Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis
Summary
Este artículo presenta los protocolos paso a paso para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis. Los pasos detallados proporcionados por este protocolo estandarizado servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para estudios de genes funcionales en B. dorsalis.
Abstract
La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis, es una especie de plaga altamente invasiva y adaptativa que causa daños a los cítricos y a más de 150 cultivos frutales en todo el mundo. Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran capacidad de vuelo y las hembras ponen sus huevos debajo de las pieles de la fruta, los insecticidas que requieren contacto directo con la plaga generalmente funcionan mal en el campo. Con el desarrollo de herramientas de biología molecular y tecnología de secuenciación de alto rendimiento, muchos científicos están tratando de desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente. Estos incluyen ARNi o pesticidas basados en la edición de genes que regulan a la baja o silencian los genes (objetivos moleculares), como los genes olfativos involucrados en el comportamiento de búsqueda, en varias plagas de insectos. Para adaptar estas estrategias para el control de la mosca oriental de la fruta, se necesitan métodos efectivos para la investigación genética funcional. Los genes con funciones críticas en la supervivencia y reproducción de B. dorsalis sirven como buenos objetivos moleculares para la eliminación y / o silenciamiento de genes. El sistema CRISPR/Cas9 es una técnica fiable utilizada para la edición de genes, especialmente en insectos. Este artículo presenta un método sistemático para la mutagénesis CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, incluido el diseño y la síntesis de ARN guía, la recolección de embriones, la inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes. Estos protocolos servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores interesados en estudios de genes funcionales en B. dorsalis.
Introduction
La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis , es una especie cosmopolita de plaga de insectos que causa daños a más de 150 especies de cultivos frutales, incluyendo guayaba, mango, Eugenia spp., cereza de Surinam, cítricos, níspero y papaya1. Los daños causados solo en la provincia de Guangdong (China) se estiman en más de 200 millones de yuanes. Las hembras adultas insertan sus huevos debajo de la piel de los frutos maduros o maduros, causando caries y abscisión del fruto, lo que disminuye la calidad del fruto y el rendimiento general del cultivo2. Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran capacidad de vuelo y sus larvas perforan la piel de la fruta, los insecticidas que requieren contacto directo con la plaga funcionan mal en el campo. Además, el uso extensivo de insecticidas ha aumentado la resistencia de B. dorsalis contra diversos productos químicos agrícolas, lo que dificulta aún más el control de estas plagas dañinas3. Por lo tanto, se necesita desesperadamente el desarrollo de estrategias de manejo de plagas efectivas y respetuosas con el medio ambiente.
Recientemente, con el desarrollo de herramientas biológicas moleculares y tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los científicos están tratando de desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente, como el ARNi, que se dirigen a la funcionalidad de genes importantes (objetivos moleculares) de varias plagas de insectos. Los genes que son críticos para la supervivencia y reproducción de la plaga pueden identificarse a través de estudios genéticos funcionales y además sirven como posibles objetivos moleculares para la mejora de herramientas de manejo de plagas específicamente específicas y respetuosas con el medio ambiente4. Para adaptar tales estrategias al control de la mosca oriental de la fruta, se necesitan métodos efectivos para la investigación genética funcional.
El sistema de endonucleasa CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) fue descubierto inicialmente en bacterias y arqueas y resultó ser un mecanismo adaptativo implicado en el reconocimiento y degradación del ADN intracelular extraño, como el introducido por bacteriófagos infectantes5. En el sistema CRISPR tipo II, la endonucleasa Cas9 es guiada por pequeños ARN asociados (crRNA y tracrRNA) para escindirel ADN 6,7,8 y se ha convertido en una de las herramientas más utilizadas para la edición de genes hasta la fecha9,10,11,12. Dado que el sistema CRISPR / Cas9 tiene varias ventajas, como la alta eficiencia del silenciamiento génico y el bajo costo, ya se ha aplicado para la edición de genes en varias especies de insectos, incluyendo Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 y Bombyx mori16. En B. dorsalis, los genes relacionados con el color del cuerpo, el dimorfismo del ala y la determinación del sexo han sido eliminados con éxito utilizando CRISPR / Cas917,18,19. Sin embargo, los procedimientos detallados para la aplicación de CRISPR/Cas9 en este insecto siguen siendo incompletos. Además, algunos pasos proporcionados por los investigadores para la edición de genes de B. dorsalis también son variados y necesitan estandarización. Por ejemplo, las formas de Cas9 fueron diferentes en las referencias publicadas17,18,19.
Este documento proporciona un método sistemático para la mutagénesis de B. dorsalis utilizando el sistema CRISPR / Cas9, incluido el diseño y la síntesis de ARN guía, la recolección de embriones, la inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes. Este protocolo servirá como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores que estén interesados en los estudios de genes funcionales en B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema CRISPR/Cas9 es la herramienta de edición de genes más utilizada y tiene varias aplicaciones, como la trepida 30, el mejoramiento de cultivos31 y los estudios básicos de funciones genéticas32. Este sistema ya se ha aplicado para la edición de genes en varias especies de insectos y ha servido como una herramienta eficaz para el estudio de genes funcionales en plagas. Los protocolos que presentamos aquí estandarizan el procedimiento de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (Subvención No. KQTD20180411143628272) y fondos especiales para la innovación de tecnología científica y el desarrollo industrial del Nuevo Distrito de Shenzhen Dapeng (Subvención No. PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
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