Summary
Este trabalho apresenta os protocolos passo-a-passo para a mutagênese CRISPR/Cas9 da mosca da fruta oriental Bactrocera dorsalis. Passos detalhados fornecidos por este protocolo padronizado servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para estudos de genes funcionais em B. dorsalis.
Abstract
A mosca da fruta oriental, Bactrocera dorsalis, é uma espécie de praga altamente invasiva e adaptativa que causa danos aos citros e a mais de 150 outras culturas frutíferas em todo o mundo. Como as moscas da fruta adultas têm grande capacidade de voo e as fêmeas colocam seus ovos sob as cascas das frutas, os inseticidas que exigem contato direto com a praga geralmente têm um desempenho ruim no campo. Com o desenvolvimento de ferramentas biológicas moleculares e tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, muitos cientistas estão tentando desenvolver estratégias de manejo de pragas ambientalmente amigáveis. Estes incluem RNAi ou pesticidas baseados em edição de genes que regulam ou silenciam genes (alvos moleculares), como genes olfativos envolvidos no comportamento de busca, em várias pragas de insetos. Para adaptar essas estratégias para o controle oriental da mosca da fruta, são necessários métodos eficazes para a pesquisa de genes funcionais. Genes com funções críticas na sobrevivência e reprodução de B. dorsalis servem como bons alvos moleculares para derrubada e/ou silenciamento de genes. O sistema CRISPR/Cas9 é uma técnica confiável usada para edição de genes, especialmente em insetos. Este trabalho apresenta um método sistemático para a mutagênese CRISPR/Cas9 de B. dorsalis, incluindo o desenho e síntese de RNAs guia, coleta de embriões, injeção de embriões, criação de insetos e triagem mutante. Esses protocolos servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para pesquisadores interessados em estudos de genes funcionais em B. dorsalis.
Introduction
A mosca da fruta oriental, Bactrocera dorsalis , é uma espécie de praga de insetos cosmopolita que causa danos a mais de 150 espécies de culturas frutíferas, incluindo goiaba, manga, Eugenia spp., cereja do Suriname, cítricos, nêspera e mamão1. Os danos causados apenas na província de Guangdong (China) são estimados em mais de 200 milhões de yuans. As fêmeas adultas inserem seus ovos sob a pele dos frutos amadurecidos ou amadurecidos, causando decomposição e abscisão do fruto, o que diminui a qualidade dos frutos e o rendimento geral da cultura2. Como as moscas da fruta adultas têm grande capacidade de voo e suas larvas penetram na casca da fruta, os inseticidas que exigem contato direto com a praga têm um desempenho ruim no campo. Além disso, o uso extensivo de inseticidas aumentou a resistência de B. dorsalis contra diversos produtos químicos agrícolas, dificultando ainda mais o controle dessas pragas danosas3. Portanto, o desenvolvimento de estratégias eficazes e ambientalmente amigáveis de manejo de pragas é desesperadamente necessário.
Recentemente, com o desenvolvimento de ferramentas biológicas moleculares e tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, os cientistas estão tentando desenvolver estratégias de manejo de pragas ambientalmente amigáveis, como o RNAi, que visam a funcionalidade de genes importantes (alvos moleculares) de várias pragas de insetos. Genes que são críticos para a sobrevivência e reprodução da praga podem ser identificados por meio de estudos genéticos funcionais e ainda servem como potenciais alvos moleculares para a melhoria de ferramentas de manejo de pragas especificamente direcionadas e ambientalmente amigáveis4. Para adaptar tais estratégias ao controle oriental da mosca da fruta, são necessários métodos eficazes para a pesquisa de genes funcionais.
O sistema de endonuclease CRISPR/Cas (agrupado regularmente interespaçado repetições palindrômicas curtas/CRISPR-associado) foi inicialmente descoberto em bactérias e arqueias e encontrado para ser um mecanismo adaptativo envolvido no reconhecimento e degradação de DNA intracelular estranho, como o introduzido pela infecção de bacteriófagos5. No sistema CRISPR tipo II, a endonuclease Cas9 é guiada por pequenos RNAs associados (crRNA e tracrRNA) para clivar o DNA invasor 6,7,8 e tornou-se uma das ferramentas mais utilizadas para edição de genes até o momento 9,10,11,12. Como o sistema CRISPR/Cas9 apresenta diversas vantagens, como alta eficiência de silenciamento de genes e baixo custo, já foi aplicado para edição gênica em diversas espécies de insetos, incluindo Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 e Bombyx mori16. Em B. dorsalis, genes relacionados à cor corporal, dimorfismo das asas e determinação do sexo foram nocauteados com sucesso usando CRISPR/Cas917,18,19. No entanto, os procedimentos detalhados para a aplicação de CRISPR/Cas9 neste inseto permanecem incompletos. Além disso, algumas etapas fornecidas pelos pesquisadores para a edição do gene B. dorsalis também são variadas e precisam de padronização. Por exemplo, as formas de Cas9 foram diferentes nas referências publicadas17,18,19.
Este artigo fornece um método sistemático para mutagênese de B. dorsalis usando o sistema CRISPR/Cas9, incluindo o desenho e síntese de RNAs guia, coleta de embriões, injeção de embriões, criação de insetos e triagem mutante. Este protocolo servirá como um guia útil para a geração de moscas mutantes para pesquisadores interessados nos estudos de genes funcionais em B. dorsalis.
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Protocol
1. Concepção do alvo e síntese in vitro do sgRNA
- Prever a estrutura dos genes-alvo de interesse e determinar os limites entre éxons e íntrons através da análise bioinformática do genoma de B. dorsalis (as aplicações de software usadas aqui estão listadas na Tabela de Materiais).
NOTA: O BLAT20 foi usado para pesquisar potenciais loci genéticos no genoma. As leituras de RNA-seq de alta qualidade (transcriptoma) foram alinhadas aos loci genéticos adquiridos usando Hisat221. O Samtools22 foi usado para gerar os arquivos bam classificados. Os arquivos bam classificados foram inseridos no Stringtie223 para fornecer as transcrições de montagem. Os transcritos de montagem e as informações dos loci gênicos foram combinados pelo Transdecodificador24. Os resultados obtidos com o Transdecoder foram visualizados em ferramentas IGV25 e os limites entre éxons e íntrons puderam ser determinados. - Identifique as regiões-alvo adequadas dentro do local do gene alvo candidato. O comprimento total deve ser inferior a 750 pb para um sequenciamento mais conveniente (Figura 1B). Projetar primers específicos para amplificar a área-alvo a partir do DNA genômico do tipo selvagem por PCR (Figura 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Clone os produtos de PCR em um vetor final contundente26 e selecione 20 colônias bacterianas individuais para sequenciamento para determinar o quão conservada a região-alvo está nas populações de insetos de laboratório.
- Um local alvo típico contém um motivo de sequência de três nucleotídeos (NGG ou CCN) e uma sequência de 20 pb adjacente aos motivos NGG ou CCN (20 bp-NGG ou CCN-20 pb). Exploda os locais-alvo candidatos contra o genoma de B. dorsalis e certifique-se de que a eficiência prevista é alta o suficiente e a taxa de desdirecionamento é baixa; vários programas de software de código aberto podem prever isso automaticamente. Neste protocolo, o sgRNAcas9 -AI27 é usado para selecionar e avaliar os alvos ideais. Detalhes de uso podem ser encontrados no manual para este software.
NOTA: Possíveis locais-alvo fechados para a UTR de 5' do gene alvo e 1-2 Gs no início da sequência de 20 pb são favorecidos. A fim de alcançar uma grande deleção que será identificada por PCR seguida de eletroforese em gel de agarose, recomenda-se o desenho de dois alvos28 separados por mais de 100 pb (Figura 1C). - Use o kit de síntese de gRNA comercialmente disponível para gerar o sgRNA projetado. Execute cada etapa seguindo o guia do usuário. Ressuspeite o produto de gRNA em água livre de nuclease, quantifique a concentração usando um espectrofotômetro UV-Vis e armazene a -80 °C antes do uso (a concentração de gRNA único sintetizado com sucesso [10 μL] com o kit usado aqui é de cerca de 4000-6000 ng / μL, ou até superior).
NOTA: Embora a geração das moscas mutantes seja o primeiro passo para todos os pesquisadores, o controle negativo apropriado para experimentos/análises a jusante é fundamental. Gerar esses controles ao lado dos mutantes economiza tempo e esforço dos pesquisadores. Por exemplo, defina o sgRNA embaralhado como um controle negativo.
2. Colheita e preparação de embriões
- Coloque as pupas de B. dorsalis em gaiolas de plástico. Fornecer uma mistura de açúcar e levedura (1:1) como alimento, juntamente com uma fonte de água após o fechamento dos adultos (Figura 2A, B). As condições de criação são 55% de umidade relativa (UR), 26,5 °C e um ciclo de 14:10 L / D (luzes acesas às seis da manhã, luzes apagadas às oito da noite).
- A maioria dos adultos atinge a maturidade sexual 10 dias após a emergência. Forneça um ambiente adequado para ajudar as moscas adultas a acasalar, tanto quanto possível. Idealmente, use um suporte de luz com uma luz de 30-50 lux. Isso pode melhorar a fecundidade das fêmeas, portanto, melhorando a eficiência da coleta de embriões.
NOTA: Colocar os adultos (com idade entre 5-6 dias após a emergência) em um ambiente mal iluminado (<100 lux) pode promover o acasalamento. Geralmente, o pico de oviposição acontece às 15h00 (14h10/L:D, luzes acesas às 06h00, luzes apagadas às 20h00); para obter embriões suficientes, recomenda-se a colocação de câmaras de oviposição nas gaiolas 30 min antes das 15:00. - Coloque uma gaze de 200 malhas na câmara de oviposição, a 1-2 mm de distância da tampa da câmara. Isso ajudará na obtenção do maior número possível de embriões.
NOTA: Evite deixar os embriões ficarem embebidos em suco de laranja ou esfregados com gaze, pois isso pode diminuir significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões. - Coloque uma nova câmara de oviposição na gaiola quando a configuração de microinjeção estiver pronta. Colete os embriões a cada 10 minutos usando uma escova fina e úmida e, em seguida, alinhe-os em uma placa de injeção feita por conta própria (plexiglass com um comprimento de 55 mm, uma largura de 13,75 mm e uma altura de 5 mm, A 45 mm x 5 mm x 0,3 mm sulco raso é aberto no meio para facilitar a colocação do ovo). Se os embriões tiverem alta pressão interna, uma leve dessecação a <10% UR por 10 min é opcional. Mergulhe os embriões em óleo de halocarbono durante a injeção para evitar mais dessecação (Figura 2C).
3. Microinjeção do embrião
- Prepare a agulha de injeção de vidro usando um puxador de micropipeta.
Observação : definir os parâmetros seguindo o guia do usuário é importante. Nesses protocolos, diferentes formas de agulhas podem ser feitas usando os parâmetros sugeridos pelo manual do puxador de micropipeta. O capilar de vidro deve estar o mais limpo possível para evitar que o pó obstrua a agulha. - Prepare a solução de trabalho. Misturar a proteína Cas9 e o sgRNA correspondente às seguintes concentrações de trabalho: sgRNA, 300 ng/μL; Proteína Cas9, 150 ng/μL. Adicione 1 μL de vermelho de fenol à mistura para servir como uma maneira conveniente de marcar embriões injetados. Coloque a mistura preparada no gelo para evitar a degradação do sgRNA.
NOTA: Use pontas de pipeta sem nuclease e tubos de PCR. A concentração da proteína Cas9 precisa ser menor ou igual a 150 ng/μL; concentrações mais altas são tóxicas e diminuem significativamente a taxa de sobrevivência embrionária. A Cas9 também poderia ser entregue no formato de DNA ou mRNA para alcançar uma edição de genes bem-sucedida17,19. Neste protocolo, a proteína Cas9 é recomendada, uma vez que os mRNAs são suscetíveis à degradação, e a expressão da proteína Cas9 a partir do DNA plasmídico leva tempo para transcrição e tradução. - Defina os parâmetros para o injetor. O programa inicial é Pi-500 hPa, Ti-0.5 s e PC-200 hPa. Ajuste estes parâmetros ainda mais, conforme necessário, durante a microinjeção.
- Adicionar 3 μL da mistura à agulha de injecção. Evite introduzir bolhas de ar que possam entupir a agulha. Abra a agulha usando um Microgrinder.
- Conecte a agulha ao micromanipulador de acordo com o guia do usuário (Figura 2E).
- Coloque o prato com embriões alinhados na mesa objetiva. Ajuste a posição da micropipeta sob um microscópio óptico fino, colocando a micropipeta e o embrião no mesmo plano. Ajuste o volume da gota pressionando o pedal; 1/10 o volume de embriões é recomendado.
- Insira a ponta da agulha no posterior (polo vegetal) do embrião. Entregue as misturas no embrião pressionando o pedal do injetor. Se o vermelho fenólico for adicionado, uma cor ligeiramente avermelhada é observada instantaneamente.
NOTA: Um pequeno volume de refluxo citoplasmático do orifício não diminuirá a taxa de sobrevivência do embrião. A injeção de 200 embriões é suficiente para a mutagênese bem-sucedida de um gene. Adicionar mais óleo de halocarbono para imergir os embriões pode evitar mais dessecação. A injeção precisa ser realizada antes da formação de células polares, o que garante que cada mutação possa ser herdada de forma eficiente.
4. Criação de insetos pós-injeção
- Coloque a placa de injeção com os embriões injetados em uma câmara climática artificial mantida a 55% UR, 26,5 °C e um ciclo de 14:10 L / D (luzes acesas às seis da manhã, luzes apagadas às oito da noite).
- Após a injeção, a formação do embrião geralmente leva 24 h para completar e 36 h para eclodir. Use uma escova de ponta fina para transferir as larvas para uma dieta larval preparada. Colete larvas três ou quatro vezes ao dia até que não haja mais larvas eclodindo. Geralmente, as larvas levam 2-3 dias para terminar a eclosão e pupato dentro de 7 dias.
NOTA: Uma dieta à base de milho foi usada para alimentar as larvas. A receita contém 150 g de farinha de milho, 150 g de banana, 0,6 g de benzoato de sódio, 30 g de levedura, 30 g de sacarose, 30 g de papel toalha, 1,2 mL de ácido clorídrico e 300 mL de água29. Minimizar o tempo que as larvas são deixadas no óleo (<2 h). Mova as larvas para a dieta imediatamente após a eclosão, tanto quanto possível. Isso pode aumentar significativamente as taxas de sobrevivência e pupação. Não forneça muita dieta (uma dieta com 2/3 de uma placa de Petri de 90 mm é suficiente para 30 larvas); caso contrário, ficará mofado, diminuirá a taxa de sobrevivência larval. - Coloque as larvas maduras na areia molhada para pupate. O estágio de pupação leva cerca de 10 dias. Mova as pupas para gaiolas de plástico antes do início da eclosão.
5. Rastreio mutante
- Um fluxograma da triagem mutante é ilustrado na Figura 3A. Adultos Cross G0 obtidos por microinjeção com adultos do tipo selvagem para obtenção de linhagens heterozigotas. Verifique o tipo de mutações que a prole (G1) carrega por genotipagem.
- Autocruzar G1 com o mesmo genótipo mutante para obtenção de linhagens homozigotas no G2. Se os genótipos dos mutantes no G1 forem totalmente diferentes, cruze os heterozigotos com moscas selvagens. Linhagens homozigotas são geralmente obtidas no G3. Mantenha duas ou três linhas homozigotas para experimentos subsequentes de fenotipagem.
- Use o DNA genômico de um pupário fresco ou de uma única perna média de adultos individuais para realizar a genotipagem. Projetar primers específicos para amplificar a área alvo; os primers devem fixar pelo menos 50 bps a montante e a jusante do local de destino. Consulte a etapa 1.2 para obter os detalhes da cartilha.
NOTA: Como a quantidade de DNA em um pupário é extremamente baixa, kits de extração de DNA comercialmente disponíveis são recomendados. - Efectuar a PCR utilizando as seguintes condições de ciclo: 98 °C durante 3 min, seguidos de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 15 s a uma temperatura de recozimento adequada para os primers projectados, 72 °C durante 35 s, seguida de uma extensão final de 72 °C durante 10 min.
- Sequenciar os produtos de PCR purificados. Quando vários picos sobrepostos adjacentes ao local de destino são detectados (Figura 3B), ocorreu mutagênese bem-sucedida. Subclone os produtos de PCR purificados em um vetor de extremidade contundente e selecione 10 colônias bacterianas individuais para sequenciamento para verificar o genótipo dos mutantes. Manter as linhas com mutações de deslocamento de quadro e terminações prematuras de tradução (Figura 3C).
NOTA: Não há necessidade de realizar o sequenciamento de clone único para verificar o genótipo dos indivíduos G0. Basta sequenciar os produtos de PCR e manter os indivíduos com múltiplos picos de sobreposição óbvios adjacentes ao local de destino. Após a injeção inicial, recomenda-se selecionar 10 embriões para extrair DNA genômico e sequenciar os produtos de PCR com base nos padrões da etapa 5.3. Isso pode ajudar a prever as taxas de mutação com antecedência. Neste estudo, o sequenciamento de sanger para determinar o genótipo foi feito por uma empresa de sequenciamento.
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Representative Results
Este protocolo apresenta etapas detalhadas para o desenvolvimento de mutantes de B. dorsalis usando a tecnologia CRISPR/Cas9, incluindo resultados representativos da seleção de gDNA, coleta de embriões e microinjeção, manutenção de insetos e triagem de mutantes.
O exemplo do sítio alvo do gene selecionado está localizado no terceiro éxon (Figura 1C). Este sítio é altamente conservado, e uma única banda foi detectada por eletroforese em gel para o molde de DNA para gRNA sintético (Figura 1D) e gRNA obtido por transcrição in vitro (Figura 1E).
A injeção em 200 ovos recém-colhidos foi realizada conforme descrito na secção 3. Os embriões foram mantidos seguindo os protocolos descritos nas etapas 4.1-4.3. Conforme detectado pelo sequenciamento dos produtos da PCR, 80% dos indivíduos do G0 são mutantes em mosaico (Tabela 1). Aqui, foram selecionados mutantes com deleção de 8 pb que resultaram no término prematuro da tradução de aminoácidos no G1 (Figura 3C). Isso deve levar a alterações nas funções correspondentes deste produto genético em B. dorsalis. Os G1 selecionados foram cruzados com o tipo selvagem para obtenção de heterozigotos G2. O autocruzamento dos heterozigotos e homozigotos G2 foi recuperado na geração seguinte, demonstrando que este esquema é bem sucedido para o desenvolvimento de mutantes B. dorsalis e poderia ser mais amplamente aplicado em estudos de genes funcionais nesta e em espécies intimamente relacionadas.
Figura 1: Preparação do sgRNA. (A) Procedimentos gerais para o preparo do sgRNA. (B) Área-alvo amplificada por PCR a partir de gDNA (100 pb). (C) Exemplo de estrutura do gene alvo e local de clivagem alvo por Cas9. (D) Montagem de PCR do sgRNA (~100 pb). (E) Síntese de sgRNA por transcrição e purificação in vitro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Microinjeção embrionária . (A) O processo e o método de injeção. B) Dispositivo de colheita de embriões, postura de ovos em gaze. (C) Alinhe embriões com água e cubra com óleo de halocarbono. (D) Puxador de micropipeta. (E) Toda a configuração do sistema de microinjeção. Microscópio (esquerda), microinjetor e micromanipulador (meio) e bomba de ar automática (direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Triagem de mutantes . (A) Acasalamento de mutantes e aquisição de homozigotos. (B) Produtos de PCR do genoma mutante que geram um conjunto distinto de picos no alvo. (C) Um dos tipos de mutação e alterações de aminoácidos. Mutações de deleção levam ao término prematuro da tradução. Abreviaturas: HE = heterozigotos, HO = homozigotos. Controle: embrião injetado com sgRNAs mexidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mistura de injeção | Embriões injetados | Larvas eclodidas | Pupas | Mosaico G0 | ||
| (Mosaico/Total de adultos) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Vermelho de fenol (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Vermelho de fenol (1 μL) | ||||||
Tabela 1: Sobrevida e mutagênese de B. dorsalis após microinjeções.
| Problema | Causa(s) potencial(is) | Soluções | |
| Coleta ineficiente de embriões | 1. Os adultos estão em más condições | 1.Garantir a disponibilidade de alimentos e água, especialmente o teor de açúcar do alimento. | |
| 2. Acasalamento insuficiente | 2. Acasalamento antecipado sob 30-50 Lux condições de escurecimento. É melhor selecionar adultos acasalados de 12 a 15 dias de idade. | ||
| Baixa eclodibilidade dos ovos após a injeção | 1. Embriões de má qualidade | 1. Escolha ovos frescos e rechonchudos e escove-os suavemente com uma escova embebida em água. | |
| 2. A agulha não cabe | 2. A ponta da agulha é a menor possível para minimizar os danos ao ovo durante a injeção. | ||
| 3. Criação inadequada de ovos após a injeção | 3. Os ovos precisam ser mantidos hidratados após a injeção para evitar que a desidratação seque. Os ovos também podem ser transferidos diretamente para os alimentos após a injeção. | ||
| Baixa taxa de sobrevivência larval | 1. O alimento mofado não é adequado para o crescimento de larvas | 1. Para larvas recém-eclodidas, adicione uma pequena quantidade de alimento. Muita comida irá moldar ou secar e afetar o crescimento das larvas. | |
| 2. Larvas recém-eclodidas embebidas em óleo por um longo tempo | 2.As larvas recém-eclodidas têm de ser transferidas para o alimento larval a tempo ou os ovos devem ser colhidos diretamente no alimento após a injeção. | ||
| A taxa de mutação em adultos é baixa | 1. Baixa qualidade do gRNA | 1. Operação experimental rigorosa para sintetizar gRNA de alta qualidade para evitar a degradação. | |
| 2. Metas ineficientes levam a metas fora das metas | 2. Triagem de metas de alta eficiência através, como nossa discussão mencionou. | ||
Tabela 2: Possíveis problemas com a construção de mutantes, causas potenciais e soluções.
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Discussion
O sistema CRISPR/Cas9 é a ferramenta de edição de genes mais utilizada e tem várias aplicações, como o genetrepia 30, o melhoramento de culturas31 e estudos básicos de funções gênicas32. Este sistema já foi aplicado para edição de genes em várias espécies de insetos e tem servido como uma ferramenta eficaz para estudos de genes funcionais em pragas. Os protocolos que apresentamos aqui padronizam o procedimento de desenho e síntese de RNAs guia, coleta de embriões, injeção de embriões, criação de insetos e triagem mutante. Além disso, uma tabela de solução de problemas foi adicionada para resumir o problema potencial de cada etapa, e suas soluções foram fornecidas para aliviar a carga de trabalho e melhorar a eficiência (Tabela 2). Este procedimento fornece uma maneira confiável de editar genes de interesse e melhora os estudos genômicos funcionais em B. dorsalis.
Primeiro, a seleção de genes-alvo é fundamental para aumentar a eficiência do sistema CRISPR/Cas9, e vários programas de software de código aberto, como ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 e CRISPR optimal target finder 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu), podem gerar automaticamente alvos e prever potenciais taxas fora do alvo. Uma vez que a alta taxa de fecundidade de B. dorsalis facilita a coleta de embriões, as taxas de mutação podem ser previstas sacrificando uma parte dos embriões para extração de DNA e sequenciamento da região-alvo. Se o sequenciamento não estiver disponível em laboratório, o uso da endonuclease I T7 para prever as taxas de mutação também é recomendado37. Locais-alvo com altas taxas de deleção genômica podem ser selecionados por meio desses três métodos e, portanto, a eficiência da edição de genes em B. dorsalis pode ser aumentada.
O estágio de desenvolvimento do embrião determina se as mutações serão herdadas. Para obter mutações hereditárias, a edição de genes deve ocorrer em células germinativas. Geralmente, a mistura de sgRNA e Cas9 não pode ser entregue em células germinativas após a formação de células polares ter ocorrido. Em B. dorsalis, a formação de células polares ocorreu às 3 h após a postura dos ovos 38, enquanto o protocolo detalhado aqui para B. dorsalis leva30 min desde a coleta do embrião até o final da microinjeção. Durante a injeção, quase nenhuma célula polar é formada na extremidade vegetal do embrião; portanto, as mutações genéticas obtidas no G0 devem ser herdadas de forma eficiente. O tempo consumido pela microinjeção também é menor do que o método mencionado em trabalhos publicados anteriormente (geralmente 1-3 h)18,19.
É importante minimizar os danos mecânicos ou químicos durante o processo de coleta e manuseio do embrião. Use uma escova fina para alinhar suavemente os embriões na placa de injeção. A posição da injeção deve refletir o trabalho realizado anteriormente em Drosophila (Métodos - laboratório de Nicolas Gompel, http://gompel.org/methods) e Ceratitis capitata39. Injetar embriões no polo vegetal; nunca insira a agulha no poste do animal. Prepare a agulha seguindo o guia do extrator de micropipeta; a abertura da agulha deve ser a menor possível para evitar o refluxo citoplasmático excessivo. O método mencionado em estudos publicados em B. dorsalis geralmente decorionou os embriões com hipocorita sódica17,18,19; isso poderia causar danos químicos e diminuir as taxas de sobrevivência dos embriões. Neste protocolo, os embriões não são decorionados, e a injeção ainda funciona bem. O dano químico aos embriões pode ser mínimo.
A criação de insetos pós-injeção é muito importante. O protocolo padronizado de criação aqui fornecido pode servir de referência para a criação de outras espécies de moscas da fruta, especialmente espécies de Bactrocera . Os embriões podem ser imersos em óleo para evitar a dessecação durante a injeção usando nossa placa de injeção de fabricação própria. Minimizar o tempo que a larva passa no óleo (<2 h) para alcançar taxas de sobrevivência no G0 acima de 50%.
Um método não invasivo de extração de DNA genômico é recomendado para detecção de mutantes. Por exemplo, alguns pesquisadores de lepidópteros sugerem que os exúvios das larvas do ínstar final poderiam ser usados para extrair DNA genômico para genotipagem adicional. Para B. dorsalis, um método não invasivo envolve a extração de DNA genômico de um puparo fresco. A injeção de múltiplos sgRNAs visando um gene marcador e o gene de interesse também poderia melhorar a identificação de mutantes. Por exemplo, sgRNAs co-injetados visando a cor dos olhos (kmo) e o receptor hormonal juvenil (Met) podem produzir 75% da prole com mutações duplas em mosquitos. Os mutantes Met foram rastreados preliminarmente com base na cor dos olhos das larvas37. Isso deve ser avaliado em B. dorsalis no futuro para melhorar ainda mais a eficácia da edição de genes nesta espécie de inseto usando o sistema CRISPR/Cas9.
Em conclusão, o sistema CRSIPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa em genômica funcional em B. dorsalis. Nossos protocolos detalhados fornecem informações úteis para ajudar os pesquisadores a alcançar uma coleta eficiente de embriões, taxas ideais de sobrevivência de larvas e a eficiência de edição desejada. Esta poderia ser uma maneira simples e rápida de ajudar os pesquisadores a obter mutagênese em B. dorsalis. Esta técnica não pôde ser aplicada nos estudos funcionais de genes letais, uma vez que as mutações hereditárias necessitam de cruzamentos bem-sucedidos. Estudos futuros poderiam se concentrar no desenvolvimento de ferramentas transgênicas para expressar elementos CRISPR específicos do estágio ou do tecido para romper essa limitação.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (Grant No. KQTD20180411143628272) e fundos especiais para inovação em tecnologia científica e desenvolvimento industrial do Novo Distrito de Shenzhen Dapeng (Grant No. PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H.
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J.
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al.
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
