Summary
この論文は、オリエンタルショウジョウバエBactrocera dorsalisのCRISPR/Cas9突然変異誘発のための段階的なプロトコルを提示します。この標準化されたプロトコルによって提供される詳細な手順は、B. dorsalisの機能的遺伝子研究のための突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。
Abstract
オリエンタルショウジョウバエ、 Bactrocera dorsalis は、非常に侵略的で適応性のある害虫種であり、世界中の柑橘類や150を超える他の果物作物に被害をもたらします。成虫のショウジョウバエは飛行能力が高く、雌は果実の皮の下に卵を産むため、害虫との直接接触を必要とする殺虫剤は通常、野外ではあまり機能しません。分子生物学的ツールとハイスループットシーケンシング技術の開発により、多くの科学者が環境に優しい害虫管理戦略を開発しようとしています。これらには、さまざまな害虫の探索行動に関与する嗅覚遺伝子などの遺伝子(分子標的)を下方制御またはサイレンシングするRNAiまたは遺伝子編集ベースの農薬が含まれます。これらの戦略を東洋のショウジョウバエ防除に適応させるためには、機能遺伝子研究のための効果的な方法が必要です。 B. dorsalis の生存と繁殖に重要な機能を持つ遺伝子は、遺伝子ノックダウンおよび/またはサイレンシングの優れた分子標的として機能します。CRISPR/Cas9システムは、特に昆虫の遺伝子編集に使用される信頼性の高い技術です。本論文では、 B. dorsalisのCRISPR/Cas9変異誘発のための体系的な方法を提示し、ガイドRNAの設計と合成、胚の収集、胚注入、昆虫飼育、変異体スクリーニングを含む。これらのプロトコルは、 B. dorsalisの機能遺伝子研究に関心のある研究者にとって、突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。
Introduction
オリエンタルショウジョウバエ、バ クトセラ・ドルサリス は、グアバ、マンゴー、ユージニア属、スリナムチェリー、柑橘類、ビワ、パパイヤなど、150種以上の果物作物に被害を与える国際的な害虫種です1。広東省(中国)だけでも2億元以上の被害が見込まれています。成体の雌は、熟した果実または熟した果実の皮の下に卵を挿入し、果実の腐敗と脱落を引き起こし、果実の品質と作物の全体的な収量を低下させます2。成虫のショウジョウバエは飛行能力が高く、幼虫が果実の皮に穴を開けるため、害虫との直接接触を必要とする殺虫剤は野外ではあまり機能しません。さらに、殺虫剤の広範な使用により、さまざまな農薬に対する B.dorsalis の耐性が高まり、これらの有害な害虫の防除がさらに困難になっています3。したがって、効果的で環境に優しい害虫管理戦略の開発が切実に必要とされています。
近年、分子生物学的ツールやハイスループットシーケンシング技術の開発により、様々な害虫の重要な遺伝子(分子標的)の機能を対象としたRNAiなどの環境にやさしい害虫管理戦略の開発が試みられています。有害生物の生存と繁殖に重要な遺伝子は、機能遺伝子研究を通じて同定することができ、さらに、特異的に標的を絞った環境に優しい害虫管理ツールの改善のための潜在的な分子標的として役立つ可能性があります4。このような戦略を東洋のショウジョウバエ防除に適応させるためには、機能遺伝子研究のための効果的な方法が必要です。
CRISPR/Cas(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復/CRISPR関連)エンドヌクレアーゼシステムは、細菌や古細菌で最初に発見され、バクテリオファージの感染によって導入されるような外来細胞内DNAの認識と分解に関与する適応メカニズムであることが判明しました5。II型CRISPRシステムでは、Cas9エンドヌクレアーゼは小さな関連RNA(crRNAおよびtracrRNA)によって誘導され、不法侵入DNAを切断し6,7,8、現在までに遺伝子編集に最も広く使用されているツールの1つになっています9,10,11,12。CRISPR/Cas9システムには、遺伝子サイレンシングの高効率や低コストなどのいくつかの利点があるため、ネッタイシマカ13,14、イナマカ渡り15、ボンビクスモリ16など、さまざまな昆虫種の遺伝子編集にすでに適用されています。B. dorsalisでは、CRISPR/Cas917,18,19を用いて、体色、翅二型、性決定に関する遺伝子のノックアウトに成功しています。しかし、この昆虫におけるCRISPR/Cas9の適用のための詳細な手順は不完全なままです。さらに、B. dorsalis遺伝子編集のために研究者によって提供されたいくつかのステップも多様であり、標準化が必要です。例えば、Cas9の形態は、公開された参考文献17,18,19では異なっていた。
本論文では、CRISPR/Cas9システムを用いた B. dorsalis の突然変異誘発法について、ガイドRNAの設計・合成、胚の採取、胚注入、昆虫飼育、変異体スクリーニングなど、体系的な方法を提供します。このプロトコルは、 B. dorsalisの機能的遺伝子研究に関心のある研究者にとって、突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。
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Protocol
1. sgRNAのターゲット設計と インビトロ 合成
- B. dorsalisゲノムのバイオインフォマティクス解析により、目的の標的遺伝子の構造を予測し、エクソンとイントロンの境界を決定します(ここで使用されるソフトウェアアプリケーションは、材料表に記載されています)。
注:BLAT20 は、ゲノム内の潜在的な遺伝子座を検索するために使用されました。高品質のRNA-seqリード(トランスクリプトーム)を、Hisat221を用いて取得した遺伝子座にアラインメントした。Samtools22 は、ソートされた bam ファイルを生成するために使用されました。ソートされた bam ファイルは、アセンブル トランスクリプトを提供するために Stringtie223 に入力されました。アセンブル転写物および遺伝子座情報は、トランスデコーダ24によって結合された。トランスデコーダから得られた結果はIGVツール25 で視覚化され、エクソンとイントロンの間の境界を決定することができた。 - 候補標的遺伝子部位内の適切な標的領域を同定する。より便利なシーケンシングのために、全長は750bp未満でなければなりません(図1B)。PCRにより野生型ゲノムDNAから標的領域を増幅するための特異的プライマーを設計する(図1B)(プライマー:Fプライマー:AACATTGAATCTGGAATCAGGTAACT、Rプライマー:CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC)。PCR産物を平滑末端ベクター26 にクローニングし、シーケンシングのために20の個々の細菌コロニーを選択して、実験室の昆虫集団における標的領域の保存状態を決定します。
- 典型的な標的部位は、3ヌクレオチド配列モチーフ(NGGまたはCCN)およびNGGまたはCCNモチーフに隣接する20bp配列(20bp-NGGまたはCCN-20bp)を含む。 B. dorsalis ゲノムに対して候補標的部位を爆破し、予測効率が十分に高く、オフターゲティング率が低いことを確認します。いくつかのオープンソースソフトウェアプログラムは、これを自動的に予測できます。このプロトコルでは、sgRNAcas9 -AI27 を使用して、最適なターゲットを選択および評価します。使用の詳細は、このソフトウェアのマニュアルに記載されています。
注:標的遺伝子の5' UTRに閉鎖された可能性のある標的部位と、20 bp配列の開始時に1〜2 Gsが推奨されます。PCRとそれに続くアガロースゲル電気泳動によって同定される大きな欠失を達成するためには、100 bp以上離れた2つのターゲット28 を設計することが推奨されます(図1C)。 - 市販のgRNA合成キットを使用して、設計したsgRNAを生成します。ユーザーズガイドに従って各手順を実行します。gRNA産物をヌクレアーゼフリーの水に再懸濁し、UV-Vis分光光度計を使用して濃度を定量し、使用前に-80°Cで保存します(ここで使用したキットで合成に成功した単一gRNA[10 μL]の濃度は約4000-6000 ng / μL、またはそれ以上です)。
注:変異ハエの生成はすべての研究者にとって最初のステップですが、下流の実験/分析のための適切なネガティブコントロールは重要です。変異体と一緒にこれらのコントロールを生成することで、研究者の時間と労力を節約できます。例えば、スクランブルされたsgRNAをネガティブコントロールとして設定します。
2.胚の収集と準備
- B.背側の蛹をプラスチック製のケージに入れます。大人が閉じた後、砂糖と酵母の混合物(1:1)を水源と一緒に食物として提供します(図2A、B)。飼育条件は相対湿度55%RH、26.5°C、L/Dサイクル14:10(朝6時点灯、夜8時消灯)です。
- ほとんどの成人は出現後10日で性的成熟に達します。成虫のハエができるだけ交尾できるように、適切な環境を提供します。理想的には、30〜50ルクスのライトを備えたライトスタンドを使用してください。これは女性の繁殖力を改善することができ、それ故に胚収集の効率を改善することができる。
注:成虫(出現後5〜6日齢)を薄暗い(<100ルクス)環境に置くと、交配を促進することができます。一般的に、産卵のピークは午後03:00に発生します(14:10 / L:D、午前06:00に点灯、午後08:00に消灯)。十分な胚を得るために、午後03:00の30分前に産卵室をケージに入れることをお勧めします。 - チャンバーの蓋から1〜2 mm離れた産卵室に200メッシュのガーゼを置きます。これはできるだけ多くの胚を得るのに役立ちます。
注:胚をオレンジジュースに浸したり、ガーゼでこすったりすると、胚の生存率が大幅に低下する可能性があるため、避けてください。 - マイクロインジェクションのセットアップの準備ができたら、新しい産卵室をケージに入れます。細かいウェットブラシを使用して10分ごとに胚を収集し、自作の注射プレート(長さ55 mm、幅13.75 mm、高さ5 mmのプレキシガラス、45 mm x 5 mm x 0.3 mmの浅い溝を中央に開き、卵の配置を容易にします)。胚の内圧が高い場合、<10%RHで10分間のわずかな乾燥は任意である。さらなる乾燥を避けるために、注射中に胚をハロカーボンオイルに浸します(図2C)。
3.胚のマイクロインジェクション
- マイクロピペットプラーを使用してガラス注射針を準備します。
注意: ユーザーガイドに従ってパラメータを設定することが重要です。これらのプロトコルでは、マイクロピペットプーラーのマニュアルで提案されているパラメータを使用して、さまざまな針の形状を作成できます。ガラスキャピラリーは、ほこりが針を詰まらせるのを防ぐために、できるだけ清潔でなければなりません。 - 実用的な解決策を準備します。Cas9タンパク質と対応するsgRNAを次の使用濃度に混合します:sgRNA、300 ng / μL;Cas9タンパク質、150 ng/μL。 1 μLのフェノールレッドを混合物に加えると、注入された胚に印を付けるのに便利な方法になります。調製した混合物を氷上に置いて、sgRNAの分解を避ける。
注:ヌクレアーゼフリーのピペットチップとPCRチューブを使用してください。Cas9タンパク質の濃度は150 ng / μL以下である必要があります。高濃度は毒性があり、胚の生存率を著しく低下させます。Cas9は、遺伝子編集を成功させるためにDNAまたはmRNA形式で送達することもできます17,19。このプロトコルでは、mRNAは分解を受けやすく、プラスミドDNAからのCas9タンパク質の発現には転写と翻訳に時間がかかるため、Cas9タンパク質が推奨されます。 - インジェクターのパラメータを設定します。初期プログラムはPi-500 hPa、Ti-0.5 s、PC-200 hPaです。マイクロインジェクション中に必要に応じて、これらのパラメータをさらに調整します。
- 3μLの混合物を注射針に加えます。針を詰まらせる可能性のある気泡の導入は避けてください。マイクログラインダーを使用して針を開きます。
- ユーザーガイドに従って針をマイクロマニピュレーターに接続します(図2E)。
- 胚を並べたプレートを客観的なテーブルに置きます。マイクロピペットの位置を微細光学顕微鏡で調整し、マイクロピペットと胚を同じ平面上にセットします。ペダルを踏んで液滴の音量を調整します。胚の体積の1/10が推奨されます。
- 針先を胚の後方(植物極)に挿入します。インジェクターからペダルを押して、混合物を胚に送ります。フェノールレッドを加えると、わずかに赤みがかった色がすぐに観察されます。
注:ピンホールからの少量の細胞質逆流は、胚の生存率を低下させません。200個の胚の注射は、1つの遺伝子の突然変異誘発を成功させるのに十分です。胚を浸すためにさらにハロカーボンオイルを追加すると、それ以上の乾燥を防ぐことができます。注射は極細胞形成の前に実行する必要があり、これによりすべての突然変異を効率的に継承できます。
4.注射後の昆虫飼育
- 注入された胚を含む注射プレートを、55%RH、26.5°C、および14:10 L / Dサイクル(朝6時に点灯、夕方8時に消灯)に保たれた人工気候室に入れます。
- 注射後、胚形成は通常、完了するのに24時間、孵化するのに36時間かかります。細い先端のブラシを使用して、幼虫を準備した幼虫の食事に移します。幼虫が孵化しなくなるまで、毎日3〜4回幼虫を集めます。一般的に、幼虫は孵化を終え、7日以内に蛹になるまでに2〜3日かかります。
注:幼虫を養うためにトウモロコシベースの食事が使用されました。レシピには、150 gのコーンフラワー、150 gのバナナ、0.6 gの安息香酸ナトリウム、30 gの酵母、30 gのスクロース、30 gのペーパータオル、1.2 mLの塩酸、および300 mLの水が含まれています29。幼虫が油に残される時間を最小限に抑えます(<2時間)。可能な限り孵化した直後に幼虫を食事に移します。これにより、生存率と蛹化率が大幅に向上する可能性があります。あまり多くの食事を提供しないでください(90 mmのペトリ皿の2/3の食事は30匹の幼虫に十分です)。そうしないと、カビが生え、幼虫の生存率が低下します。 - 成熟した幼虫を湿った砂に入れて蛹にします。蛹化段階は約10日かかります。閉鎖が始まる前に、蛹をプラスチック製のケージに移動します。
5. 変異体スクリーニング
- 変異体スクリーニングのフローチャートを 図3Aに示す。得られた成体G0を野生型成体とマイクロインジェクションにより交配し、ヘテロ接合株を得た。子孫(G1)が持っている突然変異の種類をジェノタイピングによって確認します。
- G1を同じ変異遺伝子型で自己交配し、G2のホモ接合株を得る。G1の変異体の遺伝子型がまったく異なる場合は、ヘテロ接合体を野生型のハエと交配します。ホモ接合株は通常G3で得られます。その後の表現型実験のために2つまたは3つのホモ接合株を維持します。
- 新鮮な蛹または個々の成人の単一の中脚からのゲノムDNAを使用して、ジェノタイピングを実行します。標的領域を増幅するための特異的プライマーを設計する。プライマーは、標的部位の上流および下流に少なくとも50 bpsを設定する必要があります。プライマーの詳細については、ステップ 1.2 を参照してください。
注:蛹のDNA量が極めて少ないため、市販のDNA抽出キットを推奨します。 - 次のサイクル条件を使用してPCRを実行します:98°Cで3分間、続いて98°Cで10秒間、設計したプライマーに適したアニーリング温度で15秒間、72°Cで35秒間、その後72°Cで10分間の最終伸長。
- 精製されたPCR産物をシーケンスします。標的部位に隣接する複数の重複するピークが検出されると(図3B)、突然変異誘発が成功している。精製されたPCR産物を平滑末端ベクターにサブクローニングし、シーケンシングのために10個の個々の細菌コロニーを選択して、変異体の遺伝子型を検証します。フレームシフト変異と早期翻訳終了のあるラインを維持します(図3C)。
注:G0個体の遺伝子型を検証するためにシングルクローンシーケンシングを実行する必要はありません。PCR産物を配列決定し、標的部位に隣接する明らかな複数のオーバーラップピークを持つ個体を維持するだけです。最初の注射後、ゲノムDNAを抽出するために10個の胚を選択し、ステップ5.3の標準に基づいてPCR産物を配列決定することをお勧めします。これは、突然変異率を事前に予測するのに役立ちます。この研究では、遺伝子型を決定するためのサンガーシーケンシングは、シーケンシング会社によって行われました。
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Representative Results
このプロトコルは、gDNA選択、胚の収集とマイクロインジェクション、昆虫の維持、変異体のスクリーニングからの代表的な結果を含む、CRISPR/Cas9技術を使用した B.dorsalis 変異体の開発のための詳細な手順を示しています。
選択された遺伝子の標的部位の例は、第3エクソンに位置する(図1C)。この部位は高度に保存されており、合成gRNA(図1D)および in vitro 転写によって得られたgRNAのDNAテンプレートについてゲル電気泳動によって単一バンドを検出した(図1E)。
200個の採れたての卵への注入は、セクション3の説明に従って行われました。胚は、ステップ4.1〜4.3に記載されるプロトコルに従って維持された。PCR産物のシーケンシングによって検出されたように、G0個体の80%はモザイク変異体である(表1)。ここでは、G1におけるアミノ酸翻訳の早期終結をもたらした8bp欠失を有する変異体を選択した(図3C)。これは、 B. dorsalisにおけるこの遺伝子産物の対応する機能の変化につながるはずです。選択したG1を野生型と交配し、G2ヘテロ接合体を得た。G2ヘテロ接合体とホモ接合体の自己交配が次世代で回収され、このスキームが B. dorsalis 変異体の開発に成功し、この種および近縁種の機能遺伝子研究により広く適用できることを示しています。
図1:sgRNAの調製 。 (A)sgRNA調製の一般的な手順。(B)gDNAからPCRにより増幅した標的領域(100bp)。(c)Cas9による標的遺伝子構造および標的切断部位の例。(D)sgRNAのPCRアセンブリ(~100 bp)。(E) インビトロ 転写精製によるsgRNAの合成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胚マイクロインジェクション 。 (A)注射のプロセスと方法。(B)ガーゼ上に卵を産む胚採取装置。(C)胚を水で並べ、ハロカーボンオイルで覆います。(D)マイクロピペットプーラー。(E)マイクロインジェクションシステムのセットアップ全体。顕微鏡(左)、マイクロインジェクターとマイクロマニピュレーター(中央)、自動エアポンプ(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:変異体のスクリーニング 。 (A)変異体の交配とホモ接合体の獲得。(B)標的に別個のピークセットを生成する変異ゲノムからのPCR産物。(c)変異の種類とアミノ酸のいずれかが変化する。欠失変異は翻訳の早期終了につながる。略語:HE =ヘテロ接合体、HO =ホモ接合体。対照:スクランブルされたsgRNAを注入した胚。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| インジェクションミックス | 注入された胚 | 孵化した幼虫 | 蛹 | モザイクG0 | ||
| (モザイク/成人全体) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| フェノールレッド(1μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| フェノールレッド(1μL) | ||||||
表1:マイクロインジェクション後の B.背筋の 生存と突然変異誘発。
| 問題 | 考えられる原因 | ソリューション | |
| 非効率的な胚採取 | 1.成人の状態が悪い | 1.食品と水、特に食品の糖分を確保します。 | |
| 2.不十分な交配 | 2. 30〜50ルクスの薄暗い条件下で事前に嵌合します。12〜15日齢の交配した成人を選択するのが最善です。 | ||
| 注射後の卵の孵化率が悪い | 1.質の悪い胚 | 1.新鮮でふっくらとした卵を選び、水に浸したブラシでそっと磨きます。 | |
| 2.針が合わない | 2.注射中の卵への損傷を最小限に抑えるために、針の先端はできるだけ小さくなっています。 | ||
| 3.注射後の卵の不適切な飼育 | 3.脱水症状が乾燥するのを防ぐために、注射後は卵を水分補給しておく必要があります。卵は注射後に直接食品に移すこともできます。 | ||
| 低い幼虫の生存率 | 1.カビの生えた食べ物は幼虫の成長には適していません | 1.新しく孵化した幼虫の場合は、少量の食物を加えます。食べ物が多すぎると、カビが生えたり乾燥したりして、幼虫の成長に影響を与えます。 | |
| 2.長い間油に浸した新しく孵化した幼虫 | 2.新しく孵化した幼虫は、時間内に幼虫の餌に移すか、注射後に卵を直接餌に摘み取る必要があります。 | ||
| 成人の突然変異率が低い | 1.低品質のgRNA | 1.分解を防ぐために高品質のgRNAを合成するための厳格な実験操作。 | |
| 2. 非効率な目標がオフ目標につながる | 2.私たちの議論が述べたように、高効率のターゲットをスクリーニングします。 | ||
表2:変異体の構築で考えられる問題、考えられる原因、および解決策。
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Discussion
CRISPR/Cas9システムは、最も広く使用されている遺伝子編集ツールであり、遺伝子スレピー30、作物育種31、遺伝子機能の基礎研究32など、さまざまな用途があります。このシステムは、すでに様々な昆虫種の遺伝子編集に応用されており、害虫の機能的遺伝子研究に有効なツールとして役立っています。ここで紹介するプロトコルは、ガイドRNAの設計と合成、胚の収集、胚の注入、昆虫の飼育、および変異体のスクリーニングの手順を標準化します。さらに、各ステップの潜在的な問題をまとめたトラブルシューティング表を追加し、作業負荷の軽減と効率向上のためのソリューションを提供しました(表2)。この手順は、目的の遺伝子を編集するための信頼できる方法を提供し、 B. dorsalisの機能ゲノム研究を改善します。
まず、CRISPR/Cas9システムの効率を高めるためには、標的遺伝子の選択が重要であり、ChopChop 33,34(http://chopchop.cbu.uib.no/)、sgRNAcas9(V3.0)35、CRISPR最適ターゲットファインダー36(http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu)などのいくつかのオープンソースソフトウェアプログラムが自動的にターゲットを生成し、潜在的なオフターゲット率を予測することができます。B. dorsalisの高い繁殖率は胚の採取を容易にするので、DNA抽出と標的領域の配列決定のために胚の一部を犠牲にすることによって突然変異率を予測することができます。シーケンシングがラボで利用できない場合は、T7エンドヌクレアーゼIを使用して突然変異率を予測することも推奨されます37。これら3つの方法でゲノム欠失率の高い標的部位を選定できるため、B. dorsalisの遺伝子編集の効率を高めることができます。
胚の発生段階は、突然変異が遺伝するかどうかを決定します。遺伝性突然変異を得るためには、生殖細胞で遺伝子編集が行われなければならない。一般に、sgRNAとCas9の混合物は、極細胞形成が起こった後に生殖細胞に送達することはできません。B. dorsalisでは、極細胞形成は産卵後3時間で起こりましたが38、B. dorsalisについてここで詳述されているプロトコルは、胚の収集からマイクロインジェクションの終了まで30分かかります。注射中、胚の植物端に極細胞はほとんど形成されません。したがって、G0で得られた遺伝子変異は効率的に遺伝されるべきである。マイクロインジェクションによって消費される時間も、以前に発表された論文で言及された方法よりも短い(一般に1〜3時間)18,19。
胚の収集および取り扱いのプロセス中の機械的または化学的損傷を最小限に抑えることが重要です。細いブラシを使用して、注入プレートに胚をそっと並べます。注射の位置は、ショウジョウバエ(方法-ニコラスゴンペルの研究室、http://gompel.org/methods)および頭蓋角膜炎39で以前に行われた作業を反映する必要があります。植物極に胚を注入する。動物の棒に針を挿入しないでください。マイクロピペットプラーガイドに従って針を準備します。針の開口部は、過剰な細胞質の逆流を避けるためにできるだけ小さくする必要があります。B. dorsalisの発表された研究で言及された方法は、一般的に胚をヒポコライトナトリウムで脱絨毛処理しました17,18,19;これは化学的損傷を引き起こし、胚の生存率を低下させる可能性があります。このプロトコルでは、胚は脱絨毛化されておらず、注射は依然としてうまく機能します。胚への化学的損傷は最小限である可能性があります。
注射後の昆虫飼育は非常に重要です。ここで提供される標準化された飼育プロトコルは、他のショウジョウバエ種、特に バクトセラ 種を飼育するための基準として役立ちます。胚は、自作の注射プレートを使用して、注入中の乾燥を避けるために油に浸すことができます。幼虫が油に費やす時間(<2時間)を最小限に抑えて、G0の生存率を50%以上達成します。
変異体の検出には、ゲノムDNA抽出の非侵襲的方法が推奨されます。たとえば、一部の鱗翅目の研究者は、最終的な齢幼虫の滲出液を使用して、さらなるジェノタイピングのためにゲノムDNAを抽出することができると示唆しています。 B. dorsalisの場合、1つの非侵襲的方法は、新鮮な蛹からゲノムDNAを抽出することを含む。マーカー遺伝子と目的の遺伝子を標的とする複数のsgRNAを注入することも、変異体の同定を改善する可能性があります。例えば、目の色(kmo)と幼若ホルモン受容体(Met)を標的とするsgRNAを同時注入すると、蚊の二重変異を持つ子孫の75%を産生することができます。 Met 変異体は、幼虫37の目の色に基づいて予備スクリーニングを行った。これは、CRISPR/Cas9システムを使用して、この昆虫種の遺伝子編集の有効性をさらに向上させるために、将来的にB . dorsalis で評価される必要があります。
結論として、CRSIPR / Cas9システムは、 B.背筋の機能ゲノミクスにおける強力なツールです。私たちの詳細なプロトコルは、研究者が効率的な胚収集、幼虫の理想的な生存率、および望ましい編集効率を達成するのに役立つ有用な情報を提供します。これは、研究者が B.dorsalis で突然変異誘発を得るのを助けるための簡単で迅速な方法である可能性があります。この技術は、遺伝性の突然変異が交配を成功させる必要があるため、致死遺伝子の機能研究には適用できませんでした。将来の研究では、この制限を打ち破るために、ステージまたは組織特異的なCRISPR要素を発現するためのトランスジェニックツールの開発に焦点を当てることができます。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この作業は、深セン科学技術プログラム(助成金番号。 KQTD20180411143628272)および深セン大鵬新区の科学技術革新と産業開発のための特別基金(助成金番号PT202101-02)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
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