Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis
Summary
Questo articolo presenta i protocolli passo-passo per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis. I passaggi dettagliati forniti da questo protocollo standardizzato serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per studi genetici funzionali in B. dorsalis.
Abstract
La mosca della frutta orientale, Bactrocera dorsalis, è una specie di parassiti altamente invasiva e adattativa che causa danni agli agrumi e ad oltre 150 altre colture da frutto in tutto il mondo. Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità di volo e le femmine depongono le uova sotto le bucce della frutta, gli insetticidi che richiedono il contatto diretto con il parassita di solito funzionano male sul campo. Con lo sviluppo di strumenti biologici molecolari e la tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento, molti scienziati stanno tentando di sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell’ambiente. Questi includono RNAi o pesticidi basati sull’editing genetico che sottoregolano o silenziano i geni (bersagli molecolari), come i geni olfattivi coinvolti nel comportamento di ricerca, in vari insetti nocivi. Per adattare queste strategie per il controllo del moscerino della frutta orientale, sono necessari metodi efficaci per la ricerca genica funzionale. I geni con funzioni critiche nella sopravvivenza e nella riproduzione di B. dorsalis servono come buoni bersagli molecolari per l’abbattimento e/o il silenziamento dei geni. Il sistema CRISPR / Cas9 è una tecnica affidabile utilizzata per l’editing genetico, specialmente negli insetti. Questo articolo presenta un metodo sistematico per la mutagenesi CRISPR/Cas9 di B. dorsalis, compresa la progettazione e la sintesi di RNA guida, la raccolta di embrioni, l’iniezione di embrioni, l’allevamento di insetti e lo screening mutante. Questi protocolli serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori interessati agli studi sui geni funzionali in B. dorsalis.
Introduction
La mosca orientale della frutta, Bactrocera dorsalis , è una specie cosmopolita di insetti nocivi che causa danni a oltre 150 specie di colture da frutto, tra cui guava, mango, Eugenia spp., ciliegia del Suriname, agrumi, nespolo e papaia1. I danni causati nella sola provincia del Guangdong (Cina) sono stimati in oltre 200 milioni di yuan. Le femmine adulte inseriscono le loro uova sotto la buccia dei frutti maturi o maturi, causando il decadimento e l’abscissione del frutto, che diminuisce la qualità dei frutti e la resa complessiva del raccolto2. Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità di volo e le loro larve penetrano nella pelle del frutto, gli insetticidi che richiedono il contatto diretto con il parassita si comportano male sul campo. Inoltre, l’uso estensivo di insetticidi ha aumentato la resistenza di B. dorsalis contro vari prodotti chimici agricoli, rendendo ancora più difficile il controllo di questi parassiti dannosi3. Pertanto, lo sviluppo di strategie di gestione dei parassiti efficaci e rispettose dell’ambiente è disperatamente necessario.
Recentemente, con lo sviluppo di strumenti biologici molecolari e tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, gli scienziati stanno tentando di sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell’ambiente, come RNAi, che mirano alla funzionalità di importanti geni (bersagli molecolari) di vari insetti nocivi. I geni fondamentali per la sopravvivenza e la riproduzione dell’organismo nocivo possono essere identificati mediante studi genetici funzionali e fungere ulteriormente da potenziali bersagli molecolari per il miglioramento di strumenti di gestione fitosanitaria specificamente mirati e rispettosi dell’ambiente4. Per adattare tali strategie al controllo del moscerino della frutta orientale, sono necessari metodi efficaci per la ricerca genica funzionale.
Il sistema endonucleasico CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) è stato inizialmente scoperto nei batteri e negli archei e si è scoperto essere un meccanismo adattativo coinvolto nel riconoscimento e nella degradazione del DNA intracellulare estraneo, come quello introdotto dall’infezione dei batteriofagi5. Nel sistema CRISPR di tipo II, l’endonucleasi Cas9 è guidata da piccoli RNA associati (crRNA e tracrRNA) per scindereil DNA 6,7,8 ed è diventato uno degli strumenti più utilizzati per l’editing genetico fino ad oggi9,10,11,12. Poiché il sistema CRISPR / Cas9 ha diversi vantaggi, come l’alta efficienza del silenziamento genico e il basso costo, è già stato applicato per l’editing genetico in varie specie di insetti, tra cui Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 e Bombyx mori16. In B. dorsalis, i geni relativi al colore del corpo, al dimorfismo delle ali e alla determinazione del sesso sono stati eliminati con successo usando CRISPR / Cas917,18,19. Tuttavia, le procedure dettagliate per l’applicazione di CRISPR / Cas9 in questo insetto rimangono incomplete. Inoltre, alcuni passaggi forniti dai ricercatori per l’editing genetico di B. dorsalis sono anche vari e necessitano di standardizzazione. Ad esempio, le forme di Cas9 erano diverse nei riferimenti pubblicati17,18,19.
Questo articolo fornisce un metodo sistematico per la mutagenesi di B. dorsalis utilizzando il sistema CRISPR / Cas9, compresa la progettazione e la sintesi di RNA guida, la raccolta di embrioni, l’iniezione di embrioni, l’allevamento di insetti e lo screening mutante. Questo protocollo servirà come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori che sono interessati agli studi sui geni funzionali in B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema CRISPR / Cas9 è lo strumento di editing genetico più utilizzato e ha varie applicazioni, come il gene threpy30, il crop breeding 31 e gli studi di base sulle funzioni geniche32. Questo sistema è già stato applicato per l’editing genetico in varie specie di insetti ed è servito come strumento efficace per gli studi genetici funzionali nei parassiti. I protocolli che presentiamo qui standardizzano la procedura di progettazione e sintesi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di scienza e tecnologia di Shenzhen (sovvenzione n. KQTD20180411143628272) e fondi speciali per l’innovazione della tecnologia scientifica e lo sviluppo industriale del nuovo distretto di Shenzhen Dapeng (sovvenzione n. PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
