Summary
تقدم هذه الورقة البروتوكولات خطوة بخطوة لطفرات كريسبر / كاس 9 لذبابة الفاكهة الشرقية باكتروسيرا الظهرية. ستكون الخطوات التفصيلية التي يوفرها هذا البروتوكول الموحد بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للدراسات الجينية الوظيفية في B. dorsalis.
Abstract
ذبابة الفاكهة الشرقية ، Bactrocera dorsalis ، هي نوع من الآفات شديدة التوغل والتكيف التي تسبب أضرارا للحمضيات وأكثر من 150 محصولا آخر من محاصيل الفاكهة في جميع أنحاء العالم. نظرا لأن ذباب الفاكهة البالغ لديه قدرة طيران كبيرة وتضع الإناث بيضها تحت جلود الفاكهة ، فإن المبيدات الحشرية التي تتطلب اتصالا مباشرا بالآفة عادة ما يكون أداؤها ضعيفا في الحقل. مع تطور الأدوات البيولوجية الجزيئية وتكنولوجيا التسلسل عالية الإنتاجية ، يحاول العديد من العلماء تطوير استراتيجيات صديقة للبيئة لإدارة الآفات. وتشمل هذه RNAi أو مبيدات الآفات القائمة على تحرير الجينات التي تقلل من تنظيم أو إسكات الجينات (الأهداف الجزيئية) ، مثل الجينات الشمية المشاركة في سلوك البحث ، في الآفات الحشرية المختلفة. لتكييف هذه الاستراتيجيات لمكافحة ذبابة الفاكهة الشرقية ، هناك حاجة إلى طرق فعالة للبحث الجيني الوظيفي. تعمل الجينات ذات الوظائف الحاسمة في بقاء وتكاثر B. dorsalis كأهداف جزيئية جيدة لضربة قاضية للجينات و / أو إسكاتها. نظام كريسبر / كاس 9 هو تقنية موثوقة تستخدم لتحرير الجينات ، وخاصة في الحشرات. تقدم هذه الورقة طريقة منهجية لتكاثر كريسبر / كاس 9 لبكتيريا B. dorsalis ، بما في ذلك تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الموجه ، وجمع الأجنة ، وحقن الأجنة ، وتربية الحشرات ، وفحص الطفرات. ستكون هذه البروتوكولات بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للباحثين المهتمين بدراسات الجينات الوظيفية في B. dorsalis.
Introduction
ذبابة الفاكهة الشرقية ، Bactrocera dorsalis ، هي نوع من الآفات الحشرية العالمية التي تسبب أضرارا لأكثر من 150 نوعا من محاصيل الفاكهة ، بما في ذلك الجوافة والمانجو و Eugenia spp. وكرز سورينام والحمضيات وإسكدنيا والبابايا1. تقدر الأضرار الناجمة في مقاطعة قوانغدونغ (الصين) وحدها بأكثر من 200 مليون يوان. تقوم الإناث البالغات بإدخال بيضها تحت جلد الثمار الناضجة أو الناضجة ، مما يتسبب في تسوس الثمار وانقطاعها ، مما يقلل من جودة الثمار والمحصول الإجمالي للمحصول2. نظرا لأن ذباب الفاكهة البالغ لديه قدرة طيران كبيرة ويرقاتها تثقب في جلد الفاكهة ، فإن المبيدات الحشرية التي تتطلب اتصالا مباشرا بالآفة تؤدي أداء ضعيفا في الحقل. بالإضافة إلى ذلك ، أدى الاستخدام المكثف للمبيدات الحشرية إلى زيادة مقاومة B. dorsalis ضد المواد الكيميائية الزراعية المختلفة ، مما يجعل السيطرة على هذه الآفات الضارة أكثر صعوبة3. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير استراتيجيات فعالة وصديقة للبيئة لإدارة الآفات.
في الآونة الأخيرة ، مع تطوير الأدوات البيولوجية الجزيئية وتقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، يحاول العلماء تطوير استراتيجيات صديقة للبيئة لإدارة الآفات ، مثل RNAi ، التي تستهدف وظائف الجينات المهمة (الأهداف الجزيئية) لمختلف الآفات الحشرية. يمكن تحديد الجينات التي تعتبر حاسمة لبقاء الآفة وتكاثرها من خلال الدراسات الجينية الوظيفية وتعمل أيضا كأهداف جزيئية محتملة لتحسين أدوات إدارة الآفات المستهدفة والصديقة للبيئة على وجه التحديد4. لتكييف مثل هذه الاستراتيجيات مع مكافحة ذبابة الفاكهة الشرقية ، هناك حاجة إلى طرق فعالة لأبحاث الجينات الوظيفية.
تم اكتشاف نظام CRISPR / Cas (متجمع بانتظام بين التكرارات القصيرة المتباعدة / المرتبطة ب CRISPR) في البداية في البكتيريا والعتائق ووجد أنه آلية تكيفية تشارك في التعرف على الحمض النووي الأجنبي داخل الخلايا وتدهوره ، مثل تلك التي يتم إدخالها عن طريق إصابة البكتيريا5. في نظام كريسبر من النوع الثاني ، يتم توجيه النوكلياز الداخلي Cas9 بواسطة الحمض النووي الريبي الصغير المرتبط (crRNA و tracrRNA) لشق الحمض النووي6،7،8 وأصبح أحد أكثر الأدوات استخداما لتحرير الجينات حتى الآن9،10،11،12. نظرا لأن نظام CRISPR / Cas9 يتمتع بالعديد من المزايا ، مثل الكفاءة العالية لإسكات الجينات والتكلفة المنخفضة ، فقد تم تطبيقه بالفعل لتحرير الجينات في أنواع مختلفة من الحشرات ، بما في ذلك Aedes aegypti 13,14 و Locusta migratoria15 و Bombyx mori16. في B. dorsalis ، تم التخلص بنجاح من الجينات المتعلقة بلون الجسم ، وإزدواج شكل الجناح ، وتحديد الجنس باستخدام CRISPR / Cas917،18،19. ومع ذلك ، فإن الإجراءات التفصيلية لتطبيق CRISPR / Cas9 في هذه الحشرة لا تزال غير مكتملة. علاوة على ذلك ، فإن بعض الخطوات التي قدمها الباحثون لتحرير جين B. dorsalis متنوعة أيضا وتحتاج إلى توحيد قياسي. على سبيل المثال ، كانت أشكال Cas9 مختلفة في المراجع المنشورة17،18،19.
تقدم هذه الورقة طريقة منهجية لتكاثر B. dorsalis باستخدام نظام CRISPR / Cas9 ، بما في ذلك تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الموجه ، وجمع الأجنة ، وحقن الأجنة ، وتربية الحشرات ، وفحص الطفرات. سيكون هذا البروتوكول بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للباحثين المهتمين بدراسات الجينات الوظيفية في B. dorsalis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم الهدف والتوليف في المختبر من sgRNA
- توقع بنية الجينات المستهدفة ذات الأهمية وحدد الحدود بين الإكسونات والإنترونات عبر التحليل المعلوماتي الحيوي لجينوم B. dorsalis (يتم سرد تطبيقات البرامج المستخدمة هنا في جدول المواد).
ملاحظة: تم استخدام BLAT20 للبحث عن مواقع الجينات المحتملة في الجينوم. تمت محاذاة قراءات RNA-seq عالية الجودة (transcriptome) مع مواضع الجينات المكتسبة باستخدام Hisat221. تم استخدام Samtools22 لإنشاء ملفات bam التي تم فرزها. تم إدخال ملفات bam التي تم فرزها إلى Stringtie223 لتوفير نصوص التجميع. تم دمج نسخ التجميع ومعلومات مواقع الجينات بواسطة Transdecoder24. تم تصور النتائج التي تم الحصول عليها من Transdecoder في أدوات IGV25 ويمكن تحديد الحدود بين exons و introns. - تحديد المناطق المستهدفة المناسبة داخل موقع الجين المستهدف المرشح. يجب أن يكون الطول الإجمالي أقل من 750 نقطة أساس لتسلسل أكثر ملاءمة (الشكل 1 ب). تصميم بادئات محددة لتضخيم المنطقة المستهدفة من الحمض النووي الجينومي من النوع البري بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 1B) (البرايمر: F-primer: AACATTGAATCTGGAATCAGGTAAACT ، R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في ناقل نهائي غير حاد26 واختيار 20 مستعمرة بكتيرية فردية للتسلسل لتحديد مدى الحفاظ على المنطقة المستهدفة في مجموعات الحشرات المختبرية.
- يحتوي الموقع المستهدف النموذجي على شكل تسلسل ثلاثي النوكليوتيدات (NGG أو CCN) وتسلسل 20 نقطة أساس مجاور لأشكال NGG أو CCN (20 bp-NGG أو CCN-20 bp). تفجير المواقع المستهدفة المرشحة ضد جينوم B. dorsalis والتأكد من أن الكفاءة المتوقعة عالية بما يكفي وأن معدل الاستهداف خارج الاستهداف منخفض ؛ يمكن للعديد من البرامج مفتوحة المصدر التنبؤ بذلك تلقائيا. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام sgRNAcas9 -الذكاء الاصطناعي27 لتحديد وتقييم الأهداف المثلى. يمكن العثور على تفاصيل الاستخدام في دليل هذا البرنامج.
ملاحظة: يفضل المواقع المستهدفة المحتملة المغلقة أمام 5 'UTR للجين المستهدف و 1-2 Gs في بداية تسلسل 20 bp. من أجل تحقيق حذف كبير سيتم تحديده بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل متبوعا بالرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، يوصى بتصميم هدفين28 مفصولين بأكثر من 100 نقطة أساس (الشكل 1C). - استخدم مجموعة توليف gRNA المتاحة تجاريا لإنشاء sgRNA المصمم. نفذ كل خطوة باتباع دليل المستخدم. أعد تعليق منتج gRNA في ماء خال من النيوكلياز ، وحدد التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV-Vis ، وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام (تركيز gRNA الفردي الذي تم تصنيعه بنجاح [10 ميكرولتر] مع المجموعة المستخدمة هنا حوالي 4000-6000 نانوغرام / ميكرولتر ، أو حتى أعلى).
ملاحظة: على الرغم من أن توليد الذباب الطافر هو الخطوة الأولى لكل باحث ، إلا أن التحكم السلبي المناسب للتجربة / التحليل النهائي أمر بالغ الأهمية. إن إنشاء هذه الضوابط جنبا إلى جنب مع المسوخ يوفر للباحثين الوقت والجهد. على سبيل المثال ، قم بتعيين sgRNA المخفوق كعنصر تحكم سلبي.
2. جمع الأجنة وإعدادها
- ضع الشرانق الظهرية في أقفاص بلاستيكية. قدم خليطا من السكر والخميرة (1: 1) كغذاء مع مصدر للمياه بعد أن يغلق البالغون (الشكل 2 أ ، ب). ظروف التربية هي 55٪ رطوبة نسبية (RH) ، 26.5 درجة مئوية ، ودورة 14:10 لتر / يوم (تضيء الأنوار في السادسة صباحا ، وتنطفئ الأنوار في الثامنة مساء).
- يصل معظم البالغين إلى مرحلة النضج الجنسي بعد 10 أيام من ظهورهم. توفير بيئة مناسبة لمساعدة الذباب البالغ على التزاوج قدر الإمكان. من الناحية المثالية ، استخدم حاملا خفيفا بضوء 30-50 لوكس. هذا يمكن أن يحسن خصوبة الإناث ، وبالتالي تحسين كفاءة جمع الأجنة.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي وضع البالغين (الذين تتراوح أعمارهم بين 5-6 أيام بعد ظهورهم) في بيئة مضاءة بشكل خافت (<100 لوكس) إلى تعزيز التزاوج. بشكل عام ، تحدث ذروة وضع البيض في الساعة 03:00 مساء (14:10 / L: D ، الأضواء في الساعة 06:00 صباحا ، الأضواء مطفأة في الساعة 08:00 مساء) ؛ للحصول على ما يكفي من الأجنة ، يوصى بوضع غرف وضع البيض في الأقفاص قبل 30 دقيقة من الساعة 03:00 مساء. - ضع شاشا من 200 شبكة في غرفة وضع البيض ، على بعد 1-2 مم من غطاء الغرفة. هذا سوف يساعد في الحصول على أكبر عدد ممكن من الأجنة.
ملاحظة: تجنب ترك الأجنة تنقع في عصير البرتقال أو تفرك بالشاش ، لأن هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من معدل بقاء الأجنة. - ضع حجرة جديدة لوضع البيض في القفص عندما يكون إعداد الحقن المجهري جاهزا. اجمع الأجنة كل 10 دقائق باستخدام فرشاة مبللة دقيقة ، ثم اصطفها على صفيحة حقن ذاتية الصنع (زجاج شبكي بطول 55 مم وعرض 13.75 مم وارتفاع 5 مم ، يتم فتح أخدود ضحل 45 مم × 5 مم × 0.3 مم في المنتصف لتسهيل وضع البيض). إذا كانت الأجنة ذات ضغط داخلي مرتفع ، فإن الجفاف الطفيف عند <10٪ RH لمدة 10 دقائق يكون اختياريا. اغمس الأجنة في زيت الهالوكربون أثناء الحقن لتجنب المزيد من الجفاف (الشكل 2 ج).
3. الحقن المجهري للجنين
- تحضير إبرة حقن الزجاج باستخدام مجتذب micropipette.
ملاحظة: من المهم تعيين المعلمات باتباع دليل المستخدم. في هذه البروتوكولات ، يمكن عمل أشكال إبرة مختلفة باستخدام المعلمات التي اقترحها دليل مجتذب الماصة الدقيقة. يجب أن تكون الشعيرات الدموية الزجاجية نظيفة قدر الإمكان لمنع الغبار من انسداد الإبرة. - تحضير حل العمل. امزج بروتين Cas9 و sgRNA المقابل لتركيزات العمل التالية: sgRNA ، 300 نانوغرام / ميكرولتر ؛ بروتين Cas9 ، 150 نانوغرام / ميكرولتر. أضف 1 ميكرولتر من الفينول الأحمر إلى الخليط ليكون بمثابة طريقة ملائمة لتمييز الأجنة المحقونة. ضع الخليط المحضر على الثلج لتجنب تدهور sgRNA.
ملاحظة: استخدم أطراف ماصة خالية من النيوكلياز وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب أن يكون تركيز بروتين Cas9 أقل من أو يساوي 150 نانوغرام / ميكرولتر ؛ التركيزات الأعلى سامة وتقلل بشكل كبير من معدل بقاء الجنين. يمكن أيضا تسليم Cas9 بتنسيق DNA أو mRNA لتحقيق تحرير جيني ناجح17,19. في هذا البروتوكول ، يوصى باستخدام بروتين Cas9 لأن mRNAs عرضة للتحلل ، ويستغرق التعبير عن بروتين Cas9 من الحمض النووي البلازميد وقتا للنسخ والترجمة. - اضبط معلمات الحاقن. البرنامج الأولي هو Pi-500 hPa و Ti-0.5 s و PC-200 hPa. اضبط هذه المعلمات بشكل أكبر حسب الحاجة أثناء الحقن المجهري.
- أضف 3 ميكرولتر من الخليط إلى إبرة الحقن. تجنب إدخال فقاعات الهواء التي يمكن أن تسد الإبرة. افتح الإبرة باستخدام مطحنة دقيقة.
- قم بتوصيل الإبرة بالمعالج الدقيق وفقا لدليل المستخدم (الشكل 2E).
- ضع اللوحة مع الأجنة المصطفة على الطاولة الموضوعية. اضبط موضع الماصة الدقيقة تحت مجهر بصري دقيق ، مع وضع الماصة الدقيقة والجنين على نفس المستوى. اضبط مستوى صوت القطرة بالضغط على الدواسة ؛ يوصى بحجم 1/10 حجم الأجنة.
- أدخل طرف الإبرة في الجزء الخلفي (القطب النباتي) للجنين. قم بتوصيل المخاليط إلى الجنين عن طريق الضغط على الدواسة من الحاقن. إذا تمت إضافة الفينول الأحمر ، لوحظ لون ضارب إلى الحمرة قليلا على الفور.
ملاحظة: حجم صغير من التدفق العكسي السيتوبلازمي من الثقب لن يقلل من معدل بقاء الجنين. حقن 200 جنين يكفي لنجاح طفرات جين واحد. يمكن أن تؤدي إضافة المزيد من زيت الهالوكربون لتغمر الأجنة إلى منع المزيد من الجفاف. يجب إجراء الحقن قبل تكوين خلية القطب ، مما يضمن إمكانية توريث كل طفرة بكفاءة.
4. تربية الحشرات بعد الحقن
- ضع لوحة الحقن مع الأجنة المحقونة في غرفة مناخية اصطناعية محفوظة عند رطوبة نسبية 55٪ و 26.5 درجة مئوية ودورة 14:10 لتر / يوم (تضيء الأضواء في السادسة صباحا ، وتطفئ الأنوار في الثامنة مساء).
- بعد الحقن ، يستغرق تكوين الجنين عادة 24 ساعة حتى يكتمل و 36 ساعة حتى يفقس. استخدم فرشاة ذات طرف رفيع لنقل اليرقات إلى نظام غذائي معد لليرقات. اجمع اليرقات ثلاث أو أربع مرات يوميا حتى لا تفقس المزيد من اليرقات. بشكل عام ، تستغرق اليرقات 2-3 أيام لإنهاء الفقس وتشرنق في غضون 7 أيام.
ملاحظة: تم استخدام نظام غذائي قائم على الذرة لإطعام اليرقات. تحتوي الوصفة على 150 غرام من دقيق الذرة ، و 150 غرام من الموز ، و 0.6 غرام من بنزوات الصوديوم ، و 30 غرام من الخميرة ، و 30 غرام من السكروز ، و 30 غرام من منشفة ورقية ، و 1.2 مل من حمض الهيدروكلوريك ، و 300 مل من الماء29. تقليل الوقت الذي تترك فيه اليرقات في الزيت (<2 ساعة). انقل اليرقات إلى النظام الغذائي مباشرة بعد الفقس قدر الإمكان. هذا يمكن أن يزيد بشكل كبير من معدلات البقاء على قيد الحياة و pupation. لا تقدم الكثير من النظام الغذائي (اتباع نظام غذائي مع 2/3 من طبق بتري 90 ملم يكفي ل 30 يرقات) ؛ خلاف ذلك ، سوف تصبح متعفنة وتقلل من معدل بقاء اليرقات. - ضع اليرقات الناضجة في الرمال الرطبة لتتشرنق. تستغرق مرحلة التشرد حوالي 10 أيام. انقل الشرانق إلى أقفاص بلاستيكية قبل أن يبدأ الانفعال.
5. فحص الطفرات
- يوضح الشكل 3 أ مخططا انسيابيا للفحص الطافر. عبر G0 البالغين التي تم الحصول عليها عن طريق الحقن المجهري مع البالغين من النوع البري للحصول على خطوط متغاير الزيجوت. تحقق من نوع الطفرات التي يحملها النسل (G1) عن طريق التنميط الجيني.
- العبور الذاتي G1 مع نفس النمط الجيني الطافر للحصول على خطوط متماثلة الزيجوت في G2. إذا كانت الأنماط الجينية للمتحولات في G1 مختلفة تماما ، فقم بعبور الزيجوتات غير المتجانسة مع الذباب من النوع البري. عادة ما يتم الحصول على خطوط متماثلة الزيجوت في G3. حافظ على خطين أو ثلاثة خطوط متماثلة الزيجوت لتجارب التنميط الظاهري اللاحقة.
- استخدم الحمض النووي الجينومي من بوباريوم جديد أو ساق واحدة في منتصف الساق من البالغين الفرديين لإجراء التنميط الجيني. تصميم مواد أولية محددة لتضخيم المنطقة المستهدفة ؛ يجب أن تحدد البادئات ما لا يقل عن 50 نقطة أساس في المنبع والمصب للموقع المستهدف. راجع الخطوة 1.2 للحصول على تفاصيل التمهيدي.
ملاحظة: نظرا لأن كمية الحمض النووي في puparium منخفضة للغاية ، يوصى باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا. - قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام ظروف ركوب الدراجات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، تليها 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 15 ثانية عند درجة حرارة التلدين المناسبة للبادئات المصممة ، 72 درجة مئوية لمدة 35 ثانية ، تليها تمديد نهائي 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تسلسل منتجات PCR المنقى. عند اكتشاف قمم متداخلة متعددة مجاورة للموقع المستهدف (الشكل 3 ب) ، تحدث طفرات ناجحة. استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى في ناقل غير حاد واختيار 10 مستعمرات بكتيرية فردية للتسلسل للتحقق من النمط الجيني للطفرات. حافظ على الخطوط مع طفرات إزاحة الإطار ونهايات الترجمة المبكرة (الشكل 3 ج).
ملاحظة: ليست هناك حاجة لإجراء تسلسل استنساخ واحد للتحقق من النمط الجيني لأفراد G0. ما عليك سوى تسلسل منتجات PCR والحفاظ على الأفراد الذين لديهم قمم تداخل متعددة واضحة مجاورة للموقع المستهدف. بعد الحقن الأولي ، يوصى باختيار 10 أجنة لاستخراج الحمض النووي الجيني وتسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بناء على المعايير الواردة في الخطوة 5.3. هذا يمكن أن يساعد في التنبؤ بمعدلات الطفرات مقدما. في هذه الدراسة ، تم إجراء تسلسل سانجر لتحديد النمط الجيني بواسطة شركة تسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقدم هذا البروتوكول خطوات مفصلة لتطوير طفرات B. dorsalis باستخدام تقنية CRISPR / Cas9 ، بما في ذلك النتائج التمثيلية من اختيار gDNA ، وجمع الأجنة والحقن المجهري ، وصيانة الحشرات ، وفحص الطفرات.
يقع مثال الموقع المستهدف للجين المحدد في إكسون الثالث (الشكل 1C). هذا الموقع محفوظ للغاية ، وتم اكتشاف نطاق واحد عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي لقالب الحمض النووي ل gRNA الاصطناعي (الشكل 1D) و gRNA الذي تم الحصول عليه عن طريق النسخ في المختبر (الشكل 1E).
تم الحقن في 200 بيضة تم حصادها حديثا كما هو موضح في القسم 3. تم الحفاظ على الأجنة باتباع البروتوكولات الموضحة في الخطوات 4.1-4.3. كما تم اكتشافه من خلال تسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فإن 80٪ من أفراد G0 هم طفرات فسيفساء (الجدول 1). هنا ، تم اختيار الطفرات مع حذف 8 bp مما أدى إلى إنهاء سابق لأوانه لترجمة الأحماض الأمينية في G1 (الشكل 3C). يجب أن يؤدي هذا إلى تغييرات في الوظائف المقابلة لهذا المنتج الجيني في B. dorsalis. تم تهجين G1 المختار مع النوع البري للحصول على G2 heterozygotes. تم استرداد التهجين الذاتي ل G2 heterozygotes و homozygotes في الجيل التالي ، مما يدل على أن هذا المخطط ناجح لتطوير طفرات B. dorsalis ويمكن تطبيقه على نطاق أوسع في الدراسات الجينية الوظيفية في هذا النوع والأنواع ذات الصلة الوثيقة.
الشكل 1: تحضير sgRNA. (أ) الإجراءات العامة لإعداد sgRNA. (ب) المنطقة المستهدفة التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل من gDNA (100 نقطة أساس). (ج) مثال على تركيب الجين المستهدف وموقع الانقسام المستهدف بواسطة Cas9. (د) تجميع PCR ل sgRNA (~ 100 نقطة أساس). (ه) تخليق sgRNA عن طريق النسخ والتنقية في المختبر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الحقن المجهري للجنين. أ: عملية الحقن وطريقته. (ب) جهاز جمع الأجنة، ووضع البيض على الشاش. ج: تصطف الأجنة بالماء وتغطى بزيت الهالوكربون. (د) مجتذب الماصة الدقيقة. (ه) الإعداد الكامل لنظام الحقن المجهري. المجهر (يسار) ، الحاقن الدقيق والمناور الدقيق (الوسط) ، ومضخة الهواء الأوتوماتيكية (يمين). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: فحص الطفرات. أ: تزاوج الطفرات واكتساب الزيجوت المتماثل. (ب) نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من الجينوم الطافر الذي يولد مجموعة مميزة من القمم عند الهدف. ج: أحد أنواع الطفرات وتغير الأحماض الأمينية. تؤدي طفرات الحذف إلى إنهاء الترجمة قبل الأوان. الاختصارات: HE = متغاير الزيجوت ، HO = متماثل الزيجوت. التحكم: حقن الجنين مع sgRNAs المخفوقة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مزيج الحقن | الأجنة المحقونة | يرقات الفقس | الشرانق | فسيفساء G0 | ||
| (فسيفساء / مجموع البالغين) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 نانوغرام/ميكرولتر) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 نانوغرام/ميكرولتر) | ||||||
| Cas9 (150 نانوغرام/ميكرولتر) | ||||||
| الفينول الأحمر (1 ميكرولتر) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 نانوغرام / ميكرولتر) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 نانوغرام / ميكرولتر) | ||||||
| Cas9 (150 نانوغرام/ميكرولتر) | ||||||
| الفينول الأحمر (1 ميكرولتر) | ||||||
الجدول 1: بقاء B. dorsalis والطفرات بعد الحقن المجهري.
| مشكلة | السبب (الأسباب) المحتملة | محاليل | |
| جمع الأجنة غير الفعال | 1. البالغون في حالة سيئة | 1. التأكد من توافر الغذاء والماء وخاصة محتوى السكر في الطعام. | |
| 2. التزاوج غير الكافي | 2. التزاوج مقدما تحت 30-50 لوكس ظروف قاتمة. من الأفضل اختيار البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 12 و 15 يوما. | ||
| ضعف فقس البيض بعد الحقن | 1. أجنة ذات نوعية رديئة | 1. قطف البيض الطازج والممتلئ وادهنه برفق بفرشاة مبللة بالماء. | |
| 2. إبرة لا يصلح | 2. طرف الإبرة صغير قدر الإمكان لتقليل الأضرار التي تلحق بالبويضة أثناء الحقن. | ||
| 3. تربية البيض بشكل غير صحيح بعد الحقن | 3. يجب الحفاظ على رطوبة البيض بعد الحقن لمنع الجفاف من الجفاف. يمكن أيضا نقل البيض مباشرة إلى الطعام بعد الحقن. | ||
| انخفاض معدل بقاء اليرقات | 1. الطعام المتعفن غير مناسب لنمو اليرقات | 1. بالنسبة لليرقات التي فقست حديثا ، أضف كمية صغيرة من الطعام. الكثير من الطعام سوف يتعفن أو يجف ويؤثر على نمو اليرقات. | |
| 2. يرقات حديثة الفقس غارقة في الزيت لفترة طويلة | 2- يجب نقل اليرقات حديثة الفقس إلى طعام اليرقات في الوقت المناسب أو يجب قطف البيض مباشرة في الطعام بعد الحقن. | ||
| معدل الطفرات لدى البالغين منخفض | 1. جودة منخفضة من gRNA | 1. عملية تجريبية صارمة لتوليف gRNA عالي الجودة لمنع التدهور. | |
| 2. الأهداف غير الفعالة تؤدي إلى أهداف خارج الأهداف | 2. فحص الأهداف عالية الكفاءة من خلال كما ذكرت مناقشتنا. | ||
الجدول 2: المشاكل المحتملة في بناء المسوخ والأسباب المحتملة والحلول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام CRISPR / Cas9 هو أداة تحرير الجينات الأكثر استخداما وله تطبيقات مختلفة ، مثل الجينات threpy30 ، وتربية المحاصيل 31 ، والدراسات الأساسية لوظائف الجينات32. تم تطبيق هذا النظام بالفعل لتحرير الجينات في أنواع مختلفة من الحشرات وكان بمثابة أداة فعالة للدراسات الجينية الوظيفية في الآفات. تعمل البروتوكولات التي نقدمها هنا على توحيد إجراءات تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الإرشادي ، وجمع الأجنة ، وحقن الأجنة ، وتربية الحشرات ، وفحص الطفرات. علاوة على ذلك ، تمت إضافة جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتلخيص المشكلة المحتملة من كل خطوة ، وتم توفير حلولها لتخفيف عبء العمل وتحسين الكفاءة (الجدول 2). يوفر هذا الإجراء طريقة موثوقة لتحرير الجينات ذات الأهمية ويحسن الدراسات الجينومية الوظيفية في B. dorsalis.
أولا، يعد اختيار الجينات المستهدفة أمرا بالغ الأهمية لزيادة كفاءة نظام كريسبر/كاس9، ويمكن للعديد من البرامج مفتوحة المصدر مثل ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/) وsgRNAcas9 (V3.0)35 وكريسبر الأمثل لاكتشاف الهدف 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) توليد الأهداف تلقائيا والتنبؤ بالمعدلات المحتملة خارج الهدف. نظرا لأن معدل الخصوبة المرتفع ل B. dorsalis يسهل جمع الأجنة ، يمكن التنبؤ بمعدلات الطفرات عن طريق التضحية بجزء من الأجنة لاستخراج الحمض النووي وتسلسل المنطقة المستهدفة. إذا لم يكن التسلسل متاحا في المختبر ، يوصى أيضا باستخدام T7 endonuclease I للتنبؤ بمعدلات الطفرة37. يمكن اختيار المواقع المستهدفة ذات معدلات الحذف الجينومي العالية من خلال هذه الطرق الثلاث ، وبالتالي ، يمكن زيادة كفاءة تحرير الجينات في B. dorsalis.
تحدد مرحلة تطور الجنين ما إذا كانت الطفرات ستورث أم لا. من أجل الحصول على طفرات موروثة ، يجب أن يحدث تحرير الجينات في الخلايا الجرثومية. بشكل عام ، لا يمكن توصيل خليط sgRNA و Cas9 إلى الخلايا الجرثومية بعد حدوث تكوين خلية القطب. في B. dorsalis ، حدث تكوين خلية القطب في 3 ساعات بعد وضع البيض 38 ، في حين أن البروتوكول المفصل هنا ل B. dorsalis يستغرق30 دقيقة من جمع الأجنة إلى نهاية الحقن المجهري. أثناء الحقن ، لا تتشكل أي خلايا قطبية تقريبا في النهاية النباتية للجنين. لذلك ، يجب أن تكون الطفرات الجينية التي تم الحصول عليها في G0 موروثة بكفاءة. الوقت الذي يستهلكه الحقن المجهري هو أيضا أقل من الطريقة المذكورة في الأوراق المنشورة سابقا (بشكل عام 1-3 ساعات)18,19.
من المهم تقليل الأضرار الميكانيكية أو الكيميائية أثناء عملية جمع الأجنة والتعامل معها. استخدم فرشاة دقيقة لاصطفاف الأجنة برفق على لوحة الحقن. يجب أن يعكس موضع الحقن العمل الذي تم إنجازه سابقا في ذبابة الفاكهة (الطرق - مختبر نيكولاس جومبل ، http://gompel.org/methods) و Ceratitis capitata39. حقن الأجنة في القطب النباتي. لا تقم أبدا بإدخال الإبرة في عمود الحيوان. تحضير الإبرة باتباع دليل مجتذب الماصة الدقيقة ؛ يجب أن تكون فتحة الإبرة صغيرة قدر الإمكان لتجنب التدفق العكسي السيتوبلازمي المفرط. الطريقة المذكورة في الدراسات المنشورة في B. dorsalis بشكل عام dechoriions الأجنة مع hypochorite الصوديوم17،18،19. هذا يمكن أن يسبب أضرارا كيميائية ويقلل من معدلات بقاء الأجنة. في هذا البروتوكول ، لا يتم نزع الأجنة ، ولا يزال الحقن يعمل بشكل جيد. يمكن أن يكون الضرر الكيميائي للأجنة ضئيلا.
تربية الحشرات بعد الحقن مهمة جدا. يمكن أن يكون بروتوكول التربية الموحد المقدم هنا بمثابة مرجع لتربية أنواع ذبابة الفاكهة الأخرى ، وخاصة أنواع Bactrocera . يمكن غمر الأجنة في الزيت لتجنب الجفاف أثناء الحقن باستخدام لوحة الحقن ذاتية الصنع. قلل الوقت الذي تقضيه اليرقة في الزيت (<2 ساعة) لتحقيق معدلات البقاء على قيد الحياة في G0 فوق 50٪.
يوصى باستخدام طريقة غير جراحية لاستخراج الحمض النووي الجينومي للكشف عن الطفرات. على سبيل المثال ، يقترح بعض الباحثين في حرشفيات الأجنحة أنه يمكن استخدام إفرازات اليرقات الداخلية النهائية لاستخراج الحمض النووي الجينومي لمزيد من التنميط الجيني. بالنسبة ل B. dorsalis ، تتضمن إحدى الطرق غير الغازية استخراج الحمض النووي الجينومي من بوباريوم طازج. يمكن أن يؤدي حقن العديد من sgRNAs التي تستهدف جين علامة وجين مهم أيضا إلى تحسين تحديد الطفرات. على سبيل المثال ، يمكن أن تنتج sgRNAs المحقونة بشكل مشترك والتي تستهدف لون العين (kmo) ومستقبلات هرمون الأحداث (Met) 75٪ من النسل مع طفرات مزدوجة في البعوض. تم فحص الطفرات التي تم فحصها مبدئيا بناء على لون عين اليرقات37. يجب تقييم هذا في B. dorsalis في المستقبل لزيادة تحسين فعالية تحرير الجينات في هذا النوع من الحشرات باستخدام نظام CRISPR / Cas9.
في الختام ، يعد نظام CRSIPR / Cas9 أداة قوية في علم الجينوم الوظيفي في B. dorsalis. توفر بروتوكولاتنا التفصيلية معلومات مفيدة لمساعدة الباحثين على تحقيق جمع فعال للأجنة ، ومعدلات بقاء مثالية لليرقات ، وكفاءة التحرير المطلوبة. قد تكون هذه طريقة بسيطة وسريعة لمساعدة الباحثين على الحصول على الطفرات في B. dorsalis. لا يمكن تطبيق هذه التقنية في الدراسات الوظيفية للجينات القاتلة لأن الطفرات الموروثة تحتاج إلى تهجين ناجح. يمكن أن تركز الدراسات المستقبلية على تطوير أدوات معدلة وراثيا للتعبير عن عناصر كريسبر الخاصة بالمرحلة أو الأنسجة لاختراق هذا القيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج Shenzhen للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. KQTD20180411143628272) والصناديق الخاصة للابتكار في مجال تكنولوجيا العلوم والتنمية الصناعية لمنطقة Shenzhen Dapeng الجديدة (رقم المنحة. PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
