Summary

פנים אל פנים הכנה לכרית אנדוקרדיאלית לניתוח מורפוגנזה מישורית בעוברי עכברים

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

באופן קלאסי, האנדוקרדיום של פרימורדיום המסתם העוברי של העכבר נותח באמצעות חתכים רוחביים, קורונליים או סגיטליים. הגישה החדשנית שלנו להדמיה דו-ממדית של האנדוקרדיום באזורים וולוולוגניים מאפשרת קוטביות מישורית וניתוח סידור מחדש של התאים של האנדוקרדיום במהלך התפתחות המסתם.

Abstract

חקר המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס התפתחות לב היונקים חיוני לטיפול במחלות לב מולדות אנושיות. התפתחות מסתמי הלב הפרימיטיביים כרוכה במעבר אפיתליאלי למזנכימלי (EMT) של תאים אנדוקרדיאליים מאזורי התעלה האטריובנטריקולרית (AVC) ודרכי היציאה (OFT) של הלב בתגובה לאותות שריר הלב והאנדוקרדיאליים האינדוקטיביים המקומיים. ברגע שהתאים מתפרקים ופולשים למטריצה החוץ-תאית (ג’לי לבבי) הממוקמת בין האנדוקרדיום לשריר הלב, נוצרות כריות אנדוקרדיאליות פרימיטיביות (EC). תהליך זה מרמז על כך שהאנדוקרדיום צריך למלא את הפערים שהותירו התאים הדה-לאומיים ועליו לארגן את עצמו מחדש כדי להתכנס (להצטמצם) או להתארך (להאריך) לאורך ציר. המחקר הנוכחי עירב את מסלול קוטביות התאים המישוריים (PCP) בוויסות הלוקליזציה התת-תאית של הגורמים המעורבים בתהליך זה. באופן קלאסי, השלבים הראשונים של התפתחות מסתמי הלב נחקרו בחתכים של לבבות עובריים או בצמחי ex vivo AVC או OFT שגודלו בתרבית על ג’ל קולגן. גישות אלה מאפשרות ניתוח של קוטביות אפיקו-בסיסית, אך אינן מאפשרות ניתוח של התנהגות התא בתוך מישור האפיתל או של השינויים המורפולוגיים של תאים נודדים. כאן, אנו מראים גישה ניסיונית המאפשרת הדמיה של אנדוקרדיום באזורים valvulogenic כשדה מישורי של תאים. גישה ניסיונית זו מספקת את ההזדמנות לחקור PCP, טופולוגיה מישורית ותקשורת בין-תאית בתוך אנדוקרדיום של OFT ו- AVC במהלך פיתוח שסתום. פענוח מנגנונים תאיים חדשים המעורבים במורפוגנזה של מסתמי הלב עשוי לתרום להבנת מחלות לב מולדות הקשורות למומים בכרית הלב האנדוקרדיאלית.

Introduction

הלב הוא האיבר הפונקציונלי הראשון של עובר יונקים. בסביבות היום העוברי (E) 7.5 בעכברים, תאי מזודרם קדם-לבביים דו-צדדיים יוצרים את הסהר הלבבי בצד הגחוני1. הסהר הלבבי מכיל שתי אוכלוסיות של תאים קדם-לבביים הכוללים אבות של שריר הלב והאנדוקרדיום2. בסביבות E8.0, מבשרי הלב מתמזגים בקו האמצע, ויוצרים את צינור הלב הפרימיטיבי המורכב משתי רקמות אפיתל, שריר הלב החיצוני והאנדוקרדיום הפנימי, שהוא אנדותל מיוחד המופרד על ידי מטריצה חוץ-תאית בשם ג’לי לב. מאוחר יותר, ב- E8.5, צינור הלב עובר לולאה ימינה. ללב הלולאה יש אזורים אנטומיים שונים עם חתימות מולקולריות ספציפיות כגון מערכת הזרימה (OFT), החדרים והתעלה האטריו-חדרית (AVC)3. למרות שבתחילה צינור הלב מתרחב בצד הזרימה שלו באמצעות תוספת של תאים4, ב- E9.5, התפשטות לב אינטנסיבית גורמת לבלון של החדרים והקמת הרשת הטרבקולרית5. היווצרות המסתם מתרחשת ב- AVC (שסתומים מיטרליים וטריקוספידים עתידיים) וב- OFT (שסתומים אבי העורקים והריאתי העתידיים).

האנדוקרדיום ממלא תפקידים מכריעים בהתפתחות המסתם. תאים אנדוקרדיאליים עוברים מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) ב-AVC וב-OFT כדי ליצור את כריות הלב האנדוקרדיאליות, מבנה המופיע בתחילת התפתחות המסתם. מסלולי איתות שונים מפעילים את התהליך הזה; ב-E9.5 בעכברים, NOTCH המופעל באנדוקרדיום בתגובה ל-BMP2 שמקורו בשריר הלב מקדם EMT פולשני של תאים אנדוקרדיאליים באזורי AVC ו-OFT באמצעות הפעלה של TGFβ2 ו-SNAIL (SNAI1), אשר מדכא ישירות את הביטוי של קדהרין אנדותל וסקולרי (VE-cadherin), מרכיב טרנס-ממברני של צמתים דבקים (AJs)6,7,8 . ב- OFT, הפעלת האנדוקרדיום להפעלת EMT מתווכת על ידי FGF8 ו- BMP4, שהביטוי שלהם מופעל על ידי NOTCH 9,10,11,12.

התקדמות ה-EMT כרוכה בדינמיקה תאית כאשר תאים משנים צורה, שוברים ויוצרים מחדש צמתים עם שכניהם, מתפרקים ומתחילים לנדוד13. שינויים אלה כוללים שיפוץ AJ ופירוק הדרגתישל 14,15, איתות קוטביות תאים מישורית (PCP), אובדן קוטביות אפיקו-בסיסית (ABP), כיווץ אפיקלי וארגון ציטוסקטלי16,17. ABP מתייחס להתפלגות החלבונים לאורך הציר הקדמי-אחורי של התא. בלב המתפתח, ויסות ABP בקרדיומיוציטים נדרש להתפתחות החדר18. PCP מתייחס להתפלגות מקוטבת של חלבונים בתוך תאים על פני מישור הרקמה ומווסת את התפלגות התאים; אפיתליה עם גיאומטריה יציבה מורכבת מתאים בצורת משושה, כאשר רק שלושה תאים מתכנסים בקודקודים 19,20,21,22. תהליכים תאיים שונים, כגון חלוקת תאים, חילופי שכנים או דלמינציה המתרחשת במהלך מורפוגנזה אפיתליאלית, מייצרים עלייה במספר התאים המתכנסים על קודקוד ובמספר התאים השכנים שישלתא נתון 22. התנהגויות תאיות אלה הקשורות ל-PCP ניתנות לוויסות על-ידי מסלולי איתות שונים, דינמיקה של אקטין או סחר תוך-תאי23.

הנתונים שהופקו בחקר התפתחות המסתם בעכברים התקבלו מקטעים רוחביים, קורונליים או סגיטליים של לבבות עובריים E8.5 ו- E9.5, שבהם האנדוקרדיום מוצג כקו של תאים במקום כשדה של תאים – האנדוקרדיום מכסה את כל פני השטח הפנימיים של צינור הלב24. חלקים עובריים אינם מאפשרים ניתוח של PCP באנדוקרדיום של עוברי עכבר. שיטת הניסוי החדשנית שלנו מאפשרת ניתוח של התפלגות תאים אנדוקרדיאליים, אניזוטרופיה של AJ וניתוח צורת תא בודד, כפי שמוצג בתוצאות המייצגות. סוג זה של נתונים נדרש לניתוח PCP, יחד עם תיאור של מולקולות אחרות הקשורות ל- PCP, שאינן מוצגות בדוח זה. אימונופלואורסצנציה שלמה, הכנת דגימה ספציפית ושימוש בעכברים מהונדסים גנטית מאפשרים ניתוח קוטביות מישורית באנדוקרדיום עם תחילת התפתחות המסתם בעכברים.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של המרכז הלאומי לניסויים בבעלי חיים (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ועל ידי קהילת מדריד (ref. PROEX 155.7/20). כל נהלי בעלי החיים תאמו את הנחיית האיחוד האירופי 2010/63EU והמלצה 2007/526/EC בנוגע להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות א?…

Representative Results

הנתונים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מראים כי ניתן לבצע הדמיה פנים אל פנים של אנדוקרדיום של AVC. המטרה הראשונה הייתה לנתח את צורת התא של האנדוקרדיום במהלך היווצרות השסתומים ברזולוציה תאית (איור 1). כדי להדגיש תאים אנדוקרדיאליים בודדים ב-E9.5, השתמשנו בשני זני עכברים מהונדסי…

Discussion

אנדוקרדיום הוא מונולאייר אפיתל המכסה את כל פני השטח הפנימיים של צינור הלב העוברי. במהלך התפתחות המסתם, תאים אנדוקרדיאליים באזורים הוולוולאריים הפרוספקטיביים עוברים EMT, וכך תאים אנדוקרדיאליים הופכים ומסדרים מחדש את השלד הציטוסקולרי שלהם כדי להתפרק מהאנדוקרדיום לכיוון ג’לי הלב. אנו ואחרי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים PID2019-104776RB-I00 ו- CB16/11/00399 (CIBER CV) מ- MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ל- J. L. P. J.G.-B. מומן על ידי Programa de Atracción de Talento מקומונידד דה מדריד (2020-5ª/BMD-19729). ט.ג.-ג. מומן על ידי Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). אנו מודים ליחידת CNIC של מיקרוסקופיה והדמיה דינמית, CNIC, ICTS-ReDib, במימון משותף של MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ו- FEDER “דרך להפוך את אירופה” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). אנו מודים גם לא’ גליציה ול’ מנדס על גידול העכברים. עלות פרסום זה נתמכה בחלקה על ידי כספים מהקרן האירופית לפיתוח אזורי. ה- CNIC נתמך על ידי ISCIII, MCIN וקרן Pro CNIC והוא מרכז מצוינות של Severo Ochoa (מענק CEX2020-001041-S) במימון MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

Materials

4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
  4. Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
  5. Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
  6. Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
  7. Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
  8. Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
  9. MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
  10. de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
  11. Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
  12. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
  13. Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
  14. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
  15. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
  16. Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
  17. Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
  18. Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
  19. Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
  20. Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
  21. Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
  22. Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
  23. Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
  24. Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
  25. Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
  26. Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
  27. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  28. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  29. Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
  30. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  31. Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
  32. Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
  33. Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
  34. Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
  35. Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).

Play Video

Cite This Article
Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

View Video