Summary

En Gezicht Endocardiale kussenvoorbereiding voor planaire morfogeneseanalyse bij muizenembryo's

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

Klassiek is het endocardium van de embryonale klep primordium van de muis geanalyseerd met behulp van transversale, coronale of sagittale secties. Onze nieuwe benadering voor en face, tweedimensionale beeldvorming van het endocardium in valvulogene gebieden maakt planaire polariteit en celherschikkingsanalyse van het endocardium mogelijk tijdens de ontwikkeling van de klep.

Abstract

De studie van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het hart van zoogdieren is essentieel om aangeboren hartaandoeningen bij de mens aan te pakken. De ontwikkeling van de primitieve hartkleppen omvat de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) van endocardiale cellen uit het atrioventriculaire kanaal (AVC) en het uitstroomkanaal (OFT) van het hart als reactie op lokale inductieve myocardiale en endocardiale signalen. Zodra de cellen delamineren en de extracellulaire matrix (cardiale gelei) tussen het endocardium en het myocardium binnendringen, worden de primitieve endocardiale kussens (EC) gevormd. Dit proces houdt in dat het endocardium de gaten moet opvullen die de gedelamineerde cellen hebben achtergelaten en zichzelf moet reorganiseren om te convergeren (smal) of uit te breiden (verlengen) langs een as. Huidig onderzoek heeft de planaire celpolariteit (PCP) -route betrokken bij het reguleren van de subcellulaire lokalisatie van de factoren die bij dit proces betrokken zijn. Klassiek zijn de eerste fasen van de ontwikkeling van hartkleppen bestudeerd in doorsneden van embryonale harten of in ex vivo AVC- of OFT-explantaten gekweekt op collageengels. Deze benaderingen maken de analyse van apico-basale polariteit mogelijk, maar maken de analyse van celgedrag binnen het vlak van het epitheel of van de morfologische veranderingen van migrerende cellen niet mogelijk. Hier tonen we een experimentele benadering die de visualisatie van het endocardium in valvulogene regio’s mogelijk maakt als een planair veld van cellen. Deze experimentele aanpak biedt de mogelijkheid om PCP, planaire topologie en intercellulaire communicatie binnen het endocardium van de OFT en AVC te bestuderen tijdens de ontwikkeling van de klep. Het ontcijferen van nieuwe cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de morfogenese van de hartklep kan bijdragen aan het begrijpen van aangeboren hartaandoeningen geassocieerd met endocardiale kussendefecten.

Introduction

Het hart is het eerste functionele orgaan van een zoogdierembryo. Rond embryonale dag (E) 7,5 bij muizen vormen bilaterale precardiale mesodermcellen de cardiale halve maan in de ventrale kant1. De cardiale halve maan bevat twee populaties van precardiale cellen die voorlopers van het myocardium en het endocardium2 omvatten. Rond E8.0 smelten de cardiale voorlopers samen in de middellijn en vormen de primitieve hartbuis bestaande uit twee epitheliale weefsels, het buitenste myocardium en het binnenste endogarium, een gespecialiseerd endotheel gescheiden door een extracellulaire matrix genaamd cardiale gelei. Later, bij E8.5, ondergaat de hartbuis een rechterwaartse lus. Het lusvormige hart heeft verschillende anatomische regio’s met specifieke moleculaire handtekeningen zoals het uitstroomkanaal (OFT), de ventrikels en het atrio-ventrikelkanaal (AVC)3. Hoewel aanvankelijk de hartbuis aan de instroomzijde uitzet door de toevoeging van cellen4, resulteert intensieve hartproliferatie bij E9,5 in ballonvorming van de kamers en vestiging van het trabeculaire netwerk5. Klepvorming vindt plaats in de AVC (toekomstige mitralis- en tricuspidaliskleppen) en in de OFT (toekomstige aorta- en longkleppen).

Het endocardium speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van kleppen. Endocardiale cellen ondergaan epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT) in de AVC en OFT om de endocardiale kussens te vormen, een structuur die verschijnt bij het begin van de klepontwikkeling. Verschillende signaleringsroutes activeren dit proces; bij E9,5 bij muizen bevordert NOTCH geactiveerd in het endocardium als reactie op van myocards afgeleide BMP2 invasieve EMT van endocardcellen in de AVC- en OFT-regio’s door activering van TGFβ2 en SNAIL (SNAI1), die de expressie van vasculair endotheel cadherine (VE-cadherine), een transmembraancomponent van adherens junctions (AJs)6,7,8 direct onderdrukt . In de OFT wordt de activering van het endocardium om EMT te initiëren gemedieerd door FGF8 en BMP4, waarvan de expressie wordt geactiveerd door NOTCH 9,10,11,12.

Progressie van EMT omvat cellulaire dynamiek als cellen van vorm veranderen, kruispunten met hun buren verbreken en opnieuw maken, delamineren en beginnen te migreren13. Deze veranderingen omvatten AJ-remodellering en geleidelijke demontagevan 14,15, planaire celpolariteit (PCP) signalering, het verlies van apico-basale polariteit (ABP), apicale vernauwing en cytoskeletale organisatie16,17. ABP verwijst naar de verdeling van eiwitten langs de voorste-achterste as van een cel. In het zich ontwikkelende hart is ABP-regulatie in cardiomyocyten vereist voor ventriculaire ontwikkeling18. PCP verwijst naar een gepolariseerde verdeling van eiwitten in cellen over het vlak van een weefsel en reguleert de cellulaire distributie; epithelia met een stabiele geometrie bestaan uit zeshoekige cellen, waarbij slechts drie cellen samenkomen op de hoekpunten 19,20,21,22. Verschillende cellulaire processen, zoals celdeling, burenuitwisseling of delaminatie die plaatsvindt tijdens epitheliale morfogenese, produceren een toename van het aantal cellen dat convergeert op een hoekpunt en het aantal naburige cellen dat een bepaalde cel heeft22. Dit cellulaire gedrag gerelateerd aan PCP kan worden gereguleerd door verschillende signaalroutes, actinedynamiek of intracellulaire handel23.

De gegevens die zijn gegenereerd bij het bestuderen van de klepontwikkeling bij muizen zijn verkregen uit transversale, coronale of sagittale secties van E8,5 en E9,5 embryonale harten, waar het endocardium wordt weergegeven als een lijn van cellen in plaats van als een veld van cellen – het endocardium bedekt het hele binnenoppervlak van de hartbuis24. Embryonale secties staan de analyse van PCP in het endocardium van muizenembryo’s niet toe. Onze nieuwe experimentele methode maakt de analyse van endocardiale celverdeling, AJ-anisotropie en eencellige vormanalyse mogelijk, zoals weergegeven in de representatieve resultaten. Dit type gegevens is vereist voor PCP-analyse, samen met de beschrijving van andere moleculen die verband houden met PCP, niet weergegeven in dit rapport. Immunofluorescentie op de hele berg, specifieke monstervoorbereiding en het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen maken planaire polariteitsanalyse in het endocardium mogelijk bij het begin van de klepontwikkeling bij muizen.

Protocol

Dierstudies werden goedgekeurd door het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Animal Experimentation Ethics Committee en door de Gemeenschap van Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Alle dierprocedures zijn in overeenstemming met EU-richtlijn 2010/63EU en Aanbeveling 2007/526/EG betreffende de bescherming van dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden, vastgesteld in de Spaanse wetgeving onder Real Decreto 1201/2005. 1. Obtention va…

Representative Results

De gegevens die met behulp van dit protocol worden gegenereerd, laten zien dat het mogelijk is om en face imaging van het endocardium van de AVC uit te voeren. Het eerste doel was om de celvorm van het endocardium te analyseren tijdens de vorming van de kleppen met een cellulaire resolutie (figuur 1). Om individuele endocardcellen op E9.5 te benadrukken, gebruikten we twee transgene muizenstammen. (1) ROSAmT/mG is een tweekleurig fluorescerend Cre reporter-allel …

Discussion

Het endocardium is een epitheliale monolaag die het gehele binnenoppervlak van de embryonale hartbuis bedekt. Tijdens de ontwikkeling van de klep ondergaan endocardcellen in de prospectieve valvulaire regio’s EMT, dus endocardcellen transformeren en herschikken hun cytoskelet om te delamineren van het endocardium naar de cardiale gelei. Wij en anderen hebben relevante gegevens verkregen over de ontwikkeling van kleppen in muizenembryo’s door transversale secties van E8.5 en E9.5 embryonale harten te analyseren, waarbij h…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door subsidies PID2019-104776RB-I00 en CB16/11/00399 (CIBER CV) van MCIN/AEI/10.13039/501100011033 aan J. L. P. J.G.-B. werd gefinancierd door Programa de Atracción de Talento uit Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. werd gefinancierd door Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). We danken de CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, medegefinancierd door MCIN/AEI /10.13039/501100011033 en FEDER “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). We bedanken ook A. Galicia en L. Méndez voor het houden van muizen. De kosten van deze publicatie werden gedeeltelijk ondersteund door middelen van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling. De CNIC wordt ondersteund door de ISCIII, de MCIN en de Pro CNIC Foundation en is een Severo Ochoa Center of Excellence (subsidie CEX2020-001041-S) gefinancierd door MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Materials

4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
  4. Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
  5. Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
  6. Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
  7. Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
  8. Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
  9. MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
  10. de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
  11. Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
  12. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
  13. Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
  14. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
  15. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
  16. Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
  17. Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
  18. Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
  19. Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
  20. Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
  21. Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
  22. Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
  23. Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
  24. Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
  25. Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
  26. Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
  27. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  28. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  29. Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
  30. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  31. Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
  32. Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
  33. Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
  34. Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
  35. Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).

Play Video

Cite This Article
Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

View Video