Summary

En Face Preparazione del cuscino endocardico per l'analisi della morfogenesi planare negli embrioni di topo

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

Classicamente, l’endocardio del primordium della valvola embrionale di topo è stato analizzato utilizzando sezioni trasversali, coronali o sagittali. Il nostro nuovo approccio per l’imaging bidimensionale dell’endocardio nelle regioni valvulogeniche consente l’analisi della polarità planare e del riarrangiamento cellulare dell’endocardio durante lo sviluppo della valvola.

Abstract

Lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo del cuore dei mammiferi è essenziale per affrontare la cardiopatia congenita umana. Lo sviluppo delle valvole cardiache primitive comporta la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) delle cellule endocardiche dalle regioni del canale atrioventricolare (AVC) e del tratto di efflusso (OFT) del cuore in risposta a segnali miocardici ed endocardici induttivi locali. Una volta che le cellule si delaminatono e invadono la matrice extracellulare (gelatina cardiaca) situata tra l’endocardio e il miocardio, si formano i cuscinetti endocardici primitivi (EC). Questo processo implica che l’endocardio deve riempire gli spazi vuoti lasciati dalle cellule delaminate e deve riorganizzarsi per convergere (stretto) o estendersi (allungarsi) lungo un asse. La ricerca attuale ha implicato il percorso di polarità cellulare planare (PCP) nella regolazione della localizzazione subcellulare dei fattori coinvolti in questo processo. Classicamente, le fasi iniziali dello sviluppo valvolare cardiaco sono state studiate in sezioni trasversali di cuori embrionali o in espianti ex vivo AVC o OFT coltivati su gel di collagene. Questi approcci permettono l’analisi della polarità apico-basale ma non permettono l’analisi del comportamento cellulare all’interno del piano dell’epitelio o dei cambiamenti morfologici delle cellule migranti. Qui, mostriamo un approccio sperimentale che consente la visualizzazione dell’endocardio nelle regioni valvulogeniche come un campo planare di cellule. Questo approccio sperimentale offre l’opportunità di studiare PCP, topologia planare e comunicazione intercellulare all’interno dell’endocardio dell’OFT e dell’AVC durante lo sviluppo della valvola. Decifrare nuovi meccanismi cellulari coinvolti nella morfogenesi delle valvole cardiache può contribuire alla comprensione della cardiopatia congenita associata a difetti del cuscino endocardico.

Introduction

Il cuore è il primo organo funzionale di un embrione di mammifero. Intorno al giorno embrionale (E) 7,5 nei topi, le cellule bilaterali del mesoderma precardiaco formano la mezzaluna cardiaca nel lato ventrale1. La mezzaluna cardiaca contiene due popolazioni di cellule precardiache che includono progenitori del miocardio e dell’endocardio2. Intorno a E8.0, i precursori cardiaci si fondono nella linea mediana, formando il tubo cardiaco primitivo costituito da due tessuti epiteliali, il miocardio esterno e l’endocardio interno, che è un endotelio specializzato separato da una matrice extracellulare chiamata gelatina cardiaca. Successivamente, a E8.5, il tubo cardiaco subisce un ciclo verso destra. Il cuore ad anello ha diverse regioni anatomiche con firme molecolari specifiche come il tratto di efflusso (OFT), i ventricoli e il canale atrio-ventricolare (AVC)3. Sebbene inizialmente il tubo cardiaco si espanda sul suo lato di afflusso attraverso l’aggiunta di cellule4, a E9.5, un’intensa proliferazione cardiaca provoca il palloncino delle camere e la creazione della rete trabecolare5. La formazione valvolare avviene nell’AVC (future valvole mitrale e tricuspide) e nell’OFT (future valvole aortica e polmonare).

L’endocardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della valvola. Le cellule endocardiche subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nell’AVC e nell’OFT per formare i cuscini endocardici, una struttura che appare all’inizio dello sviluppo valvolare. Diverse vie di segnalazione attivano questo processo; a E9.5 nei topi, NOTCH attivato nell’endocardio in risposta al BMP2 derivato dal miocardio promuove l’EMT invasiva delle cellule endocardiche nelle regioni AVC e OFT attraverso l’attivazione di TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), che reprime direttamente l’espressione della caderina endoteliale vascolare (VE-caderina), una componente transmembrana delle giunzioni aderenti (AJ)6,7,8 . Nell’OFT, l’attivazione dell’endocardio per iniziare l’EMT è mediata da FGF8 e BMP4, la cui espressione è attivata da NOTCH 9,10,11,12.

La progressione dell’EMT coinvolge la dinamica cellulare mentre le cellule cambiano forma, rompono e ricreano le giunzioni con i loro vicini, si delaminano e iniziano a migrare13. Questi cambiamenti includono il rimodellamento di AJ e il graduale disassemblaggio 14,15, la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP), la perdita della polarità apico-basale (ABP), la costrizione apicale e l’organizzazione citoscheletrica 16,17. ABP si riferisce alla distribuzione delle proteine lungo l’asse antero-posteriore di una cellula. Nel cuore in via di sviluppo, la regolazione dell’ABP nei cardiomiociti è necessaria per lo sviluppo ventricolare18. PCP si riferisce a una distribuzione polarizzata di proteine all’interno delle cellule attraverso il piano di un tessuto e regola la distribuzione cellulare; Gli epiteli con una geometria stabile sono costituiti da cellule di forma esagonale, dove solo tre celle convergono ai vertici 19,20,21,22. Diversi processi cellulari, come la divisione cellulare, lo scambio di vicini o la delaminazione che si verificano durante la morfogenesi epiteliale, producono un aumento del numero di cellule che convergono su un vertice e il numero di cellule vicine che una data cellula ha22. Questi comportamenti cellulari correlati alla PCP possono essere regolati da diverse vie di segnalazione, dinamica dell’actina o traffico intracellulare23.

I dati generati studiando lo sviluppo valvolare nei topi sono stati ottenuti da sezioni trasversali, coronali o sagittali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l’endocardio è mostrato come una linea di cellule anziché come un campo di cellule: l’endocardio copre l’intera superficie interna del tubo cardiaco24. Le sezioni embrionali non consentono l’analisi del PCP nell’endocardio degli embrioni di topo. Il nostro nuovo metodo sperimentale consente l’analisi della distribuzione delle cellule endocardiche, dell’anisotropia AJ e dell’analisi della forma a singola cellula, come mostrato nei risultati rappresentativi. Questo tipo di dati è necessario per l’analisi del PCP, insieme alla descrizione di altre molecole correlate al PCP, non mostrate in questo rapporto. L’immunofluorescenza a montaggio intero, la preparazione di campioni specifici e l’uso di topi geneticamente modificati consentono l’analisi della polarità planare nell’endocardio all’inizio dello sviluppo valvolare nei topi.

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) e dalla Comunità di Madrid (rif. PROEX 155.7/20). Tutte le procedure animali sono conformi alla direttiva UE 2010/63UE e alla raccomandazione 2007/526/CE relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici, emanata dalla legge spagnola con Real Decreto 1201/2005. 1. Ottenimento di AVC e…

Representative Results

I dati generati utilizzando questo protocollo mostrano che è possibile eseguire l’imaging en face dell’endocardio dell’AVC. Il primo obiettivo era quello di analizzare la forma cellulare dell’endocardio durante la formazione delle valvole ad una risoluzione cellulare (Figura 1). Al fine di evidenziare le singole cellule endocardiche a E9.5, abbiamo utilizzato due ceppi di topo transgenici. (1) ROSA mT/mG è un allele reporter Cre fluorescente a due colori (tdTomato/mT e <e…

Discussion

L’endocardio è un monostrato epiteliale che copre l’intera superficie interna del tubo cardiaco embrionale. Durante lo sviluppo valvolare, le cellule endocardiche nelle regioni valvolari prospettiche subiscono EMT, quindi le cellule endocardiche trasformano e riorganizzano il loro citoscheletro per delaminarsi dall’endocardio verso la gelatina cardiaca. Noi e altri abbiamo ottenuto dati rilevanti sullo sviluppo valvolare in embrioni di topo analizzando sezioni trasversali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l’endocar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 a J. L. P. J.G.-B. è stato finanziato dal Programa de Atracción de Talento della Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. è stato finanziato da Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Si ringraziano l’Unità CNIC di Microscopia e Imaging Dinamico, CNIC, ICTS-ReDib, co-finanziata da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FESR “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Ringraziamo anche A. Galicia e L. Méndez per l’allevamento dei topi. Il costo di questa pubblicazione è stato in parte sostenuto da fondi del Fondo europeo di sviluppo regionale. Il CNIC è sostenuto dall’ISCIII, dal MCIN e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Centro di Eccellenza Severo Ochoa (sovvenzione CEX2020-001041-S) finanziato da MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Materials

4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

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Cite This Article
Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

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