-1), lipasa pancreática (50∙ 10 3 U L-1), colipasa (150 ∙ 10 3 U L-1)
Mezcla de sales biliares 0.01 mol L-1 M. Mezcla de sales biliares: Taurocolato de sodio y desoxicolato de sodio (50/50) o taurocolato de sodio y glicodesoxicolato de sodio (50/50)

Tabla 1: Composición de los medios digestivos artificiales.

Figura complementaria 1: Operaciones básicas de la interfaz informática DINATEN. (A) Apariencia general de la interfaz de computadora DINATEN; El cuadro de diálogo de la izquierda muestra las dos jeringas conectadas a todas las válvulas y controla la inyección/extracción y limpieza. El cuadro de diálogo central contiene el comando, la imagen de colocación y la tabla con resultados. (B) El cálculo en tiempo real proporciona una medición automática en función del tiempo. (C) Comando izquierdo para incluir la densidad diferencial. (D) Un proceso dinámico simple controla el volumen de inyección/extracción, la velocidad y los tiempos de captura. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: La interfaz para programar cada paso digestivo (proceso). (A) Formación de gotas con una jeringa izquierda de volumen fijo y velocidad de inyección fija. (B) Adsorción en el área interfacial constante: control. (C) Reología con amplitud, período y número de ciclos fijos. (D) Intercambio de subfases: inyectar y extraer con ambas jeringas a la misma velocidad. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Cálculo de los parámetros dilatacionales con el software para análisis de imagen CONTACTO. (A) Análisis de las imágenes correspondientes a la oscilación en un período determinado. (B) Cálculo de los parámetros dilatacionales de la capa interfacial de las imágenes seleccionadas. (C) Diálogo que muestra los resultados del análisis dilatacional. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este artículo describe un protocolo generalizado para medir la digestión in vitro de capas interfaciales mediante el uso de equipos de gota colgante. El protocolo se puede ajustar a los requisitos específicos del experimento ajustando la composición de los tampones digestivos, que se basan en el protocolo armonizado INFOGEST11,20 para facilitar la comparación con la literatura. Las enzimas digestivas y los biosurfactantes se pueden agregar individualmente, secuencialmente o juntos. Esta última opción debe llevarse a cabo con cuidado ya que la saturación de la capa interfacial dificultaría los diferentes fenómenos al proporcionar una tensión interfacial muy baja y podría causar la caída de la gota. Para poder analizar el efecto de cada componente digestivo, las diferentes enzimas digestivas se añaden secuencialmente y en diferentes concentraciones. De esta manera, se pueden analizar y sistematizar los efectos de cada componente, y las sinergias se evalúan mediante adición secuencial. Además, para evitar que las gotitas caigan, algunas concentraciones se diluyen9. Los resultados obtenidos no se pueden extrapolar directamente a sistemas emulsionados, ya que las condiciones se ajustan para tener en cuenta un sistema simplificado. Sin embargo, la evolución de la tensión interfacial muestra la evolución de la cobertura interfacial a medida que se digiere la capa interfacial10. Del mismo modo, la evolución de la reología dilatacional proporciona algunas informaciones sobre las propiedades mecánicas de la interfaz a medida que avanza la digestión9. Estos resultados contienen información útil que puede ser adaptada e interpretada cuidadosamente para ser aplicada a sistemas emulsionados.

El equipo de caída colgante permite la evaluación de eventos in situ que ocurren específicamente en la capa interfacial, como se muestra en la Figura 2. Primero, se forma una capa interfacial inicial, que representa una sola gota de emulsión. Esta capa inicial se somete a diferentes condiciones digestivas y cambia su composición secuencialmente debido a la presencia de los diferentes componentes en la fase acuosa. Además, las lipasas deben superar esta capa interfacial para acceder a la fase oleosa e hidrolizar la grasa. Estos eventos interfaciales deben evaluarse en la misma capa interfacial creada inicialmente. Someter una emulsión a digestión in vitro permitiría el muestreo en diferentes momentos y la evaluación de los cambios en la emulsión a medida que se digiere (tamaño de gota, potencial zeta), pero no permitiría la evaluación in situ de la capa interfacial que rodea cada gota de emulsión. Por lo tanto, el equipo de caída colgante implementado con intercambio multisubfásico comprende una técnica complementaria para enfocarse en la ingeniería interfacial de emulsiones14.

La primera limitación de esta metodología está precisamente relacionada con la saturación de la capa interfacial con productos variados, que necesitan ser diluidos para evitar la caída de la gota. Otra cuestión experimental es la desgasificación de todos los medios artificiales para evitar la nucleación de burbujas, que también podrían causar el desprendimiento de gotas del capilar. También es importante considerar la mayor proporción de aceite-agua en comparación con los sistemas de emulsión cuando se extrapola a sistemas emulsionados. Finalmente, aunque la reología dilatacional contiene información sobre las asociaciones inter e intramoleculares dentro de la capa interfacial, formadas e interrumpidas por enzimas digestivas, es difícil de interpretar y extrapolar a la estabilidad de la emulsión. En total, la gota colgante implementada con un dispositivo de intercambio multisubfásico es un equipo útil para complementar los estudios de digestión in vitro de emulsiones12, que siguen la evolución de la distribución del tamaño de las gotas y el potencial zeta de la digestión de proteínas con electroforesis22. Las modificaciones del tracto digestivo para tener en cuenta la variación de género, la digestión infantil o los problemas digestivos comprenden aplicaciones futuras del procedimiento experimental.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros conocidos en competencia o relaciones personales que podrían haber influido en el trabajo reportado en este documento.

Acknowledgments

Esta investigación ha sido financiada por los proyectos RTI2018-101309-B-C21 y PID2020-631-116615RAI00, financiados por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y por "FEDER Una forma de hacer Europa". Este trabajo fue (parcialmente) apoyado por el Grupo de Biocoloide y Física de Fluidos (ref. PAI-FQM115) de la Universidad de Granada (España).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

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References

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Bioquímica Número 189
<em>In vitro</em> Digestión de emulsiones en una sola gota <em>a través</em> del intercambio multifásico de fluidos gastrointestinales simulados
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