Summary

Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Questo articolo presenta i protocolli passo-passo per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis. I passaggi dettagliati forniti da questo protocollo standardizzato serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per studi genetici funzionali in B. dorsalis.

Abstract

La mosca della frutta orientale, Bactrocera dorsalis, è una specie di parassiti altamente invasiva e adattativa che causa danni agli agrumi e ad oltre 150 altre colture da frutto in tutto il mondo. Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità di volo e le femmine depongono le uova sotto le bucce della frutta, gli insetticidi che richiedono il contatto diretto con il parassita di solito funzionano male sul campo. Con lo sviluppo di strumenti biologici molecolari e la tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento, molti scienziati stanno tentando di sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell’ambiente. Questi includono RNAi o pesticidi basati sull’editing genetico che sottoregolano o silenziano i geni (bersagli molecolari), come i geni olfattivi coinvolti nel comportamento di ricerca, in vari insetti nocivi. Per adattare queste strategie per il controllo del moscerino della frutta orientale, sono necessari metodi efficaci per la ricerca genica funzionale. I geni con funzioni critiche nella sopravvivenza e nella riproduzione di B. dorsalis servono come buoni bersagli molecolari per l’abbattimento e/o il silenziamento dei geni. Il sistema CRISPR / Cas9 è una tecnica affidabile utilizzata per l’editing genetico, specialmente negli insetti. Questo articolo presenta un metodo sistematico per la mutagenesi CRISPR/Cas9 di B. dorsalis, compresa la progettazione e la sintesi di RNA guida, la raccolta di embrioni, l’iniezione di embrioni, l’allevamento di insetti e lo screening mutante. Questi protocolli serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori interessati agli studi sui geni funzionali in B. dorsalis.

Introduction

La mosca orientale della frutta, Bactrocera dorsalis , è una specie cosmopolita di insetti nocivi che causa danni a oltre 150 specie di colture da frutto, tra cui guava, mango, Eugenia spp., ciliegia del Suriname, agrumi, nespolo e papaia1. I danni causati nella sola provincia del Guangdong (Cina) sono stimati in oltre 200 milioni di yuan. Le femmine adulte inseriscono le loro uova sotto la buccia dei frutti maturi o maturi, causando il decadimento e l’abscissione del frutto, che diminuisce la qualità dei frutti e la resa complessiva del raccolto2. Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità di volo e le loro larve penetrano nella pelle del frutto, gli insetticidi che richiedono il contatto diretto con il parassita si comportano male sul campo. Inoltre, l’uso estensivo di insetticidi ha aumentato la resistenza di B. dorsalis contro vari prodotti chimici agricoli, rendendo ancora più difficile il controllo di questi parassiti dannosi3. Pertanto, lo sviluppo di strategie di gestione dei parassiti efficaci e rispettose dell’ambiente è disperatamente necessario.

Recentemente, con lo sviluppo di strumenti biologici molecolari e tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, gli scienziati stanno tentando di sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell’ambiente, come RNAi, che mirano alla funzionalità di importanti geni (bersagli molecolari) di vari insetti nocivi. I geni fondamentali per la sopravvivenza e la riproduzione dell’organismo nocivo possono essere identificati mediante studi genetici funzionali e fungere ulteriormente da potenziali bersagli molecolari per il miglioramento di strumenti di gestione fitosanitaria specificamente mirati e rispettosi dell’ambiente4. Per adattare tali strategie al controllo del moscerino della frutta orientale, sono necessari metodi efficaci per la ricerca genica funzionale.

Il sistema endonucleasico CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) è stato inizialmente scoperto nei batteri e negli archei e si è scoperto essere un meccanismo adattativo coinvolto nel riconoscimento e nella degradazione del DNA intracellulare estraneo, come quello introdotto dall’infezione dei batteriofagi5. Nel sistema CRISPR di tipo II, l’endonucleasi Cas9 è guidata da piccoli RNA associati (crRNA e tracrRNA) per scindereil DNA 6,7,8 ed è diventato uno degli strumenti più utilizzati per l’editing genetico fino ad oggi9,10,11,12. Poiché il sistema CRISPR / Cas9 ha diversi vantaggi, come l’alta efficienza del silenziamento genico e il basso costo, è già stato applicato per l’editing genetico in varie specie di insetti, tra cui Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 e Bombyx mori16. In B. dorsalis, i geni relativi al colore del corpo, al dimorfismo delle ali e alla determinazione del sesso sono stati eliminati con successo usando CRISPR / Cas917,18,19. Tuttavia, le procedure dettagliate per l’applicazione di CRISPR / Cas9 in questo insetto rimangono incomplete. Inoltre, alcuni passaggi forniti dai ricercatori per l’editing genetico di B. dorsalis sono anche vari e necessitano di standardizzazione. Ad esempio, le forme di Cas9 erano diverse nei riferimenti pubblicati17,18,19.

Questo articolo fornisce un metodo sistematico per la mutagenesi di B. dorsalis utilizzando il sistema CRISPR / Cas9, compresa la progettazione e la sintesi di RNA guida, la raccolta di embrioni, l’iniezione di embrioni, l’allevamento di insetti e lo screening mutante. Questo protocollo servirà come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori che sono interessati agli studi sui geni funzionali in B. dorsalis.

Protocol

1. Progettazione del target e sintesi in vitro di sgRNA Prevedere la struttura dei geni bersaglio di interesse e determinare i confini tra esoni e introni tramite l’analisi bioinformatica del genoma di B. dorsalis (le applicazioni software utilizzate qui sono elencate nella Tabella dei materiali).NOTA: BLAT20 è stato utilizzato per cercare potenziali loci genici nel genoma. Le letture di alta qualità dell’RNA-seq (trascr…

Representative Results

Questo protocollo presenta passaggi dettagliati per lo sviluppo di mutanti di B. dorsalis utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9, compresi i risultati rappresentativi della selezione del gDNA, la raccolta di embrioni e microiniezione, il mantenimento degli insetti e lo screening dei mutanti. L’esempio del sito bersaglio del gene selezionato si trova nel terzo esone (Figura 1C). Questo sito è altamente conservato e una singola banda è stata rilevata med…

Discussion

Il sistema CRISPR / Cas9 è lo strumento di editing genetico più utilizzato e ha varie applicazioni, come il gene threpy30, il crop breeding 31 e gli studi di base sulle funzioni geniche32. Questo sistema è già stato applicato per l’editing genetico in varie specie di insetti ed è servito come strumento efficace per gli studi genetici funzionali nei parassiti. I protocolli che presentiamo qui standardizzano la procedura di progettazione e sintesi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di scienza e tecnologia di Shenzhen (sovvenzione n. KQTD20180411143628272) e fondi speciali per l’innovazione della tecnologia scientifica e lo sviluppo industriale del nuovo distretto di Shenzhen Dapeng (sovvenzione n. PT202101-02).

Materials

6x DNA Loading Buffer TransGen Biotech GH101-01
Artificial climate chamber ShangHai BluePard MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit Axygen AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT NA NA For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass WPI  1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Hisat2 NA NA For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV NA NA For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder NARISHIGE EG-401
Olympus Microscope Olympus Corporation SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit TransGen Biotech CB101-02 https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers Instrument Company  https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040A
SAMtools NA NA For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI NA NA sgRNA design
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter  Instrument Company  P-97
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech BM101-02
Transdecoder NA NA For combining the results of assemble transcripts and gene loci information
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36498
Ultra-trace biological detector Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000C

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Cite This Article
Yuan, J., Zhang, J., Zhang, Y., QiQiGe, W., Liu, W., Yan, S., Wang, G. Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis. J. Vis. Exp. (187), e64195, doi:10.3791/64195 (2022).

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