Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פרוטוקולים עבור CRISPR/Cas9 Mutagenesis של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 2
1Key Laboratory of Sustainable Forest Ecosystem Management - Ministry of Education, Northeast Forestry University, 2Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Genome Analysis Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Summary

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים שלב אחר שלב עבור מוטגנזה של CRISPR/Cas9 של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis. צעדים מפורטים המסופקים על ידי פרוטוקול סטנדרטי זה ישמשו כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטים למחקרי גנים פונקציונליים ב - B. dorsalis.

Abstract

זבוב הפירות האוריינטלי, Bactrocera dorsalis, הוא מין מזיק פולש ומסתגל מאוד שגורם נזק להדרים וליותר מ-150 גידולי פרי אחרים ברחבי העולם. מכיוון שלזבובי פירות בוגרים יש יכולת מעוף גדולה והנקבות מטילות את ביציהן מתחת לקליפות הפרי, קוטלי חרקים הדורשים מגע ישיר עם המזיק בדרך כלל מתפקדים בצורה גרועה בשדה. עם פיתוח כלים ביולוגיים מולקולריים וטכנולוגיית ריצוף בתפוקה גבוהה, מדענים רבים מנסים לפתח אסטרטגיות הדברה ידידותיות לסביבה. אלה כוללים חומרי הדברה מבוססי RNAi או עריכת גנים אשר ממעיטים או משתיקים גנים (מטרות מולקולריות), כגון גנים של חוש הריח המעורבים בהתנהגות חיפוש, במזיקים שונים של חרקים. כדי להתאים אסטרטגיות אלה להדברת זבוב הפירות המזרחי, יש צורך בשיטות יעילות לחקר גנים פונקציונליים. גנים בעלי תפקידים קריטיים בהישרדות וברבייה של B. dorsalis משמשים כמטרות מולקולריות טובות להפלת גנים ו/או להשתקה. מערכת CRISPR/Cas9 היא טכניקה אמינה המשמשת לעריכת גנים, במיוחד בחרקים. מאמר זה מציג שיטה שיטתית למוטגנזה של קריספר/Cas9 של B. dorsalis, כולל תכנון וסינתזה של רנ"א מנחה, איסוף עוברים, הזרקת עוברים, גידול חרקים וסינון מוטנטי. פרוטוקולים אלה ישמשו כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטיים עבור חוקרים המעוניינים במחקרי גנים פונקציונליים ב- B. dorsalis.

Introduction

זבוב הפירות המזרחי (שם מדעי: Bactrocera dorsalis) הוא מין של חרק קוסמופוליטי הגורם נזק ליותר מ-150 מינים של גידולי פירות, בהם גויאבה, מנגו, יוג'ניה spp., דובדבן סורינאם, הדרים, שסק ופפאיה1. הנזק שנגרם במחוז גואנגדונג (סין) לבדו מוערך ביותר מ-200 מיליון יואן. נקבות בוגרות מכניסות את ביציהן מתחת לקליפת הפירות המבשילים או הבשילים, מה שגורם לריקבון ולפגיעה בפרי, מה שפוגע באיכות הפרי ובתנובה הכללית של היבול2. מכיוון שלזבובי פירות בוגרים יש יכולת מעוף גדולה והזחלים שלהם נשאו לתוך קליפת הפרי, קוטלי חרקים הדורשים מגע ישיר עם המזיק מתפקדים בצורה גרועה בשדה. בנוסף, השימוש הנרחב בקוטלי חרקים הגביר את עמידותו של B. dorsalis נגד כימיקלים חקלאיים שונים, מה שהופך את ההדברה של מזיקים מזיקים אלה לקשה עוד יותר3. לכן, פיתוח אסטרטגיות הדברה יעילות וידידותיות לסביבה נחוץ נואשות.

לאחרונה, עם פיתוח כלים ביולוגיים מולקולריים וטכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה, מדענים מנסים לפתח אסטרטגיות ידידותיות לסביבה להדברת מזיקים, כגון RNAi, המכוונות לפונקציונליות של גנים חשובים (מטרות מולקולריות) של מזיקים חרקים שונים. גנים שהם קריטיים להישרדותו ולהתרבותו של המזיק ניתנים לזיהוי באמצעות מחקרי גנים פונקציונליים ומשמשים גם כמטרות מולקולריות פוטנציאליות לשיפור כלי הדברה ממוקדים וידידותיים לסביבה4. כדי להתאים אסטרטגיות כאלה להדברת זבוב הפירות המזרחי, יש צורך בשיטות יעילות לחקר גנים פונקציונליים.

מערכת האנדונוקלאז CRISPR/Cas (מקובצת באופן קבוע בין חזרות פלינדרומיות קצרות/הקשורות לקריספר) התגלתה לראשונה בחיידקים ובארכיאה ונמצאה כמנגנון אדפטיבי המעורב בזיהוי ופירוק של דנ"א תוך-תאי זר, כמו זה שהוצג על ידי הדבקת בקטריופאג'ים5. במערכת הקריספר מסוג II, אנדונוקלאז Cas9 מונחה על ידי רנ"א קטנים הקשורים (crRNA ו- tracrRNA) כדי לבקע DNA מסיג גבול 6,7,8 והפך לאחד הכלים הנפוצים ביותר לעריכת גנים עד כה 9,10,11,12. מכיוון שלמערכת CRISPR/Cas9 יש מספר יתרונות, כגון יעילות גבוהה של השתקת גנים ועלות נמוכה, היא כבר יושמה לעריכת גנים במיני חרקים שונים, כולל Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 ו- Bombyx mori16. ב- B. dorsalis, גנים הקשורים לצבע הגוף, דימורפיזם כנפיים וקביעת מין הושמדו בהצלחה באמצעות CRISPR/Cas917,18,19. עם זאת, נהלים מפורטים ליישום CRISPR/Cas9 בחרק זה עדיין אינם שלמים. יתר על כן, כמה צעדים שסופקו על ידי חוקרים לעריכת גנים של B. dorsalis הם גם מגוונים וזקוקים לתקינה. לדוגמה, הצורות של Cas9 היו שונות בהפניות שפורסמו17,18,19.

מאמר זה מספק שיטה שיטתית למוטגנזה של B. dorsalis באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, כולל תכנון וסינתזה של רנ"א מנחים, איסוף עוברים, הזרקת עוברים, גידול חרקים וסינון מוטנטי. פרוטוקול זה ישמש כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטיים עבור חוקרים המעוניינים במחקרי הגנים הפונקציונליים ב- B. dorsalis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכנון מטרה וסינתזה חוץ גופית של sgRNA

  1. לחזות את המבנה של גני מטרה מעניינים ולקבוע את הגבולות בין אקסונים לאינטרונים באמצעות ניתוח ביואינפורמטי של הגנום של B. dorsalis (יישומי תוכנה המשמשים כאן מפורטים בטבלת החומרים).
    הערה: BLAT20 שימש לחיפוש מוקדי גנים פוטנציאליים בגנום. קריאות ה-RNA-seq האיכותיות (תעתיק) הותאמו למוקדי הגן הנרכשים באמצעות Hisat221. Samtools22 שימש ליצירת קבצי bam ממוינים. קבצי הבם הממוינים הוזנו ל- Stringtie223 כדי לספק את תמלילי ההרכבה. תעתיקי ההרכבה והמידע על מוקדי הגנים שולבו על ידי Transdecoder24. התוצאות שנרכשו מ- Transdecoder הודגמו בכלי IGV25 וניתן היה לקבוע את הגבולות בין אקסונים לאינטרונים.
  2. זהה את אזורי היעד המתאימים בתוך אתר גן היעד המועמד. האורך הכולל חייב להיות פחות מ-750 bp כדי ליצור רצף נוח יותר (איור 1B). תכנן פריימרים ספציפיים כדי להגביר את אזור המטרה מדנ"א גנומי מסוג בר על-ידי PCR (איור 1B) (פריימרים: פריימר F: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). שכפלו את תוצרי ה-PCR לווקטור קצהקהה 26 ובחרו 20 מושבות חיידקים בודדות לריצוף כדי לקבוע עד כמה אזור המטרה נשמר באוכלוסיות חרקי המעבדה.
  3. אתר יעד טיפוסי מכיל מוטיב רצף של שלושה נוקלאוטידים (NGG או CCN) ורצף של 20 bp הסמוך למוטיבים NGG או CCN (20 bp-NGG או CCN-20 bp). לפוצץ את אתרי היעד המועמדים כנגד הגנום של B. dorsalis ולוודא שהיעילות החזויה גבוהה מספיק ושיעור ה-off-targeting נמוך; מספר תוכנות קוד פתוח יכולות לחזות זאת באופן אוטומטי. בפרוטוקול זה, sgRNAcas9 -AI27 משמש לבחירה והערכה של המטרות האופטימליות. פרטי השימוש ניתן למצוא במדריך עבור תוכנה זו.
    הערה: אתרי מטרה אפשריים הסגורים ל-5' UTR של גן המטרה ו-1-2 Gs בתחילת רצף 20 bp מועדפים. על מנת להשיג מחיקה גדולה שתזוהה על ידי PCR ואחריה אלקטרופורזה בג'ל אגרוז, מומלץ לתכנן שתי מטרות28 המופרדות ביותר מ-100 bp (איור 1C).
  4. השתמש בערכת הסינתזה של gRNA הזמינה מסחרית כדי ליצור את ה- sgRNA המתוכנן. בצע כל שלב בהתאם למדריך למשתמש. יש לתלות את מוצר ה-gRNA במים נטולי נוקלאזה, לכמת את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis, ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש (הריכוז של gRNA יחיד מסונתז בהצלחה [10 μL] עם הערכה המשמשת כאן הוא בערך 4000-6000 ng/μL, או אפילו גבוה יותר).
    הערה: למרות שיצירת הזבובים המוטנטים היא הצעד הראשון עבור כל חוקר, הבקרה השלילית המתאימה לניסוי/ניתוח במורד הזרם היא קריטית. יצירת בקרות אלה לצד המוטנטים חוסכת לחוקרים זמן ומאמץ. לדוגמה, להגדיר sgRNA מקושקש כבקרה שלילית.

2. איסוף והכנת עוברים

  1. הכניסו את הגלמים של B. dorsalis לכלובים מפלסטיק. ספקו תערובת של סוכר ושמרים (ביחס של 1:1) כמזון יחד עם מקור מים לאחר שהמבוגרים יתכנסו (איור 2A, B). תנאי הגידול הם 55% לחות יחסית (RH), 26.5 מעלות צלזיוס, ומחזור של 14:10 L/D (אורות דולקים בשש בבוקר, אורות כבויים בשמונה בערב).
  2. רוב המבוגרים מגיעים לבגרות מינית 10 ימים לאחר הופעתם. ספק סביבה מתאימה כדי לעזור לזבובים בוגרים להזדווג ככל האפשר. באופן אידיאלי, השתמש במעמד תאורה עם תאורה של 30-50 לוקס. זה יכול לשפר את fecundity של נקבות, ולכן, לשפר את היעילות של איסוף העוברים.
    הערה: הצבת הבוגרים (בגילאי 5-6 ימים לאחר הופעתם) בסביבה מוארת באפלולית (<100 לוקס) יכולה לקדם הזדווגות. באופן כללי, שיא ההשבעה מתרחש בשעה 15:00 (14:10/L:D, אורות ב-06:00, אורות כבויים ב-20:00); כדי להשיג מספיק עוברים, מומלץ למקם תאי אובפוזיציה בכלובים 30 דקות לפני השעה 15:00.
  3. הניחו גזה בעלת רשת של 200 מ"מ בתא ההנעה, במרחק של 1-2 מ"מ ממכסה התא. זה יעזור עם השגת עוברים רבים ככל האפשר.
    הערה: הימנעו מלתת לעוברים להיספג במיץ תפוזים או לשפשף אותם בגזה, שכן הדבר עלול להפחית משמעותית את שיעור ההישרדות של העוברים.
  4. הכניסו תא אובפוזיציה חדש לכלוב כאשר מערך המיקרו-הזרקה מוכן. אוספים את העוברים כל 10 דקות באמצעות מברשת רטובה עדינה, ואז מיישרים אותם על צלחת הזרקה מתוצרת עצמית (פרספקס באורך של 55 מ"מ, רוחב של 13.75 מ"מ, וגובה של 5 מ"מ, חריץ רדוד של 45 מ"מ x 5 מ"מ x 0.3 מ"מ נפתח באמצע כדי להקל על מיקום הביציות). אם לעוברים יש לחץ פנימי גבוה, ייבוש קל ב <10% לחות יחסית למשך 10 דקות הוא אופציונלי. טבלו את העוברים בשמן הלוקרבון במהלך ההזרקה כדי למנוע התייבשות נוספת (איור 2C).

3. מיקרו הזרקה של העובר

  1. הכן את מחט הזרקת הזכוכית באמצעות מושך מיקרופיפטה.
    הערה: חשוב להגדיר את הפרמטרים בהתאם למדריך למשתמש. בפרוטוקולים אלה ניתן ליצור צורות מחט שונות באמצעות הפרמטרים המוצעים על ידי המדריך של מושך המיקרופיפטה. נימי הזכוכית חייבים להיות נקיים ככל האפשר כדי למנוע מאבק לסתום את המחט.
  2. הכן את פתרון העבודה. מערבבים את החלבון Cas9 ואת ה-sgRNA המתאים לריכוזי העבודה הבאים: sgRNA, 300 ng/μL; חלבון Cas9, 150 ננוגרם/מיקרול. הוסיפו 1 μL של פנול אדום לתערובת כדי לשמש כדרך נוחה לסמן עוברים מוזרקים. מניחים את התערובת המוכנה על קרח כדי למנוע השפלה של sgRNA.
    הערה: יש להשתמש בקצות פיפטה נטולי נוקלאז ובצינורות PCR. הריכוז של חלבון Cas9 צריך להיות פחות או שווה ל-150 ng/μL; ריכוזים גבוהים יותר הם רעילים ומפחיתים משמעותית את שיעור הישרדות העוברים. Cas9 יכול גם להיות מועבר בפורמט DNA או mRNA כדי להשיג עריכה גנטיתמוצלחת 17,19. בפרוטוקול זה, חלבון Cas9 מומלץ מכיוון ש-mRNA רגישים לפירוק, והביטוי של חלבון Cas9 מדנ"א פלסמיד לוקח זמן לתעתוק ותרגום.
  3. הגדר את הפרמטרים עבור המזרק. התוכנית הראשונית היא Pi-500 hPa, Ti-0.5 s, ו- PC-200 hPa. התאם פרמטרים אלה עוד יותר לפי הצורך במהלך המיקרו הזרקה.
  4. מוסיפים 3 μL מהתערובת למחט ההזרקה. הימנעו מהחדרת בועות אוויר שעלולות לסתום את המחט. פתח את המחט באמצעות Microgrinder.
  5. חברו את המחט למיקרומניפולטור בהתאם למדריך למשתמש (איור 2E).
  6. שים את הצלחת עם עוברים בשורה על השולחן האובייקטיבי. התאם את מיקום המיקרופיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי עדין, תוך הצבת המיקרופיפטה והעובר באותו מישור. כוונן את עוצמת הקול של הטיפות על ידי לחיצה על הדוושה; 1/10 נפח העוברים מומלץ.
  7. הכנס את קצה המחט לתוך החלק האחורי (הקוטב הצמחי) של העובר. העבירו את התערובות לתוך העובר על ידי לחיצה על הדוושה מהמזרק. אם מוסיפים פנול אדום, צבע אדמדם מעט נצפה באופן מיידי.
    הערה: נפח קטן של זרימה אחורית ציטופלסמית מחור הסיכה לא יקטין את שיעור ההישרדות של העובר. הזרקה של 200 עוברים מספיקה למוטגנזה מוצלחת של גן אחד. הוספת שמן הלוקרבון לטבילת העוברים יכולה למנוע התייבשות נוספת. ההזרקה צריכה להתבצע לפני היווצרות תאי הקוטב, מה שמבטיח שכל מוטציה תוכל לעבור בתורשה ביעילות.

4. גידול חרקים לאחר הזרקה

  1. שים את צלחת ההזרקה עם העוברים המוזרקים לתוך תא אקלים מלאכותי נשמר על 55% RH, 26.5 מעלות צלזיוס, ומחזור 14:10 L / D (אורות דולקים בשש בבוקר, אורות כבויים בשמונה בערב).
  2. לאחר ההזרקה, היווצרות העובר בדרך כלל לוקח 24 שעות להשלים ו 36 שעות כדי לבקוע. השתמשו במברשת בעלת קצה דק כדי להעביר את הזחלים לדיאטת זחלים מוכנה. לאסוף זחלים שלוש או ארבע פעמים ביום עד שלא יבקעו עוד זחלים. באופן כללי, לזחלים לוקח 2-3 ימים לסיים את הבקיעה וגורים תוך 7 ימים.
    הערה: דיאטה מבוססת תירס שימשה להאכלת הזחלים. המתכון מכיל 150 גרם קמח תירס, 150 גרם בננה, 0.6 גרם של נתרן בנזואט, 30 גרם של שמרים, 30 גרם של סוכרוז, 30 גרם של מגבת נייר, 1.2 מ"ל של חומצה הידרוכלורית, ו 300 מ"ל של מים29. למזער את הזמן הזחלים נשארים בשמן (<2 שעות). העבירו את הזחלים לתזונה מיד לאחר הבקיעה ככל האפשר. זה יכול להגדיל באופן משמעותי את שיעורי ההישרדות והגורים. אל תספק יותר מדי דיאטה (דיאטה עם 2/3 של צלחת פטרי 90 מ"מ מספיק עבור 30 זחלים); אחרת, הוא יהפוך מעופש ויקטין את שיעור ההישרדות של הזחל.
  3. מכניסים את הזחלים הבוגרים לחול הרטוב כדי ללבות. שלב ההמלטה אורך כ-10 ימים. העבירו את הגלמים לכלובים מפלסטיק לפני תחילת האקלוזה.

5. הקרנה מוטנטית

  1. תרשים זרימה של ההקרנה המוטנטית מודגם באיור 3A. Cross G0 בוגרים המתקבלים על ידי מיקרו-הזרקה עם מבוגרים מסוג בר כדי להשיג קווים הטרוזיגוטיים. אמת את סוג המוטציות שהצאצאים (G1) נושאים על ידי גנוטיפ.
  2. חצייה עצמית של G1 עם אותו גנוטיפ מוטנטי כדי לקבל קווים הומוזיגוטיים ב-G2. אם הגנוטיפים של המוטנטים ב-G1 שונים לחלוטין, חצו את ההטרוזיגוטים עם זבובים מסוג בר. קווים הומוזיגוטיים מתקבלים בדרך כלל ב- G3. שמור על שניים או שלושה קווים הומוזיגוטיים לניסויים הפנוטיפיים הבאים.
  3. השתמש בדנ"א הגנומי מפופאריום טרי או מרגל אחת של מבוגרים בודדים כדי לבצע גנוטיפ. תכנן פריימרים ספציפיים כדי להגביר את אזור היעד; הפריימרים חייבים להגדיר לפחות 50 bps במעלה הזרם ובמורד הזרם של אתר היעד. עיין בשלב 1.2 לקבלת פרטי הפריימר.
    הערה: מאחר שכמות הדנ"א בפופאריום נמוכה ביותר, מומלץ להשתמש בערכות מיצוי דנ"א הזמינות באופן מסחרי.
  4. בצע PCR באמצעות תנאי המחזור הבאים: 98 °C למשך 3 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של 98 °C למשך 10 שניות, 15 שניות בטמפרטורת חישול המתאימה לפריימרים המתוכננים, 72 °C למשך 35 שניות, ולאחר מכן הארכה סופית של 72 °C למשך 10 דקות.
  5. רצף מוצרי PCR מטוהרים. כאשר מתגלות מספר פסגות חופפות הסמוכות לאתר המטרה (איור 3B), מתרחשת מוטגנזה מוצלחת. תת-שיבוט של תוצרי ה-PCR המטוהרים לווקטור קהה ובחר 10 מושבות חיידקים בודדות לריצוף כדי לאמת את הגנוטיפ של המוטנטים. שמרו על הקווים בעזרת מוטציות של הסטת מסגרת וסיומות תרגום מוקדמות (איור 3C).
    הערה: אין צורך לבצע ריצוף שיבוט יחיד כדי לאמת את הגנוטיפ של אנשים G0. פשוט רצף את מוצרי ה- PCR ושמור על הפרטים עם פסגות חפיפה מרובות ברורות הסמוכות לאתר היעד. לאחר ההזרקה הראשונית, מומלץ לבחור 10 עוברים לחילוץ DNA גנומי ולרצף את מוצרי ה-PCR בהתאם לתקנים בשלב 5.3. זה יכול לעזור לחזות מראש את שיעורי המוטציות. במחקר זה, ריצוף סנגר כדי לקבוע את הגנוטיפ נעשה על ידי חברת ריצוף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מציג שלבים מפורטים לפיתוח מוטציות B. dorsalis באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, כולל תוצאות מייצגות מבחירת gDNA, איסוף עוברים ומיקרו-הזרקות, תחזוקת חרקים ובדיקת מוטציות.

הדוגמה של אתר המטרה של הגן שנבחר ממוקמת באקסון השלישי (איור 1C). האתר הזה שמור מאוד, ופס יחיד זוהה על-ידי אלקטרופורזה בג'ל עבור תבנית הדנ"א של gRNA סינתטי (איור 1D) ו-gRNA שהושגו על-ידי שעתוק במבחנה (איור 1E).

ההזרקה ל-200 ביצים שזה עתה נקטפו בוצעה כמתואר בסעיף 3. העוברים נשמרו על ידי ביצוע הפרוטוקולים המתוארים בשלבים 4.1-4.3. כפי שזוהה על ידי ריצוף מוצרי ה-PCR, 80% מהפרטים של G0 הם מוטציות פסיפס (טבלה 1). כאן נבחרו מוטציות עם מחיקה של 8 bp שגרמו לסיום מוקדם של תרגום חומצות אמינו ב-G1 (איור 3C). זה צריך להוביל לשינויים בפונקציות המתאימות של מוצר גן זה ב B. dorsalis. ה-G1 שנבחר נחצה עם הטרוזיגוטים מסוג פרא כדי להשיג הטרוזיגוטים G2. הטרוזיגוטים וההומוזיגוטים של G2 חוצים את עצמם התאוששו בדור הבא, מה שמוכיח כי תוכנית זו מוצלחת לפיתוח מוטנטים של B. dorsalis ויכולה להיות מיושמת באופן נרחב יותר במחקרי גנים פונקציונליים במין זה ובמינים קרובים.

Figure 1
איור 1: הכנת sgRNA. (A) נהלים כלליים להכנת sgRNA. (B) אזור מטרה מוגבר על ידי PCR מ-gDNA (100 bp). (C) דוגמה למבנה גן המטרה ולאתר ביקוע המטרה על ידי Cas9. (D) הרכבה PCR של sgRNA (~ 100 bp). (E) סינתזה של sgRNA על ידי שעתוק וטיהור במבחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מיקרו-הזרקה של עובר . (A) תהליך ושיטת ההזרקה. (B) מכשיר לאיסוף עוברים, הטלת ביצים על גזה. (C) יישרו את העוברים במים וכיסו בשמן הלוקרבון. (D) מושך מיקרופיפטה. (E) כל ההתקנה של מערכת המיקרו-הזרקה. מיקרוסקופ (משמאל), מיקרו-מזרק ומיקרומניפולטור (באמצע), ומשאבת אוויר אוטומטית (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: סינון מוטאנטים . (A) הזדווגות של מוטנטים ורכישת הומוזיגוטים. (B) תוצרי PCR מהגנום המוטנטי אשר מייצרים קבוצה מובחנת של פסגות במטרה. (C) אחד מסוגי המוטציות והשינויים בחומצות האמינו. מוטציות מחיקה מובילות לסיום מוקדם של התרגום. קיצורים: HE = הטרוזיגוטים, HO = הומוזיגוטים. שליטה: עובר מוזרק עם sgRNA מקושקש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תערובת הזרקה עוברים מוזרקים זחלים בקעו גלמים פסיפס G0
(פסיפס/סה"כ מבוגרים)
BdorOrco_gRNA1 (300 ננוגרם/מיקרון) 200 83 66 49/60 (81%)
BdorOrco_gRNA2 (300 ננוגרם/מיקרול)
Cas9 (150 ננוגרם/מיקרו-ליטר)
פנול אדום (1 μL)
BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ננוגרם/מיקרול) 200 78 76 0/70 (0%)
BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ננוגרם/מיקרול)
Cas9 (150 ננוגרם/מיקרו-ליטר)
פנול אדום (1 μL)

טבלה 1: B. הישרדות דורסליס ומוטגנזה לאחר מיקרו-הזרקות.

בעיה סיבות פוטנציאליות פתרונות
איסוף עוברים לא יעיל 1. מבוגרים במצב גרוע 1.להבטיח את זמינות המזון והמים, במיוחד את תכולת הסוכר של המזון.
2. הזדווגות לא מספקת 2. הזדווגות מראש בתנאי עמימות של 30-50 לוקס. עדיף לבחור מבוגרים מזווגים בני 12-15 ימים.
יכולת בקיעה ירודה של ביצים לאחר הזרקה 1. עוברים באיכות ירודה 1. קוטפים ביצים טריות ושמנמנות ומברישים אותן בעדינות במברשת ספוגה במים.
2. מחט לא מתאימה 2. קצה המחט קטן ככל האפשר כדי למזער את הנזק לביצה במהלך ההזרקה.
3. גידול לא תקין של ביצים לאחר הזרקה 3. ביצים צריכות להישמר לחות לאחר ההזרקה כדי למנוע התייבשות התייבשות. ניתן גם להעביר ביצים ישירות למזון לאחר ההזרקה.
שיעור הישרדות נמוך של זחלים 1. מזון מעופש אינו מתאים לגידול זחלים 1. עבור זחלים שזה עתה בקעו, הוסיפו כמות קטנה של מזון. יותר מדי מזון יעובש או יתייבש וישפיע על צמיחת הזחלים.
2. זחלים שזה עתה בקעו ספוגים בשמן במשך זמן רב 2.הזחלים שזה עתה בקעו צריכים להיות מועברים למזון הזחל בזמן או שיש לקטוף את הביצים ישירות לתוך המזון לאחר ההזרקה.
שיעור המוטציות של מבוגרים נמוך 1. איכות נמוכה של gRNA 1. מבצע ניסיוני קפדני לסינתזה של gRNA באיכות גבוהה למניעת השפלה.
2. מטרות לא יעילות מובילות ליעדים מחוץ ליעדים 2. סינון יעדים בעלי יעילות גבוהה כפי שציינו בדיון שלנו.

טבלה 2: בעיות אפשריות בבניית מוטציות, גורמים פוטנציאליים ופתרונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת CRISPR/Cas9 היא הכלי הנפוץ ביותר לעריכת גנים ויש לה יישומים שונים, כגון תרפי גנים30, גידול יבולים 31, ומחקרים בסיסיים של חיטוי גנים32. מערכת זו כבר יושמה לעריכת גנים במיני חרקים שונים ושימשה כלי יעיל למחקרי גנים פונקציונליים במזיקים. הפרוטוקולים שאנו מציגים כאן מתקננים את הליך התכנון והסינתזה של רנ"א מנחה, איסוף עוברים, הזרקת עוברים, גידול חרקים וסינון מוטנטי. יתר על כן, נוספה טבלת פתרון בעיות כדי לסכם את הבעיה הפוטנציאלית מכל שלב, והפתרונות שלהם סופקו כדי להקל על עומס העבודה ולשפר את היעילות (טבלה 2). הליך זה מספק דרך אמינה לערוך גנים בעלי עניין ומשפר את המחקרים הגנומיים הפונקציונליים ב- B. dorsalis.

ראשית, בחירת גני מטרה היא קריטית להגברת היעילות של מערכת CRISPR/Cas9, ומספר תוכנות קוד פתוח כגון ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 ו-CRISPR מאתר מטרות אופטימלי 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) יכולות ליצור באופן אוטומטי מטרות ולחזות שיעורים פוטנציאליים מחוץ למטרה. מכיוון ששיעור הפוריות הגבוה של B. dorsalis מקל על איסוף העוברים, ניתן לחזות שיעורי מוטציה על ידי הקרבת חלק מהעוברים לצורך מיצוי DNA וריצוף של אזור המטרה. אם ריצוף אינו זמין במעבדה, מומלץ גם להשתמש באנדונוקלאז T7 I כדי לחזות את שיעורי המוטציות37. ניתן לבחור אתרי יעד עם שיעורי מחיקה גנומיים גבוהים באמצעות שלוש שיטות אלה, ולכן ניתן להגדיל את היעילות של עריכת גנים ב- B. dorsalis.

שלב ההתפתחות של העובר קובע אם מוטציות יעברו בתורשה. על מנת להשיג מוטציות תורשתיות, עריכת גנים חייבת להתרחש בתאי נבט. באופן כללי, לא ניתן להעביר את התערובת של sgRNA ו-Cas9 לתאי נבט לאחר היווצרות תאי הקוטב. ב- B. dorsalis, היווצרות תאי הקוטב התרחשה 3 שעות לאחר הטלת הביצה 38, בעוד שהפרוטוקול המפורט כאן עבור B. dorsalis לוקח 30 דקות מאיסוף העוברים ועד סוף המיקרו-הזרקה. במהלך ההזרקה, כמעט ולא נוצרים תאי קוטב בקצה הצמחי של העובר; לכן, מוטציות גנטיות המתקבלות ב- G0 צריכות לעבור בירושה ביעילות. הזמן הנצרך על ידי מיקרו הזרקה הוא גם פחות מהשיטה שהוזכרה במאמרים שפורסמו בעבר (בדרך כלל 1-3 שעות)18,19.

חשוב למזער נזקים מכניים או כימיים בתהליך איסוף העוברים והטיפול בהם. השתמשו במברשת עדינה כדי לסדר בעדינות את העוברים על צלחת ההזרקה. מיקום ההזרקה צריך לשקף את העבודה שנעשתה בעבר בדרוזופילה (שיטות - המעבדה של ניקולס גומפל, http://gompel.org/methods) ו Ceratitis capitata39. להזריק עוברים בקוטב הצמחי; לעולם אל תכניסו את המחט לקוטב החיה. הכן את המחט בעקבות מדריך מושך micropipette; פתיחת המחט צריכה להיות קטנה ככל האפשר כדי למנוע זרימה אחורית ציטופלסמית מוגזמת. השיטה המוזכרת במחקרים שפורסמו ב- B. dorsalis בדרך כלל dechorionated העוברים עם hypochorite נתרן17,18,19; זה עלול לגרום לנזק כימי ולהקטין את שיעורי ההישרדות של העוברים. בפרוטוקול זה, העוברים אינם מפורקים, וההזרקה עדיין פועלת היטב. הנזק הכימי לעוברים יכול להיות מזערי.

גידול חרקים לאחר הזרקה חשוב מאוד. פרוטוקול הגידול הסטנדרטי המסופק כאן יכול לשמש כאסמכתא לגידול מינים אחרים של זבוב הפירות, במיוחד מיני Bactrocera . ניתן לטבול את העוברים בשמן כדי למנוע ייבוש במהלך ההזרקה באמצעות צלחת ההזרקה העצמית שלנו. צמצם את הזמן שהזחל מבלה בשמן (<2 שעות) כדי להשיג שיעורי הישרדות ב- G0 מעל 50%.

שיטה לא פולשנית של מיצוי DNA גנומי מומלצת לזיהוי מוטציות. לדוגמה, כמה חוקרים lepidopteran מציעים כי exuviates של הזחלים הסופיים instar יכול לשמש כדי לחלץ DNA גנומי עבור גנוטיפ נוסף. עבור B. dorsalis, שיטה לא פולשנית אחת כוללת חילוץ דנ"א גנומי מפופאריום טרי. הזרקה של מספר sgRNAs המכוונים לגן סמן ולגן המעניין יכולה גם לשפר את זיהוי המוטנטים. לדוגמה, sgRNAs מוזרקים יחד המכוונים לצבע עיניים (kmo) ולקולטן הורמון נעורים (Met) יכולים לייצר 75% מהצאצאים עם מוטציות כפולות ביתושים. המוטנטים נבדקו באופן ראשוני על סמך צבע העיניים של הזחלים37. יש להעריך זאת ב - B. dorsalis בעתיד כדי לשפר עוד יותר את היעילות של עריכת גנים במין חרק זה על ידי שימוש במערכת CRISPR/Cas9.

לסיכום, מערכת CRSIPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה בגנומיקה פונקציונלית ב - B. dorsalis. הפרוטוקולים המפורטים שלנו מספקים מידע שימושי המסייע לחוקרים להשיג איסוף עוברים יעיל, שיעורי הישרדות אידיאליים של זחלים ויעילות העריכה הרצויה. זו יכולה להיות דרך פשוטה ומהירה לעזור לחוקרים להשיג מוטגנזה ב - B. dorsalis. טכניקה זו לא יכולה להיות מיושמת במחקרים פונקציונליים של גנים קטלניים מכיוון שהמוטציות התורשתיות זקוקות לרבייה צולבת מוצלחת. מחקרים עתידיים עשויים להתמקד בפיתוח כלים מהונדסים לביטוי רכיבי קריספר ספציפיים לשלב או לרקמות כדי לפרוץ את המגבלה הזו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של שנזן (מענק מס 'KQTD20180411143628272) וקרנות מיוחדות לחדשנות טכנולוגית מדעית ופיתוח תעשייתי של המחוז החדש של שנזן דפנג (מענק מס 'PT202101-02).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6x DNA Loading Buffer TransGen Biotech GH101-01
Artificial climate chamber ShangHai BluePard MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit Axygen AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT NA NA For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass WPI  1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Hisat2 NA NA For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV NA NA For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder NARISHIGE EG-401
Olympus Microscope Olympus Corporation SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit TransGen Biotech CB101-02 https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers Instrument Company  https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040A
SAMtools NA NA For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI NA NA sgRNA design
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter  Instrument Company  P-97
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech BM101-02
Transdecoder NA NA For combining the results of assemble transcripts and gene loci information
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36498
Ultra-trace biological detector Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
  2. Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
  3. Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
  4. Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  7. Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
  8. Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  10. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  11. Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
  12. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  13. Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
  14. Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
  15. Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
  16. Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
  17. Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
  18. Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
  19. Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
  20. Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
  21. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  22. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
  23. Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
  24. TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
  25. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
  26. Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
  27. Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
  28. Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
  29. Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
  30. Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
  31. El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
  32. Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  33. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  34. Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
  35. Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
  36. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  37. Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
  38. Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  39. Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 187
פרוטוקולים עבור CRISPR/Cas9 Mutagenesis של זבוב הפירות המזרחי <em>Bactrocera dorsalis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, J., Zhang, J., Zhang, Y.,… More

Yuan, J., Zhang, J., Zhang, Y., QiQiGe, W., Liu, W., Yan, S., Wang, G. Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis. J. Vis. Exp. (187), e64195, doi:10.3791/64195 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter