Dette papiret presenterer trinnvise protokoller for CRISPR / Cas9 mutagenese av orientalsk fruktflue Bactrocera dorsalis. Detaljerte trinn gitt av denne standardiserte protokollen vil tjene som en nyttig veiledning for å generere mutantfluer for funksjonelle genstudier i B. dorsalis.
Den orientalske fruktfluen, Bactrocera dorsalis, er en svært invasiv og adaptiv skadedyrsart som forårsaker skade på sitrus og over 150 andre fruktavlinger over hele verden. Siden voksne fruktfluer har stor flykapasitet og kvinner legger eggene sine under skinnene av frukt, utfører insektmidler som krever direkte kontakt med vanligvis dårlig i feltet. Med utviklingen av molekylærbiologiske verktøy og sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, forsøker mange forskere å utvikle miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier. Disse inkluderer RNAi eller genredigeringsbaserte plantevernmidler som nedregulerer eller stilner gener (molekylære mål), for eksempel olfaktoriske gener involvert i søkeadferd, i ulike. For å tilpasse disse strategiene for orientalsk bananfluekontroll er det behov for effektive metoder for funksjonell genforskning. Gener med kritiske funksjoner i overlevelse og reproduksjon av B. dorsalis tjener som gode molekylære mål for gen knockdown og / eller silencing. CRISPR/Cas9-systemet er en pålitelig teknikk som brukes til genredigering, spesielt hos insekter. Dette papiret presenterer en systematisk metode for CRISPR / Cas9 mutagenese av B. dorsalis, inkludert design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insektoppdrett og mutant screening. Disse protokollene vil tjene som en nyttig guide for å generere mutantfluer for forskere som er interessert i funksjonelle genstudier i B. dorsalis.
Den orientalske fruktfluen, Bactrocera dorsalis , er en kosmopolitisk insekt skadedyrsart som forårsaker skade på over 150 arter av fruktavlinger, inkludert guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirsebær, sitrus, loquat og papaya1. Skaden forårsaket i Guangdong-provinsen (Kina) alene er anslått til over 200 millioner yuans. Voksne kvinner setter eggene sine under huden av modne eller modne frukter, noe som forårsaker forfall og abscission av frukten, noe som reduserer fruktkvaliteten og det totale utbyttetav avlingen. Siden voksne fruktfluer har stor flykapasitet og larvene deres borer seg inn i frukthuden, utfører insektmidler som krever direkte kontakt med dårlig i feltet. I tillegg har den omfattende bruken av insektmidler økt motstanden til B. dorsalis mot ulike landbrukskjemikalier, noe som gjør kontrollen av disse skadelige enda vanskeligere3. Derfor er det desperat behov for utvikling av effektive og miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier.
Nylig, med utviklingen av molekylærbiologiske verktøy og høykapasitetssekvenseringsteknologier, forsøker forskere å utvikle miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier, for eksempel RNAi, som retter seg mot funksjonaliteten til viktige gener (molekylære mål) for ulike. Gener som er kritiske for overlevelse og reproduksjon av kan identifiseres gjennom funksjonelle genstudier og videre tjene som potensielle molekylære mål for forbedring av spesielt målrettede og miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesverktøy4. For å tilpasse slike strategier til orientalsk bananfluekontroll er det behov for effektive metoder for funksjonell genforskning.
CRISPR / Cas (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert) endonuklease-systemet ble opprinnelig oppdaget i bakterier og archaea og funnet å være en adaptiv mekanisme involvert i anerkjennelse og nedbrytning av fremmed intracellulært DNA, slik som det som ble introdusert ved å infisere bakteriofager5. I type II CRISPR-systemet styres Cas9-endonuklease av små assosierte RNA (crRNA og tracrRNA) for å spalte trespassing DNA 6,7,8 og har blitt et av de mest brukte verktøyene for genredigering til dags dato 9,10,11,12. Siden CRISPR/Cas9-systemet har flere fordeler, som høy effektivitet av geninaktivering og lave kostnader, har det allerede blitt brukt for genredigering i ulike insektarter, inkludert Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 og Bombyx mori16. I B. dorsalis har gener relatert til kroppsfarge, vingedimorfisme og kjønnsbestemmelse blitt slått ut ved hjelp av CRISPR / Cas917,18,19. Imidlertid forblir detaljerte prosedyrer for CRISPR / Cas9-påføring i dette insektet ufullstendige. Videre er noen trinn gitt av forskere for B. dorsalis genredigering også varierte og trenger standardisering. For eksempel var formene av Cas9 forskjellige i publiserte referanser17,18,19.
Dette papiret gir en systematisk metode for mutagenese av B. dorsalis ved bruk av CRISPR / Cas9-systemet, inkludert design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insektoppdrett og mutant screening. Denne protokollen vil tjene som en nyttig guide for å generere mutantfluer for forskere som er interessert i de funksjonelle genstudiene i B. dorsalis.
CRISPR/Cas9-systemet er det mest brukte genredigeringsverktøyet og har ulike anvendelser, som gentrerepy30, avl 31 og grunnleggende studier av genfuktioner32. Dette systemet er allerede tatt i bruk for genredigering hos ulike insektarter og har fungert som et effektivt verktøy for funksjonelle genstudier hos. Protokollene vi presenterer her standardiserer prosedyren for design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insekt…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) og spesielle midler for vitenskapsteknologisk innovasjon og industriell utvikling av Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02).
6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |