Detta dokument presenterar steg-för-steg-protokollen för CRISPR/Cas9-mutagenes av den orientaliska fruktflugan Bactrocera dorsalis. Detaljerade steg som tillhandahålls av detta standardiserade protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för funktionella genstudier i B. dorsalis.
Den orientaliska bananflugan, Bactrocera dorsalis, är en mycket invasiv och adaptiv skadedjursart som orsakar skador på citrusfrukter och över 150 andra fruktgrödor över hela världen. Eftersom vuxna fruktflugor har stor flygkapacitet och kvinnor lägger sina ägg under fruktskinnet, fungerar insekticider som kräver direktkontakt med skadedjuret vanligtvis dåligt i fältet. Med utvecklingen av molekylärbiologiska verktyg och sekvenseringsteknik med hög kapacitet försöker många forskare utveckla miljövänliga strategier för skadedjurshantering. Dessa inkluderar RNAi eller genredigeringsbaserade bekämpningsmedel som nedreglerar eller tystar gener (molekylära mål), såsom luktgener som är involverade i sökbeteende, i olika skadedjur. För att anpassa dessa strategier för orientalisk fruktflugekontroll behövs effektiva metoder för funktionell genforskning. Gener med kritiska funktioner i överlevnad och reproduktion av B. dorsalis fungerar som bra molekylära mål för gennedslag och / eller tystnad. CRISPR/Cas9-systemet är en pålitlig teknik som används för genredigering, särskilt hos insekter. Denna uppsats presenterar en systematisk metod för CRISPR/Cas9-mutagenes av B. dorsalis, inklusive design och syntes av guide-RNA, insamling av embryon, embryoinjektion, insektsuppfödning och mutantscreening. Dessa protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för forskare som är intresserade av funktionella genstudier i B. dorsalis.
Den orientaliska bananflugan, Bactrocera dorsalis , är en kosmopolitisk insektsskadeart som orsakar skador på över 150 arter av fruktgrödor, inklusive guava, mango, Eugenia spp., Surinam körsbär, citrus, loquat och papaya1. Skadorna som orsakats enbart i Guangdongprovinsen (Kina) uppskattas till över 200 miljoner yuan. Vuxna kvinnor sätter in sina ägg under huden av mogna eller mogna frukter, vilket orsakar förfall och abscission av frukten, vilket minskar fruktkvaliteten och det totala utbytet av grödan2. Eftersom vuxna fruktflugor har stor flygkapacitet och deras larver borrar in i frukthuden, fungerar insekticider som kräver direktkontakt med skadedjuret dåligt i fältet. Dessutom har den omfattande användningen av insekticider ökat resistensen hos B. dorsalis mot olika jordbrukskemikalier, vilket gör kontrollen av dessa skadliga skadedjur ännu svårare3. Därför behövs det ett desperat behov av att utveckla effektiva och miljövänliga strategier för skadedjursbekämpning.
Nyligen, med utvecklingen av molekylärbiologiska verktyg och sekvenseringsteknik med hög kapacitet, försöker forskare utveckla miljövänliga strategier för skadedjurshantering, såsom RNAi, som riktar sig mot funktionaliteten hos viktiga gener (molekylära mål) för olika skadedjur. Gener som är avgörande för skadegörarens överlevnad och reproduktion kan identifieras genom funktionella genstudier och fungerar vidare som potentiella molekylära mål för förbättring av specifikt riktade och miljövänliga verktyg för skadedjursbekämpning4. För att anpassa sådana strategier till orientalisk fruktflugekontroll behövs effektiva metoder för funktionell genforskning.
CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) endonukleassystemet upptäcktes ursprungligen i bakterier och arkéer och visade sig vara en adaptiv mekanism som är involverad i igenkänning och nedbrytning av främmande intracellulärt DNA, såsom det som infördes genom att infektera bakteriofager5. I CRISPR-systemet av typ II styrs Cas9-endonukleas av små associerade RNA (crRNA och tracrRNA) för att klyva intrångs-DNA 6,7,8 och har blivit ett av de mest använda verktygen för genredigering hittills9,10,11,12. Eftersom CRISPR/Cas9-systemet har flera fördelar, såsom hög effektivitet för gendämpning och låg kostnad, har det redan använts för genredigering i olika insektsarter, inklusive Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 och Bombyx mori16. I B. dorsalis har gener relaterade till kroppsfärg, vingdimorfism och könsbestämning framgångsrikt slagits ut med CRISPR/Cas917,18,19. Detaljerade procedurer för CRISPR/Cas9-applicering i denna insekt är dock fortfarande ofullständiga. Dessutom är vissa steg som tillhandahålls av forskare för B. dorsalis genredigering också varierade och i behov av standardisering. Till exempel var formerna av Cas9 olika i publicerade referenser17,18,19.
Detta dokument tillhandahåller en systematisk metod för mutagenes av B. dorsalis med hjälp av CRISPR / Cas9-systemet, inklusive design och syntes av guide-RNA, insamling av embryon, embryoinjektion, insektsuppfödning och mutantscreening. Detta protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för forskare som är intresserade av funktionella genstudier i B. dorsalis.
CRISPR/Cas9-systemet är det mest använda genredigeringsverktyget och har olika tillämpningar, såsom genförtunning30, grödavel 31 och grundläggande studier av genfuktioner32. Detta system har redan använts för genredigering hos olika insektsarter och har fungerat som ett effektivt verktyg för funktionella genstudier i skadedjur. De protokoll vi presenterar här standardiserar proceduren för design och syntes av guide-RNA, insamling av embry…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) och särskilda medel för vetenskapsteknologisk innovation och industriell utveckling av Shenzhen Dapeng New District (Bidrag nr PT202101-02).
6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |