Summary
Dit artikel presenteert de stapsgewijze protocollen voor CRISPR/Cas9-mutagenese van de Oosterse fruitvlieg Bactrocera dorsalis. Gedetailleerde stappen in dit gestandaardiseerde protocol zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor functionele genstudies in B. dorsalis.
Abstract
De Oosterse fruitvlieg, Bactrocera dorsalis, is een zeer invasieve en adaptieve plaagsoort die wereldwijd schade toebrengt aan citrusvruchten en meer dan 150 andere fruitgewassen. Omdat volwassen fruitvliegen een grote vliegcapaciteit hebben en vrouwtjes hun eieren onder de schil van fruit leggen, presteren insecticiden die direct contact met de plaag vereisen meestal slecht in het veld. Met de ontwikkeling van moleculair biologische hulpmiddelen en high-throughput sequencing-technologie proberen veel wetenschappers milieuvriendelijke plaagbestrijdingsstrategieën te ontwikkelen. Deze omvatten RNAi of op genbewerking gebaseerde pesticiden die genen (moleculaire doelen) downreguleren of tot zwijgen brengen, zoals olfactorische genen die betrokken zijn bij zoekgedrag, in verschillende insectenplagen. Om deze strategieën voor oosterse fruitvliegbestrijding aan te passen, zijn effectieve methoden voor functioneel genonderzoek nodig. Genen met kritische functies in de overleving en reproductie van B. dorsalis dienen als goede moleculaire doelwitten voor gen knockdown en/of silencing. Het CRISPR/Cas9-systeem is een betrouwbare techniek die wordt gebruikt voor genbewerking, vooral bij insecten. Dit artikel presenteert een systematische methode voor CRISPR/Cas9-mutagenese van B. dorsalis, inclusief het ontwerp en de synthese van gids-RNA's, het verzamelen van embryo's, embryo-injectie, insectenopfok en mutantscreening. Deze protocollen zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in functionele genstudies in B. dorsalis.
Introduction
De Oosterse fruitvlieg, Bactrocera dorsalis, is een kosmopolitische insectenplaagsoort die schade toebrengt aan meer dan 150 soorten fruitgewassen, waaronder guave, mango, Eugenia spp., Surinaamse kers, citrus, loquat en papaja1. De schade die alleen al in de provincie Guangdong (China) is aangericht, wordt geschat op meer dan 200 miljoen yuan. Volwassen vrouwtjes brengen hun eieren onder de schil van rijpend of gerijpt fruit, waardoor bederf en abscissie van het fruit ontstaat, wat de vruchtkwaliteit en de algehele opbrengst van het gewas vermindert2. Omdat volwassen fruitvliegen een grote vliegcapaciteit hebben en hun larven zich in de vruchthuid boren, presteren insecticiden die direct contact met de plaag vereisen slecht in het veld. Bovendien heeft het uitgebreide gebruik van insecticiden de resistentie van B. dorsalis tegen verschillende landbouwchemicaliën verhoogd, waardoor de bestrijding van deze schadelijke plagen nog moeilijkerwordt 3. Daarom is de ontwikkeling van effectieve en milieuvriendelijke strategieën voor ongediertebestrijding hard nodig.
Onlangs, met de ontwikkeling van moleculair biologische hulpmiddelen en high-throughput sequencing-technologieën, proberen wetenschappers milieuvriendelijke plaagbestrijdingsstrategieën te ontwikkelen, zoals RNAi, die zich richten op de functionaliteit van belangrijke genen (moleculaire doelen) van verschillende insectenplagen. Genen die van cruciaal belang zijn voor de overleving en reproductie van het plaagorganisme kunnen worden geïdentificeerd door middel van functionele genstudies en dienen verder als potentiële moleculaire doelen voor de verbetering van specifiek gerichte en milieuvriendelijke plaagbestrijdingsinstrumenten4. Om dergelijke strategieën aan te passen aan oosterse fruitvliegbestrijding, zijn effectieve methoden voor functioneel genonderzoek nodig.
Het CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) endonucleasesysteem werd aanvankelijk ontdekt in bacteriën en archaea en bleek een adaptief mechanisme te zijn dat betrokken is bij de herkenning en afbraak van vreemd intracellulair DNA, zoals dat werd geïntroduceerd door bacteriofagen te infecteren5. In het type II CRISPR-systeem wordt Cas9-endonuclease geleid door kleine geassocieerde RNA's (crRNA en tracrRNA) om 6,7,8 te breken en is het een van de meest gebruikte hulpmiddelen voor genbewerking tot nu toe geworden 9,10,11,12. Omdat het CRISPR/Cas9-systeem verschillende voordelen heeft, zoals een hoge efficiëntie van gen-uitschakeling en lage kosten, is het al toegepast voor genbewerking bij verschillende insectensoorten, waaronder Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 en Bombyx mori16. In B. dorsalis zijn genen die verband houden met lichaamskleur, vleugeldimorfisme en geslachtsbepaling met succes uitgeschakeld met CRISPR / Cas9 17,18,19. Gedetailleerde procedures voor CRISPR/Cas9-toepassing in dit insect blijven echter onvolledig. Bovendien zijn sommige stappen die onderzoekers bieden voor B. dorsalis-genbewerking ook gevarieerd en hebben ze behoefte aan standaardisatie. De vormen van Cas9 waren bijvoorbeeld verschillend in gepubliceerde referenties 17,18,19.
Dit artikel biedt een systematische methode voor mutagenese van B. dorsalis met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem, inclusief het ontwerp en de synthese van gids-RNA's, het verzamelen van embryo's, embryo-injectie, insectenopfok en mutantscreening. Dit protocol zal dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de functionele genstudies in B. dorsalis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Doelontwerp en in vitro synthese van sgRNA
- Voorspel de structuur van doelgenen van belang en bepaal de grenzen tussen exonen en introns via bioinformatische analyse van het B. dorsalis-genoom (softwaretoepassingen die hier worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen).
OPMERKING: BLAT20 werd gebruikt om potentiële gen loci in het genoom te zoeken. De hoogwaardige RNA-seq reads (transcriptoom) werden uitgelijnd op het verworven gen loci met behulp van Hisat221. Samtools22 werd gebruikt om de gesorteerde bam-bestanden te genereren. De gesorteerde bam-bestanden werden ingevoerd in Stringtie223 om de transcripties te leveren. De samengestelde transcripten en gen loci-informatie werden gecombineerd door Transdecoder24. De resultaten van Transdecoder werden gevisualiseerd in IGV-tools25 en de grenzen tussen exonen en introns konden worden bepaald. - Identificeer de geschikte doelgebieden binnen de kandidaat-doelgensite. De totale lengte moet minder dan 750 bp zijn voor een gemakkelijkere volgorde (figuur 1B). Ontwerp specifieke primers om het doelgebied uit wild-type genomisch DNA te versterken door PCR (Figuur 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Kloon de PCR-producten tot een stompe eindvector26 en selecteer 20 individuele bacteriekolonies voor sequencing om te bepalen hoe geconserveerd het doelgebied is in de laboratoriuminsectenpopulaties.
- Een typische doellocatie bevat een drie-nucleotide sequentiemotief (NGG of CCN) en een 20 bp-sequentie naast de NGG- of CCN-motieven (20 bp-NGG of CCN-20 bp). Straal de kandidaat-doellocaties tegen het B. dorsalis-genoom en zorg ervoor dat de voorspelde efficiëntie hoog genoeg is en de off-targeting rate laag; verschillende open-source softwareprogramma's kunnen dit automatisch voorspellen. In dit protocol wordt sgRNAcas9 -AI27 gebruikt om de optimale doelen te selecteren en te evalueren. Details over het gebruik zijn te vinden in de handleiding voor deze software.
OPMERKING: Mogelijke doellocaties die gesloten zijn voor de 5 'UTR van het doelgen en 1-2 Gs aan het begin van de 20 bp-sequentie hebben de voorkeur. Om een grote deletie te bereiken die zal worden geïdentificeerd door PCR gevolgd door agarose gel elektroforese, wordt het ontwerpen van twee doelen28 gescheiden door meer dan 100 bp aanbevolen (figuur 1C). - Gebruik de in de handel verkrijgbare gRNA-synthesekit om het ontworpen sgRNA te genereren. Voer elke stap uit volgens de gebruikershandleiding. Resuspendeer het gRNA-product in nucleasevrij water, kwantificeer de concentratie met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer en bewaar het bij -80 °C voor gebruik (de concentratie van succesvol gesynthetiseerd enkelvoudig gRNA [10 μL] met de hier gebruikte kit is ongeveer 4000-6000 ng / μL, of zelfs hoger).
OPMERKING: Hoewel het genereren van de mutante vliegen de eerste stap is voor elke onderzoeker, is de juiste negatieve controle voor downstream experiment / analyse van cruciaal belang. Het genereren van deze controles naast de mutanten bespaart onderzoekers tijd en moeite. Stel bijvoorbeeld scrambled sgRNA in als een negatieve controle.
2. Embryoverzameling en -voorbereiding
- Plaats B. dorsalis poppen in plastic kooien. Zorg voor een mengsel van suiker en gist (1:1) als voedsel samen met een waterbron nadat de volwassenen eclose (figuur 2A, B). De opfokomstandigheden zijn 55% relatieve vochtigheid (RV), 26,5 ° C en een 14:10 L / D-cyclus (lichten aan om zes uur 's ochtends, lichten uit om acht uur 's avonds).
- De meeste volwassenen bereiken 10 dagen na opkomst geslachtsrijpheid. Zorg voor een geschikte omgeving om volwassen vliegen zoveel mogelijk te helpen paren. Gebruik idealiter een lichtstandaard met een licht van 30-50 lux. Dit kan de vruchtbaarheid van vrouwtjes verbeteren, waardoor de efficiëntie van het verzamelen van embryo's wordt verbeterd.
OPMERKING: Het plaatsen van de volwassenen (5-6 dagen na opkomst) in een slecht verlichte (<100 lux) omgeving kan de paring bevorderen. Over het algemeen vindt de piek van ovipositie plaats om 15:00 uur (14:10 / L: D, lichten aan 06:00 uur, lichten uit om 20:00 uur); om voldoende embryo's te verkrijgen, wordt aanbevolen om ovipositiekamers 30 minuten voor 15:00 uur in de kooien te plaatsen. - Plaats een gaas van 200 mazen in de ovipositiekamer, op 1-2 mm afstand van het deksel van de kamer. Dit zal helpen bij het verkrijgen van zoveel mogelijk embryo's.
OPMERKING: Vermijd het laten weken van de embryo's in sinaasappelsap of ingewreven met gaas, omdat dit de overlevingskans van de embryo's aanzienlijk kan verminderen. - Plaats een nieuwe ovipositiekamer in de kooi wanneer de micro-injectie-opstelling klaar is. Verzamel de embryo's elke 10 minuten met een fijne natte borstel en lijn ze vervolgens uit op een zelfgemaakte injectieplaat (plexiglas met een lengte van 55 mm, een breedte van 13,75 mm en een hoogte van 5 mm, A 45 mm x 5 mm x 0,3 mm ondiepe groef wordt in het midden geopend om de plaatsing van eieren te vergemakkelijken). Als de embryo's een hoge inwendige druk hebben, is lichte uitdroging bij <10% RV gedurende 10 minuten optioneel. Dompel de embryo's tijdens de injectie in halocarbonolie om verdere uitdroging te voorkomen (figuur 2C).
3. Micro-injectie van het embryo
- Bereid de glazen injectienaald voor met een micropipettetrekker.
OPMERKING: Het instellen van de parameters volgens de gebruikershandleiding is belangrijk. In deze protocollen kunnen verschillende naaldvormen worden gemaakt met behulp van de parameters die worden voorgesteld door de handleiding van de micropipettetrekker. Het glazen capillair moet zo schoon mogelijk zijn om te voorkomen dat stof de naald verstopt. - Bereid de werkoplossing voor. Meng het Cas9-eiwit en het bijbehorende sgRNA tot de volgende werkconcentraties: sgRNA, 300 ng/μL; Cas9-eiwit, 150 ng/μL. Voeg 1 μL fenolrood toe aan het mengsel om te dienen als een handige manier om geïnjecteerde embryo's te markeren. Plaats het bereide mengsel op ijs om afbraak van het sgRNA te voorkomen.
OPMERKING: Gebruik nucleasevrije pipetpunten en PCR-buizen. De concentratie Cas9-eiwit moet lager zijn dan of gelijk zijn aan 150 ng/μL; hogere concentraties zijn giftig en verminderen de overlevingskans van het embryo aanzienlijk. Cas9 kan ook in DNA- of mRNA-formaat worden geleverd om succesvolle genbewerking te bereiken17,19. In dit protocol wordt Cas9-eiwit aanbevolen omdat mRNA's gevoelig zijn voor afbraak en de expressie van Cas9-eiwit uit plasmide-DNA tijd nodig heeft voor transcriptie en translatie. - Stel de parameters voor de injector in. Het initiële programma is Pi-500 hPa, Ti-0.5 s en PC-200 hPa. Pas deze parameters indien nodig verder aan tijdens micro-injectie.
- Voeg 3 μL van het mengsel toe aan de injectienaald. Vermijd het introduceren van luchtbellen die mogelijk de naald kunnen verstoppen. Open de naald met een Microgrinder.
- Sluit de naald aan op de micromanipulator volgens de gebruikershandleiding (figuur 2E).
- Leg het bord met opgestelde embryo's op de objectieve tafel. Pas de positie van de micropipette aan onder een fijne optische microscoop en zet de micropipette en het embryo op hetzelfde vlak. Pas het druppelvolume aan door op het pedaal te drukken; 1/10 het volume embryo's wordt aanbevolen.
- Steek de naaldpunt in de achterste (plantaardige pool) van het embryo. Breng de mengsels in het embryo door het pedaal van de injector in te drukken. Als fenolrood wordt toegevoegd, wordt onmiddellijk een enigszins roodachtige kleur waargenomen.
OPMERKING: Een klein volume cytoplasmatische terugstroom uit het gaatje zal de overlevingskans van het embryo niet verminderen. Injectie van 200 embryo's is voldoende voor een succesvolle mutagenese van één gen. Het toevoegen van meer halocarbonolie om de embryo's onder te dompelen, kan verdere uitdroging voorkomen. De injectie moet worden uitgevoerd vóór de vorming van poolcellen, wat ervoor zorgt dat elke mutatie efficiënt kan worden geërfd.
4. Insectenopfok na injectie
- Plaats de injectieplaat met de geïnjecteerde embryo's in een kunstmatige klimaatkamer die op 55% RV, 26,5 ° C en een 14: 10 L / D-cyclus wordt gehouden (lichten aan om zes uur 's ochtends, lichten uit om acht uur 's avonds).
- Na injectie duurt de embryovorming meestal 24 uur om te voltooien en 36 uur om uit te komen. Gebruik een fijnborstel om de larven over te brengen op een voorbereid larvaal dieet. Verzamel larven drie of vier keer per dag totdat er geen larven meer uitkomen. Over het algemeen hebben larven 2-3 dagen nodig om het uitkomen te voltooien en binnen 7 dagen te verpoppen.
OPMERKING: Een op maïs gebaseerd dieet werd gebruikt om de larven te voeden. Het recept bevat 150 g maïsmeel, 150 g banaan, 0,6 g natriumbenzoaat, 30 g gist, 30 g sucrose, 30 g keukenpapier, 1,2 ml zoutzuur en 300 ml water29. Minimaliseer de tijd dat larven in olie achterblijven (<2 uur). Verplaats de larven onmiddellijk na het uitkomen zo ver mogelijk naar het dieet. Dit kan de overlevings- en verpoppingspercentages aanzienlijk verhogen. Geef niet te veel dieet (een dieet met 2/3 van een petrischaaltje van 90 mm is genoeg voor 30 larven); anders zal het beschimmelend worden en de overlevingskans van de larven verminderen. - Leg de volwassen larven in het natte zand om te verpoppen. De verpoppingsfase duurt ongeveer 10 dagen. Verplaats de poppen naar plastic kooien voordat de eclosie begint.
5. Screening van mutanten
- Een stroomschema van de mutantenscreening is geïllustreerd in figuur 3A. Kruis G0-volwassenen verkregen door micro-injectie met wild-type volwassenen om heterozygote lijnen te verkrijgen. Controleer het type mutaties dat de nakomelingen (G1) dragen door genotypering.
- Kruis G1 met hetzelfde mutante genotype om homozygote lijnen in G2 te verkrijgen. Als genotypen van de mutanten in G1 totaal verschillend zijn, kruis dan de heterozygoten met wild-type vliegen. Homozygote lijnen worden meestal verkregen in G3. Onderhoud twee of drie homozygote lijnen voor volgende fenotyperingsexperimenten.
- Gebruik het genomische DNA van een vers poparium of een enkel middenbeen van individuele volwassenen om genotypering uit te voeren. Ontwerp specifieke primers om het doelgebied te versterken; de primers moeten ten minste 50 bps stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doellocatie zetten. Raadpleeg stap 1.2 voor de details van de primer.
OPMERKING: Aangezien de hoeveelheid DNA in een poparium extreem laag is, worden commercieel verkrijgbare DNA-extractiekits aanbevolen. - Voer PCR uit met de volgende fietsomstandigheden: 98 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 15 s bij een gloeitemperatuur die geschikt is voor de ontworpen primers, 72 °C gedurende 35 s, gevolgd door een laatste verlenging van 72 °C gedurende 10 minuten.
- Volg de gezuiverde PCR-producten op een rij. Wanneer meerdere overlappende pieken naast de doellocatie worden gedetecteerd (figuur 3B), is succesvolle mutagenese opgetreden. Sub-kloon de gezuiverde PCR-producten in een stompe eindvector en selecteer 10 individuele bacteriekolonies voor sequencing om het genotype van de mutanten te verifiëren. Behoud de lijnen met frameshiftmutaties en voortijdige translatie-beëindigingen (figuur 3C).
OPMERKING: Het is niet nodig om single clone sequencing uit te voeren om het genotype van G0-individuen te verifiëren. Volg gewoon de PCR-producten en onderhoud de individuen met duidelijke meerdere overlappieken naast de doellocatie. Na de eerste injectie wordt aanbevolen om 10 embryo's te selecteren om genomisch DNA te extraheren en de PCR-producten te sequencen op basis van de normen in stap 5.3. Dit kan helpen om de mutatiesnelheden van tevoren te voorspellen. In deze studie werd sanger sequencing om het genotype te bepalen gedaan door een sequencing bedrijf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol presenteert gedetailleerde stappen voor de ontwikkeling van B. dorsalis-mutanten met behulp van CRISPR / Cas9-technologie, inclusief representatieve resultaten van gDNA-selectie, het verzamelen van embryo's en micro-injectie, insectenonderhoud en mutantenscreening.
Het voorbeeld van de doellocatie van het geselecteerde gen bevindt zich in het derde exon (figuur 1C). Deze site is zeer geconserveerd en een enkele band werd gedetecteerd door gel-elektroforese voor het DNA-sjabloon voor synthetisch gRNA (figuur 1D) en gRNA verkregen door in vitro transcriptie (figuur 1E).
Injectie in 200 vers geoogste eieren werd uitgevoerd zoals beschreven in rubriek 3. De embryo's werden onderhouden volgens de protocollen beschreven in stap 4.1-4.3. Zoals gedetecteerd door de PCR-producten te sequencen, is 80% van de G0-individuen mozaïekmutanten (tabel 1). Hier werden mutanten met 8 bp-deletie geselecteerd die resulteerden in voortijdige beëindiging van aminozuurtransformatie in G1 (figuur 3C). Dit zou moeten leiden tot veranderingen in de overeenkomstige functies van dit genproduct in B. dorsalis. De geselecteerde G1 werden gekruist met wild-type om G2-heterozygoten te verkrijgen. Zelfkruising de G2 heterozygoten en homozygoten werden teruggevonden in de volgende generatie, wat aantoont dat dit schema succesvol is voor het ontwikkelen van B. dorsalis mutanten en op grotere schaal kan worden toegepast in functionele genstudies bij deze en nauw verwante soorten.
Figuur 1: Bereiding van sgRNA. (A) Algemene procedures voor sgRNA-bereiding. (B) Doelgebied versterkt met PCR uit gDNA (100 bp). (C) Voorbeeld van de doelgenstructuur en de plaats van de doelsplitsing door Cas9. (D) PCR-assemblage van sgRNA (~100 bp). (E) Synthese van sgRNA door in vitro transcriptie en zuivering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Embryo-micro-injectie. (A) Het proces en de injectiemethode. (B) Embryo-verzamelinrichting, eieren leggen op gaas. (C) Lijn embryo's uit met water en bedek met halokoolstofolie. (D) Micropipette trekker. (E) De gehele opzet van het micro-injectiesysteem. Microscoop (links), microinjector en micromanipulator (midden) en automatische luchtpomp (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Mutantenscreening. (A) Paring van mutanten en verwerving van homozygoten. B) PCR-producten uit het mutantengenoom dat een afzonderlijke reeks pieken bij het doelwit genereert. (C) Een van de mutatietypen en aminozuurveranderingen. Deletiemutaties leiden tot voortijdige beëindiging van de vertaling. Afkortingen: HE = heterozygoten, HO = homozygoten. Controle: embryo geïnjecteerd met scrambled sgRNA's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Injectie mix | Geïnjecteerde embryo's | Uitgekomen larven | Poppen | Mozaïek G0 | ||
| (Mozaïek/Totaal volwassenen) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Fenol rood (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Fenol rood (1 μL) | ||||||
Tabel 1: B. dorsalis overleving en mutagenese na micro-injecties.
| Probleem | Mogelijke oorzaak(en) | Oplossingen | |
| Inefficiënte embryoverzameling | 1. Volwassenen zijn in slechte conditie | 1.Zorg voor de beschikbaarheid van voedsel en water, met name het suikergehalte van het voedsel. | |
| 2. Onvoldoende paring | 2. Paring vooraf onder 30-50 Lux dim omstandigheden. Het is het beste om 12-15 dagen oude gepaarde volwassenen te selecteren. | ||
| Slechte uitkomst van eieren na injectie | 1. Embryo's van slechte kwaliteit | 1. Pluk verse en mollige eieren en borstel ze voorzichtig met een met water doordrenkte borstel. | |
| 2. Naald past niet | 2. De punt van de naald is zo klein mogelijk om schade aan het ei tijdens de injectie te minimaliseren. | ||
| 3. Onjuiste opfok van eieren na injectie | 3. Eieren moeten na injectie gehydrateerd worden gehouden om uitdroging te voorkomen. Eieren kunnen ook direct na injectie op voedsel worden overgebracht. | ||
| Lage overlevingskans van larven | 1. Beschimmeld voedsel is niet geschikt voor de groei van larven | 1. Voeg voor nieuw uitgekomen larven een kleine hoeveelheid voedsel toe. Te veel voedsel zal schimmelen of uitdrogen en de groei van de larven beïnvloeden. | |
| 2. Pas uitgekomen larven lange tijd gedrenkt in olie | 2.De nieuw uitgekomen larven moeten op tijd worden overgebracht naar het larvale voedsel of de eieren moeten na injectie rechtstreeks in het voedsel worden geplukt. | ||
| Volwassen mutatiesnelheid is laag | 1. Lage kwaliteit van gRNA | 1. Rigoureuze experimentele operatie om hoogwaardig gRNA te synthetiseren om afbraak te voorkomen. | |
| 2. Inefficiënte doelen leiden tot off-targets | 2. Screening van hoogrenderende doelstellingen door middel van zoals onze discussie vermeldde. | ||
Tabel 2: Mogelijke problemen met het construeren van mutanten, mogelijke oorzaken en oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het CRISPR/Cas9-systeem is de meest gebruikte genbewerkingstool en heeft verschillende toepassingen, zoals gene threpy30, crop breeding31 en basisstudies van genfuctions32. Dit systeem is al toegepast voor genbewerking bij verschillende insectensoorten en heeft gediend als een effectief hulpmiddel voor functionele genstudies bij plagen. De protocollen die we hier presenteren, standaardiseren de procedure voor het ontwerp en de synthese van gids-RNA's, het verzamelen van embryo's, embryo-injectie, het fokken van insecten en het screenen van mutanten. Bovendien werd een tabel voor probleemoplossing toegevoegd om het potentiële probleem van elke stap samen te vatten, en hun oplossingen werden geleverd om de werklast te verlichten en de efficiëntie te verbeteren (tabel 2). Deze procedure biedt een betrouwbare manier om interessante genen te bewerken en verbetert de functionele genomische studies in B. dorsalis.
Ten eerste is doelgenselectie van cruciaal belang voor het verhogen van de efficiëntie van het CRISPR / Cas9-systeem, en verschillende open source-softwareprogramma's zoals ChopChop33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0) 35 en CRISPR optimal target finder36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) kunnen automatisch doelen genereren en potentiële off-target rates voorspellen. Aangezien de hoge vruchtbaarheid van B. dorsalis de embryoverzameling vergemakkelijkt, kunnen mutantensnelheden worden voorspeld door een deel van de embryo's op te offeren voor DNA-extractie en sequencing van het doelgebied. Als sequencing niet beschikbaar is in het laboratorium, wordt het gebruik van T7-endonuclease I om mutatiesnelheden te voorspellen ook aanbevolen37. Doellocaties met hoge genomische deletiepercentages kunnen via deze drie methoden worden geselecteerd en daarom kan de efficiëntie van genbewerking in B. dorsalis worden verhoogd.
De ontwikkelingsfase van het embryo bepaalt of mutaties worden overgeërfd. Om erfelijke mutaties te verkrijgen, moet genbewerking plaatsvinden in geslachtscellen. Over het algemeen kan het mengsel van sgRNA en Cas9 niet in geslachtscellen worden afgeleverd nadat de vorming van poolcellen heeft plaatsgevonden. Bij B. dorsalis vond de vorming van de poolcel plaats op 3 uur na het leggen van de eieren38, terwijl het protocol dat hier wordt beschreven voor B. dorsalis 30 minuten duurt vanaf het verzamelen van embryo's tot het einde van de micro-injectie. Tijdens injectie worden bijna geen poolcellen gevormd in het plantaardige uiteinde van het embryo; daarom moeten genmutaties verkregen in de G0 efficiënt worden overgeërfd. De tijd die door micro-injectie wordt verbruikt, is ook minder dan de methode die wordt genoemd in eerder gepubliceerde artikelen (over het algemeen 1-3 uur)18,19.
Het is belangrijk om mechanische of chemische schade te minimaliseren tijdens het proces van embryoverzameling en -behandeling. Gebruik een fijne borstel om embryo's voorzichtig op de injectieplaat te plaatsen. De positie van de injectie moet het werk weerspiegelen dat eerder is gedaan in Drosophila (Methoden - het laboratorium van Nicolas Gompel, http://gompel.org/methods) en Ceratitis capitata39. Injecteer embryo's op de plantaardige pool; steek de naald nooit in de dierenpaal. Bereid de naald voor volgens de micropipette-trekkergeleider; de opening van de naald moet zo klein mogelijk zijn om overmatige cytoplasmatische terugstroom te voorkomen. De methode die in gepubliceerde studies in B. dorsalis wordt genoemd, dechorioneerde de embryo's over het algemeen met natriumhypochoriet 17,18,19; dit kan chemische schade veroorzaken en de overlevingskansen van de embryo's verminderen. In dit protocol worden embryo's niet gedechorioneerd en werkt injectie nog steeds goed. De chemische schade aan de embryo's kan minimaal zijn.
Het kweken van insecten na injectie is erg belangrijk. Het gestandaardiseerde opfokprotocol dat hier wordt verstrekt, kan dienen als referentie voor het fokken van andere fruitvliegsoorten, met name Bactrocera-soorten . De embryo's kunnen worden ondergedompeld in olie om uitdroging tijdens de injectie met behulp van onze zelfgemaakte injectieplaat te voorkomen. Minimaliseer de tijd die larven in de olie doorbrengen (<2 uur) om overlevingskansen in de G0 boven 50% te bereiken.
Een niet-invasieve methode van genomische DNA-extractie wordt aanbevolen voor mutantdetectie. Sommige lepidoptera-onderzoekers suggereren bijvoorbeeld dat de exuviaten van de uiteindelijke instarlarven kunnen worden gebruikt om genomisch DNA te extraheren voor verdere genotypering. Voor B. dorsalis is een niet-invasieve methode het extraheren van genomisch DNA uit een vers poparium. Injectie van meerdere sgRNA's gericht op een markergen en het gen van belang zou ook de identificatie van mutanten kunnen verbeteren. Co-geïnjecteerde sgRNA's gericht op oogkleur (kmo) en juveniele hormoonreceptor (Met) kunnen bijvoorbeeld 75% van de nakomelingen produceren met dubbele mutaties in muggen. Met mutanten werden voorlopig gescreend op basis van de oogkleur van larven37. Dit moet in de toekomst in B. dorsalis worden geëvalueerd om de werkzaamheid van genbewerking bij deze insectensoort verder te verbeteren door gebruik te maken van het CRISPR/Cas9-systeem.
Kortom, het CRSIPR/Cas9-systeem is een krachtig hulpmiddel in functionele genomica in B. dorsalis. Onze gedetailleerde protocollen bieden nuttige informatie om onderzoekers te helpen bij het bereiken van een efficiënte embryoverzameling, ideale overlevingskansen van larven en de gewenste bewerkingsefficiëntie. Dit zou een eenvoudige en snelle manier kunnen zijn om onderzoekers te helpen mutagenese te verkrijgen in B. dorsalis. Deze techniek kon niet worden toegepast in de functionele studies van dodelijke genen, omdat de erfelijke mutaties succesvolle kruisingen nodig hebben. Toekomstige studies zouden zich kunnen richten op het ontwikkelen van transgene hulpmiddelen om stadium- of weefselspecifieke CRISPR-elementen tot expressie te brengen om deze beperking te doorbreken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) en speciale fondsen voor innovatie op het gebied van wetenschapstechnologie en industriële ontwikkeling van Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
