Summary
Dette papiret presenterer trinnvise protokoller for CRISPR / Cas9 mutagenese av orientalsk fruktflue Bactrocera dorsalis. Detaljerte trinn gitt av denne standardiserte protokollen vil tjene som en nyttig veiledning for å generere mutantfluer for funksjonelle genstudier i B. dorsalis.
Abstract
Den orientalske fruktfluen, Bactrocera dorsalis, er en svært invasiv og adaptiv skadedyrsart som forårsaker skade på sitrus og over 150 andre fruktavlinger over hele verden. Siden voksne fruktfluer har stor flykapasitet og kvinner legger eggene sine under skinnene av frukt, utfører insektmidler som krever direkte kontakt med vanligvis dårlig i feltet. Med utviklingen av molekylærbiologiske verktøy og sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, forsøker mange forskere å utvikle miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier. Disse inkluderer RNAi eller genredigeringsbaserte plantevernmidler som nedregulerer eller stilner gener (molekylære mål), for eksempel olfaktoriske gener involvert i søkeadferd, i ulike. For å tilpasse disse strategiene for orientalsk bananfluekontroll er det behov for effektive metoder for funksjonell genforskning. Gener med kritiske funksjoner i overlevelse og reproduksjon av B. dorsalis tjener som gode molekylære mål for gen knockdown og / eller silencing. CRISPR/Cas9-systemet er en pålitelig teknikk som brukes til genredigering, spesielt hos insekter. Dette papiret presenterer en systematisk metode for CRISPR / Cas9 mutagenese av B. dorsalis, inkludert design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insektoppdrett og mutant screening. Disse protokollene vil tjene som en nyttig guide for å generere mutantfluer for forskere som er interessert i funksjonelle genstudier i B. dorsalis.
Introduction
Den orientalske fruktfluen, Bactrocera dorsalis , er en kosmopolitisk insekt skadedyrsart som forårsaker skade på over 150 arter av fruktavlinger, inkludert guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirsebær, sitrus, loquat og papaya1. Skaden forårsaket i Guangdong-provinsen (Kina) alene er anslått til over 200 millioner yuans. Voksne kvinner setter eggene sine under huden av modne eller modne frukter, noe som forårsaker forfall og abscission av frukten, noe som reduserer fruktkvaliteten og det totale utbyttetav avlingen. Siden voksne fruktfluer har stor flykapasitet og larvene deres borer seg inn i frukthuden, utfører insektmidler som krever direkte kontakt med dårlig i feltet. I tillegg har den omfattende bruken av insektmidler økt motstanden til B. dorsalis mot ulike landbrukskjemikalier, noe som gjør kontrollen av disse skadelige enda vanskeligere3. Derfor er det desperat behov for utvikling av effektive og miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier.
Nylig, med utviklingen av molekylærbiologiske verktøy og høykapasitetssekvenseringsteknologier, forsøker forskere å utvikle miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier, for eksempel RNAi, som retter seg mot funksjonaliteten til viktige gener (molekylære mål) for ulike. Gener som er kritiske for overlevelse og reproduksjon av kan identifiseres gjennom funksjonelle genstudier og videre tjene som potensielle molekylære mål for forbedring av spesielt målrettede og miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesverktøy4. For å tilpasse slike strategier til orientalsk bananfluekontroll er det behov for effektive metoder for funksjonell genforskning.
CRISPR / Cas (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert) endonuklease-systemet ble opprinnelig oppdaget i bakterier og archaea og funnet å være en adaptiv mekanisme involvert i anerkjennelse og nedbrytning av fremmed intracellulært DNA, slik som det som ble introdusert ved å infisere bakteriofager5. I type II CRISPR-systemet styres Cas9-endonuklease av små assosierte RNA (crRNA og tracrRNA) for å spalte trespassing DNA 6,7,8 og har blitt et av de mest brukte verktøyene for genredigering til dags dato 9,10,11,12. Siden CRISPR/Cas9-systemet har flere fordeler, som høy effektivitet av geninaktivering og lave kostnader, har det allerede blitt brukt for genredigering i ulike insektarter, inkludert Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 og Bombyx mori16. I B. dorsalis har gener relatert til kroppsfarge, vingedimorfisme og kjønnsbestemmelse blitt slått ut ved hjelp av CRISPR / Cas917,18,19. Imidlertid forblir detaljerte prosedyrer for CRISPR / Cas9-påføring i dette insektet ufullstendige. Videre er noen trinn gitt av forskere for B. dorsalis genredigering også varierte og trenger standardisering. For eksempel var formene av Cas9 forskjellige i publiserte referanser17,18,19.
Dette papiret gir en systematisk metode for mutagenese av B. dorsalis ved bruk av CRISPR / Cas9-systemet, inkludert design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insektoppdrett og mutant screening. Denne protokollen vil tjene som en nyttig guide for å generere mutantfluer for forskere som er interessert i de funksjonelle genstudiene i B. dorsalis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Måldesign og in vitro-syntese av sgRNA
- Forutsi strukturen av målgener av interesse og bestem grensene mellom eksoner og introner via bioinformatisk analyse av B. dorsalis genomet (programvare som brukes her er oppført i materialtabellen).
MERK: BLAT20 ble brukt til å søke potensielle gen loci i genomet. RNA-seq-avlesningene av høy kvalitet (transkriptom) ble justert til det oppkjøpte genet loci ved hjelp av Hisat221. Samtools22 ble brukt til å generere de sorterte bam-filene. De sorterte bam-filene ble lagt inn til Stringtie223 for å gi monteringsutskriftene. Assemble-transkripsjonene og gene loci-informasjonen ble kombinert av Transdecoder24. Resultatene fra Transdecoder ble visualisert i IGV-verktøy25 , og grensene mellom eksoner og introner kunne bestemmes. - Identifiser passende målregioner innenfor kandidatmålgenstedet. Den totale lengden må være mindre enn 750 bp for mer praktisk sekvensering (figur 1B). Design spesifikke primere for å forsterke målområdet fra villtype genomisk DNA ved PCR (figur 1B) (Primere: F-primer: AACATTGAATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Klon PCR-produktene til en stump endevektor26 og velg 20 individuelle bakteriekolonier for sekvensering for å bestemme hvor bevart målområdet er i laboratorieinsektpopulasjonene.
- Et typisk målsted inneholder et tre-nukleotidsekvensmotiv (NGG eller CCN) og en 20 bp sekvens ved siden av NGG- eller CCN-motivene (20 bp-NGG eller CCN-20 bp). Blast kandidatmålstedene mot B. dorsalis-genomet og sørg for at den forventede effektiviteten er høy nok og off-targeting-frekvensen er lav; Flere open source-programmer kan automatisk forutsi dette. I denne protokollen brukes sgRNAcas9 -AI27 til å velge og evaluere de optimale målene. Detaljer om bruk finner du i håndboken for denne programvaren.
MERK: Mulige målsteder stengt for 5 'UTR av målgenet og 1-2 Gs ved starten av 20 bp-sekvensen favoriseres. For å oppnå en stor delesjon som vil bli identifisert ved PCR etterfulgt av agarosegelelektroforese, anbefales det å designe to mål28 atskilt med over 100 bp (figur 1C). - Bruk det kommersielt tilgjengelige gRNA-syntesesettet for å generere det designede sgRNA. Utfør hvert trinn etter brukerhåndboken. Resuspend gRNA-produktet i nukleasefritt vann, kvantifiser konsentrasjonen ved hjelp av et UV-Vis-spektrofotometer, og oppbevar ved -80 ° C før bruk (konsentrasjonen av vellykket syntetisert enkelt gRNA [10 μL] med settet som brukes her er omtrent 4000-6000 ng / μL, eller enda høyere).
MERK: Selv om generering av mutantfluene er det første trinnet for enhver forsker, er riktig negativ kontroll for nedstrøms eksperiment / analyse kritisk. Å generere disse kontrollene sammen med mutantene sparer forskere tid og krefter. Sett for eksempel kryptert sgRNA som en negativ kontroll.
2. Innsamling og forberedelse av embryoer
- Plasser B. dorsalis pupper i plastbur. Gi en blanding av sukker og gjær (1: 1) som mat sammen med en vannkilde etter at de voksne har lukket (figur 2A, B). Oppdrettsforholdene er 55% relativ fuktighet (RH), 26,5 ° C og en 14:10 L / D syklus (lysene på klokka seks om morgenen, lysene av klokka åtte om kvelden).
- De fleste voksne når seksuell modenhet 10 dager etter fremveksten. Gi et passende miljø for å hjelpe voksne fluer til å parre seg så mye som mulig. Bruk ideelt sett et lysstativ med et lys på 30-50 lux. Dette kan forbedre fecundity av kvinner, og dermed forbedre effektiviteten av embryoinnsamling.
MERK: Å sette de voksne (i alderen 5-6 dager etter fremveksten) i et svakt opplyst (<100 lux) miljø kan fremme parring. Vanligvis skjer toppen av oviposisjon kl. 15:00 (14:10/L:D, lys på 06:00, lys av kl. 20:00); For å få nok embryoer anbefales det å plassere oviekamre i burene 30 minutter før kl. 15.00. - Plasser en 200-mesh gasbind i oviposisjonskammeret, 1-2 mm fra kammerlokket. Dette vil bidra til å skaffe så mange embryoer som mulig.
MERK: Unngå å la embryoene bli gjennomvåt i appelsinjuice eller gnidd med gasbind, da dette kan redusere embryoens overlevelsesrate betydelig. - Sett et nytt oviposisjonskammer inn i buret når mikroinjeksjonsoppsettet er klart. Samle embryoene hvert 10. minutt med en fin våt børste, og still dem deretter opp på en selvfremstillet injeksjonsplate (plexiglass med en lengde på 55 mm, en bredde på 13,75 mm og en høyde på 5 mm, En 45 mm x 5 mm x 0,3 mm grunn spor åpnes i midten for å lette eggplassering). Hvis embryoene har høyt indre trykk, er liten uttørking ved <10% RF i 10 minutter valgfritt. Dypp embryoene i halokarbonolje under injeksjon for å unngå ytterligere uttørking (figur 2C).
3. Mikroinjeksjon av embryoet
- Klargjør injeksjonsnålen i glass ved hjelp av en mikropipetteavtrekker.
MERK: Det er viktig å angi parametrene etter brukerhåndboken. I disse protokollene kan forskjellige nålformer lages ved hjelp av parametrene som er foreslått av håndboken til mikropipettetrekkeren. Glasskapillæren må være så ren som mulig for å forhindre at støv tetter nålen. - Forbered arbeidsløsningen. Bland Cas9-proteinet og tilhørende sgRNA til følgende arbeidskonsentrasjoner: sgRNA, 300 ng / μL; Cas9 protein, 150 ng / μL. Tilsett 1 μL fenolrød til blandingen for å tjene som en praktisk måte å markere injiserte embryoer på. Legg den tilberedte blandingen på is for å unngå nedbrytning av sgRNA.
MERK: Bruk nukleasefrie pipettespisser og PCR-rør. Konsentrasjonen av Cas9-protein må være mindre enn eller lik 150 ng / μL; Høyere konsentrasjoner er giftige og reduserer embryooverlevelsesraten betydelig. Cas9 kan også leveres i DNA- eller mRNA-format for å oppnå vellykket genredigering17,19. I denne protokollen anbefales Cas9-protein siden mRNA er utsatt for nedbrytning, og ekspresjonen av Cas9-protein fra plasmid-DNA tar tid for transkripsjon og oversettelse. - Still inn parametrene for injektoren. Det opprinnelige programmet er Pi-500 hPa, Ti-0.5 s og PC-200 hPa. Juster disse parametrene ytterligere etter behov under mikroinjeksjon.
- Tilsett 3 μL av blandingen i injeksjonsnålen. Unngå å introdusere luftbobler som muligens kan tette nålen. Åpne nålen ved hjelp av en mikrogrinder.
- Koble nålen til mikromanipulatoren i henhold til brukerhåndboken (figur 2E).
- Sett platen med oppôrede embryoer på objektivbordet. Juster posisjonen til mikropipetten under et fint optisk mikroskop, og sett mikropipetten og embryoet på samme plan. Juster dråpevolumet ved å trykke på pedalen; 1/10 volumet av embryoer anbefales.
- Stikk nålespissen inn i embryoets bakre (vegetabilske pol). Lever blandingene inn i embryoet ved å trykke på pedalen fra injektoren. Hvis fenolrødt tilsettes, observeres en litt rødaktig farge umiddelbart.
MERK: Et lite volum cytoplasmatisk tilbakestrømning fra pinhullet vil ikke redusere overlevelsesraten til embryoet. Injeksjon av 200 embryoer er nok for vellykket mutagenese av ett gen. Tilsetning av mer halokarbonolje for å fordype embryoene kan forhindre ytterligere uttørking. Injeksjonen må utføres før polcelledannelse, noe som sikrer at hver mutasjon effektivt kan arves.
4. Oppdrett av insekter etter injeksjon
- Sett injeksjonsplaten med de injiserte embryoene inn i et kunstig klimakammer holdt ved 55% RF, 26,5 ° C og en 14:10 L / D syklus (lys på seks om morgenen, lys av klokka åtte om kvelden).
- Etter injeksjon tar embryodannelsen vanligvis 24 timer å fullføre og 36 timer å klekke. Bruk en finspissbørste for å overføre larvene til et forberedt larvediett. Samle larver tre eller fire ganger daglig til ikke flere larver klekkes. Vanligvis tar larver 2-3 dager å fullføre klekking og valpe innen 7 dager.
MERK: Et maisbasert kosthold ble brukt til å mate larver. Oppskriften inneholder 150 g maismel, 150 g banan, 0,6 g natriumbenzoat, 30 g gjær, 30 g sukrose, 30 g papirhåndkle, 1,2 ml saltsyre og 300 ml vann29. Minimer tiden larver er igjen i olje (<2 timer). Flytt larvene på dietten umiddelbart etter klekking så langt som mulig. Dette kan øke overlevelses- og puppefrekvensen betydelig. Ikke gi for mye diett (en diett med 2/3 av en 90 mm petriskål er nok for 30 larver); Ellers vil det bli moldy og redusere larvaloverlevelsen. - Sett de modne larvene i den våte sanden for å puppe. Puppestadiet tar omtrent 10 dager. Flytt puppene til plastbur før eclosion begynner.
5. Mutant screening
- Et flytskjema for mutantscreeningen er illustrert i figur 3A. Cross G0 voksne oppnådd ved mikroinjeksjon med villtype voksne for å oppnå heterozygote linjer. Kontroller hvilken type mutasjoner avkommet (G1) bærer ved genotyping.
- Selvkryss G1 med samme mutante genotype for å oppnå homozygote linjer i G2. Hvis genotyper av mutantene i G1 er helt forskjellige, kryss heterozygotene med villtypefluer. Homozygote linjer oppnås vanligvis i G3. Oppretthold to eller tre homozygote linjer for påfølgende fenotypingseksperimenter.
- Bruk genomisk DNA fra et friskt puparium eller et enkelt midtben av individuelle voksne til å utføre genotyping. Design spesifikke primere for å forsterke målområdet; Primerne må sette minst 50 bps oppstrøms og nedstrøms for målstedet. Se trinn 1.2 for primerdetaljer.
MERK: Siden mengden av DNA i et puparium er ekstremt lav, anbefales kommersielt tilgjengelige DNA-ekstraksjonssett. - Utfør PCR ved å bruke følgende sykkelforhold: 98 °C i 3 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på 98 °C i 10 s, 15 s ved en glødetemperatur som passer for de designede primerne, 72 °C i 35 s, etterfulgt av en endelig forlengelse på 72 °C i 10 minutter.
- Sekvenser de rensede PCR-produktene. Når det oppdages flere overlappende topper ved siden av målstedet (figur 3B), har det oppstått vellykket mutagenese. Subkloner de rensede PCR-produktene til en stump vektor og velg 10 individuelle bakteriekolonier for sekvensering for å verifisere genotypen til mutantene. Oppretthold linjene med rammeskiftmutasjoner og for tidlige oversettelsestermineringer (figur 3C).
MERK: Det er ikke nødvendig å utføre enkelt klonsekvensering for å verifisere genotypen til G0-individer. Bare sekvenser PCR-produktene og vedlikehold individene med åpenbare flere overlappingstopper ved siden av målstedet. Etter den første injeksjonen anbefales det å velge 10 embryoer for å trekke ut genomisk DNA og sekvensering av PCR-produktene basert på standardene i trinn 5.3. Dette kan bidra til å forutsi mutasjonsrater på forhånd. I denne studien ble sangersekvensering for å bestemme genotypen utført av et sekvenseringsfirma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen presenterer detaljerte trinn for utvikling av B. dorsalis mutanter ved hjelp av CRISPR / Cas9-teknologi, inkludert representative resultater fra gDNA-seleksjon, innsamling av embryoer og mikroinjeksjon, insektvedlikehold og mutant screening.
Eksemplet på målstedet for det valgte genet ligger i det tredje eksonet (figur 1C). Dette stedet er svært konservert, og et enkelt bånd ble detektert ved gelelektroforese for DNA-malen for syntetisk gRNA (figur 1D) og gRNA oppnådd ved in vitro-transkripsjon (figur 1E).
Injeksjon i 200 nyhøstede egg ble utført som beskrevet i avsnitt 3. Embryoene ble vedlikeholdt ved å følge protokollene beskrevet i trinn 4.1-4.3. Som påvist ved sekvensering av PCR-produktene er 80% av G0-individene mosaikkmutanter (tabell 1). Her ble mutanter med 8 bp delesjon som resulterte i prematur seponering av aminosyretranslasjon i G1 valgt ut (figur 3C). Dette bør føre til endringer i de tilsvarende funksjonene til dette genproduktet i B. dorsalis. Den valgte G1 ble krysset med villtype for å oppnå G2 heterozygoter. Selvkryssende G2-heterozygoter og homozygoter ble gjenopprettet i neste generasjon, noe som viser at denne ordningen er vellykket for å utvikle B. dorsalis mutanter og kan brukes mer i funksjonelle genstudier i denne og nært beslektede arter.
Figur 1: Fremstilling av sgRNA . (A) Generelle prosedyrer for sgRNA-preparat. (B) Målområde forsterket av PCR fra gDNA (100 bp). (C) Eksempel på målgenstruktur og målspaltningssted av Cas9. (D) PCR-montering av sgRNA (~ 100 bp). (E) Syntese av sgRNA ved in vitro transkripsjon og rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikroinjeksjon av embryo . (A) Injeksjonsprosessen og injeksjonsmetoden. (B) Embryoinnsamlingsenhet, legging av egg på gasbind. (C) Linje opp embryoer med vann og dekke med halokarbonolje. (D) Mikropipette avtrekker. (E) Hele oppsettet av mikroinjeksjonssystemet. Mikroskop (venstre), mikroinjektor og mikromanipulator (midten) og automatisk luftpumpe (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mutantscreening . (A) Parring av mutanter og oppkjøp av homozygoter. (B) PCR-produkter fra det muterte genomet som genererer et tydelig sett med topper ved målet. (C) En av mutasjonstypene og aminosyreendringene endres. Slettingsmutasjoner fører til for tidlig avslutning av oversettelsen. Forkortelser: HE = heterozygoter, HO = homozygoter. Kontroll: embryo injisert med krypterte sgRNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Injeksjon blanding | Injiserte embryoer | Klekkede larver | Pupper | Mosaikk G0 | ||
| (Mosaikk/Totalt voksne) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Fenol rød (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Fenol rød (1 μL) | ||||||
Tabell 1: B. dorsalis overlevelse og mutagenese etter mikroinjeksjoner.
| Problem | Potensiell årsak (er) | Løsninger | |
| Ineffektiv embryoinnsamling | 1. Voksne er i dårlig stand | 1.Sørg for at mat og vann er tilgjengelig, særlig sukkerinnholdet i maten. | |
| 2. Utilstrekkelig parring | 2. Parring på forhånd under 30-50 Lux dim forhold. Det er best å velge 12-15 dager gamle parrede voksne. | ||
| Dårlig luktbarhet av egg etter injeksjon | 1. Embryoer av dårlig kvalitet | 1. Plukk ferske og klumpete egg og pensle dem forsiktig med en vanndynket børste. | |
| 2. Nålen passer ikke | 2. Spissen av nålen er så liten som mulig for å minimere skade på egget under injeksjon. | ||
| 3. Feil oppdrett av egg etter injeksjon | 3. Egg må holdes hydrert etter injeksjon for å forhindre at dehydrering tørker ut. Egg kan også overføres direkte til mat etter injeksjon. | ||
| Lav larveoverlevelse | 1. Moldy mat er ikke egnet for larvevekst | 1. For nyutviklede larver, tilsett en liten mengde mat. For mye mat vil forme eller tørke ut og påvirke veksten av larver. | |
| 2. Nyklekkede larver dynket i olje i lang tid | 2.De nyklekkede larvene må overføres til larvematen i tide, eller eggene skal plukkes direkte inn i maten etter injeksjon. | ||
| Mutasjonsraten hos voksne er lav | 1. Lav kvalitet på gRNA | 1. Streng eksperimentell operasjon for å syntetisere gRNA av høy kvalitet for å forhindre nedbrytning. | |
| 2. Ineffektive mål fører til off-mål | 2. Screening av høyeffektive mål gjennom som vår diskusjon nevnte. | ||
Tabell 2: Mulige problemer med å konstruere mutanter, potensielle årsaker og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9-systemet er det mest brukte genredigeringsverktøyet og har ulike anvendelser, som gentrerepy30, avl 31 og grunnleggende studier av genfuktioner32. Dette systemet er allerede tatt i bruk for genredigering hos ulike insektarter og har fungert som et effektivt verktøy for funksjonelle genstudier hos. Protokollene vi presenterer her standardiserer prosedyren for design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insektoppdrett og mutant screening. Videre ble det lagt til en feilsøkingstabell for å oppsummere det potensielle problemet fra hvert trinn, og deres løsninger ble gitt for å lette arbeidsbelastningen og forbedre effektiviteten (tabell 2). Denne prosedyren gir en pålitelig måte å redigere gener av interesse og forbedrer de funksjonelle genomiske studiene i B. dorsalis.
For det første er målgenvalg avgjørende for å øke effektiviteten til CRISPR / Cas9-systemet, og flere open source-programmer som ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0) 35 og CRISPR optimal målfinner 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) kan automatisk generere mål og forutsi potensielle off-target priser. Siden den høye fecundity rate av B. dorsalis letter embryo innsamling, kan mutant priser forutsies ved å ofre en del av embryoene for DNA-ekstraksjon og sekvensering av målområdet. Hvis sekvensering ikke er tilgjengelig i laboratoriet, anbefales det også 37 å brukeT7 endonuklease I for å forutsi mutasjonshastigheter. Målsteder med høye genomiske delesjonsrater kan velges gjennom disse tre metodene, og derfor kan effektiviteten av genredigering i B. dorsalis økes.
Utviklingsstadiet av embryoet bestemmer om mutasjoner vil bli arvet. For å oppnå arvelige mutasjoner må genredigering forekomme i kimceller. Vanligvis kan blandingen av sgRNA og Cas9 ikke leveres til kimceller etter at polcelledannelse har skjedd. I B. dorsalis skjedde polcelledannelsen 3 timer etter egglegging 38, mens protokollen beskrevet her for B. dorsalis tar30 minutter fra embryoinnsamling til slutten av mikroinjeksjonen. Under injeksjon dannes nesten ingen polceller i den vegetabilske enden av embryoet; Derfor bør genmutasjoner oppnådd i G0 effektivt arves. Tiden som forbrukes ved mikroinjeksjon er også mindre enn metoden nevnt i tidligere publiserte artikler (vanligvis 1-3 timer)18,19.
Det er viktig å minimere mekanisk eller kjemisk skade under prosessen med embryoinnsamling og håndtering. Bruk en fin børste til å forsiktig stille opp embryoer på injeksjonsplaten. Injeksjonsposisjonen skal gjenspeile arbeidet som tidligere er gjort i Drosophila (Metoder - Nicolas Gompels laboratorium, http://gompel.org/methods) og Ceratitis capitata39. Injiser embryoer på vegetalpolen; stikk aldri nålen inn i dyrestangen. Klargjør nålen etter mikropipetteavtrekkerguiden; Åpningen av nålen skal være så liten som mulig for å unngå overdreven cytoplasmatisk tilbakestrømning. Metoden nevnt i publiserte studier i B. dorsalis dechorionerte generelt embryoene med natriumhypokoritt17,18,19; Dette kan forårsake kjemisk skade og redusere overlevelsesraten til embryoene. I denne protokollen blir embryoer ikke dechorionert, og injeksjon fungerer fortsatt bra. Den kjemiske skaden på embryoene kan være minimal.
Insektoppdrett etter injeksjon er svært viktig. Den standardiserte oppdrettsprotokollen som er gitt her, kan tjene som referanse for oppdrett av andre fruktfluearter, spesielt Bactrocera-arter . Embryoene kan nedsenkes i olje for å unngå uttørking under injeksjonen ved hjelp av vår selvlagde injeksjonsplate. Minimer tiden larven bruker i oljen (<2 timer) for å oppnå overlevelse i G0 over 50%.
En ikke-invasiv metode for genomisk DNA-ekstraksjon anbefales for mutantdeteksjon. For eksempel foreslår noen lepidopteranforskere at ekssuviatene til de endelige instarlarvene kan brukes til å trekke ut genomisk DNA for ytterligere genotyping. For B. dorsalis innebærer en ikke-invasiv metode å trekke ut genomisk DNA fra et ferskt puparium. Injeksjon av flere sgRNA rettet mot et markørgen og genet av interesse kan også forbedre identifiseringen av mutanter. For eksempel kan co-injiserte sgRNA rettet mot øyenfarge (kmo) og juvenil hormonreseptor (Met) produsere 75% av avkom med doble mutasjoner i mygg. Met mutanter ble foreløpig screenet basert på øyenfargen til larver37. Dette bør evalueres i B. dorsalis i fremtiden for ytterligere å forbedre effekten av genredigering i denne insektarten ved å bruke CRISPR/Cas9-systemet.
Avslutningsvis er CRSIPR/Cas9-systemet et kraftig verktøy i funksjonell genomikk i B. dorsalis. Våre detaljerte protokoller gir nyttig informasjon for å hjelpe forskere med å oppnå effektiv embryoinnsamling, ideelle overlevelsesrater for larver og ønsket redigeringseffektivitet. Dette kan være en enkel og rask måte å hjelpe forskere til å oppnå mutagenese i B. dorsalis. Denne teknikken kunne ikke brukes i de funksjonelle studiene av dødelige gener siden de arvelige mutasjonene trenger vellykkede kryssavl. Fremtidige studier kan fokusere på å utvikle transgene verktøy for å uttrykke stadium- eller vevsspesifikke CRISPR-elementer for å bryte gjennom denne begrensningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) og spesielle midler for vitenskapsteknologisk innovasjon og industriell utvikling av Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H.
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J.
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al.
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
