Summary
Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.
Abstract
O estudo dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento do coração de mamíferos é essencial para tratar a doença cardíaca congênita humana. O desenvolvimento das valvas cardíacas primitivas envolve a transição epitelial-mesenquimal (EMT) de células endocárdicas das regiões do canal atrioventricular (CVA) e da via de saída (OFT) do coração em resposta a sinais miocárdicos e endocárdicos indutivos locais. Uma vez que as células se delaminam e invadem a matriz extracelular (geleia cardíaca) localizada entre o endocárdio e o miocárdio, formam-se as almofadas endocárdicas primitivas (CE). Este processo implica que o endocárdio tem que preencher as lacunas deixadas pelas células delaminadas e tem que se reorganizar para convergir (estreitar) ou estender (alongar) ao longo de um eixo. Pesquisas atuais implicaram a via da polaridade das células planares (PCP) na regulação da localização subcelular dos fatores envolvidos nesse processo. Classicamente, as fases iniciais do desenvolvimento da valva cardíaca têm sido estudadas em cortes transversais de corações embrionários ou em explantes ex vivo de AVC ou OFT cultivados em géis de colágeno. Essas abordagens permitem a análise da polaridade apico-basal, mas não permitem a análise do comportamento celular dentro do plano do epitélio ou das alterações morfológicas das células migratórias. Aqui, mostramos uma abordagem experimental que permite a visualização do endocárdio em regiões valvulogênicas como um campo planar de células. Esta abordagem experimental oferece a oportunidade de estudar PCP, topologia planar e comunicação intercelular dentro do endocárdio do OFT e AVC durante o desenvolvimento da válvula. Decifrar novos mecanismos celulares envolvidos na morfogênese valvar cardíaca pode contribuir para a compreensão da cardiopatia congênita associada a defeitos da almofada endocárdica.
Introduction
O coração é o primeiro órgão funcional de um embrião de mamíferos. Por volta do dia embrionário (E) 7,5 em camundongos, células mesodérmicas pré-cardíacas bilaterais formam o crescente cardíaco no lado ventral1. O crescente cardíaco contém duas populações de células pré-cardíacas que incluem progenitores do miocárdio e do endocárdio2. Por volta de E8.0, os precursores cardíacos se fundem na linha média, formando o tubo cardíaco primitivo composto por dois tecidos epiteliais, o miocárdio externo e o endocárdio interno, que é um endotélio especializado separado por uma matriz extracelular chamada geleia cardíaca. Mais tarde, em E8.5, o tubo cardíaco sofre looping para a direita. O coração em alça possui diferentes regiões anatômicas com assinaturas moleculares específicas, como a via de saída (OFT), os ventrículos e o canal atrioventricular (AVC)3. Embora inicialmente o tubo cardíaco se expanda em seu lado de entrada através da adição de células4, em E9,5, a proliferação cardíaca intensiva resulta em balonamento das câmaras e estabelecimento da rede trabecular5. A formação valvar ocorre no AVC (futuras valvas mitral e tricúspide) e no OFT (futuras valvas aórtica e pulmonar).
O endocárdio desempenha papéis cruciais no desenvolvimento da válvula. As células endocárdicas sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT) no AVC e no OFT para formar as almofadas endocárdicas, uma estrutura que aparece no início do desenvolvimento valvar. Diferentes vias de sinalização ativam esse processo; em E9.5 em camundongos, o NOTCH ativado no endocárdio em resposta à BMP2 derivada do miocárdio promove EMT invasiva de células endocárdicas nas regiões AVC e OFT por meio da ativação de TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), que reprime diretamente a expressão da caderina endotelial vascular (VE-caderina), um componente transmembrana das junções aderentes (AJs)6,7,8 . No OFT, a ativação do endocárdio para iniciar a EMT é mediada pelo FGF8 e BMP4, cuja expressão é ativada pelo NOTCH 9,10,11,12.
A progressão da EMT envolve a dinâmica celular à medida que as células mudam de forma, quebram e refazem junções com seus vizinhos, delaminam e começam a migrar13. Essas alterações incluem remodelamento e desmontagem gradual de AJ 14,15, sinalização de polaridade celular planar (PCP), perda de polaridade ápico-basal (PAB), constrição apical e organização citoesquelética 16,17. ABP refere-se à distribuição de proteínas ao longo do eixo anteroposterior de uma célula. No coração em desenvolvimento, a regulação da PA em cardiomiócitos é necessária para o desenvolvimento ventricular18. PCP refere-se a uma distribuição polarizada de proteínas dentro das células através do plano de um tecido e regula a distribuição celular; epitélios com geometria estável são constituídos por células em forma de hexágono, onde apenas três células convergem nos vértices 19,20,21,22. Diferentes processos celulares, como divisão celular, troca de vizinhos ou delaminação que ocorrem durante a morfogênese epitelial, produzem um aumento no número de células que convergem para um vértice e no número de células vizinhas que uma determinada célula tem22. Esses comportamentos celulares relacionados à PCP podem ser regulados por diferentes vias de sinalização, dinâmica da actina ou tráfico intracelular23.
Os dados gerados que estudam o desenvolvimento valvar em camundongos foram obtidos de cortes transversais, coronais ou sagitais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endocárdio é mostrado como uma linha de células em vez de como um campo de células - o endocárdio cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco24. Cortes embrionários não permitem a análise de PCP no endocárdio de embriões de camundongos. Nosso novo método experimental permite a análise da distribuição de células endocárdicas, anisotropia AJ e análise da forma de célula única, como mostrado nos resultados representativos. Este tipo de dados é necessário para a análise de PCP, juntamente com a descrição de outras moléculas relacionadas com PCP, não mostradas neste relatório. A imunofluorescência total, o preparo específico de amostras e o uso de camundongos geneticamente modificados permitem a análise de polaridade planar no endocárdio no início do desenvolvimento valvar em camundongos.
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Protocol
Os estudos em animais foram aprovados pelo Comité de Ética em Experimentação Animal do Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) e pela Comunidade de Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Todos os procedimentos relativos aos animais estavam em conformidade com a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos, promulgados na legislação espanhola ao abrigo do Real Decreto 1201/2005.
1. Obtenção de AVC e/ou OFTs (adaptado de Xiao et al. 25)
- Configure cruzamentos à tarde entre mTmG feminino e VE-Cadherin-Cre-ERT/+ masculino.
- Na manhã seguinte, verifique se há um plugue vaginal. Se houver um tampão vaginal, conte-o como meio dia (E0.5). Dependendo do experimento de interesse, conte 8 dias ou 9 dias.
- 24 h antes da dissecção, gavagar a fêmea grávida por via oral com 50 μL de 5 mg/mL de 4-OH-Tamoxifeno diluído em óleo de milho.
NOTA: Esta dose induzirá uma quantidade limitada de recombinação mediada por CRE revelada pela presença de clones GFP-positivos. A dose adequada terá de ser determinada com cada novo lote de 4-OH-Tamoxifeno. - Sacrificar a fêmea grávida em E8.5 ou E9.5 por luxação cervical.
- Abra o abdômen das ratas grávidas usando uma tesoura e remova o útero que contém os embriões usando tesouras e pinças finas.
- Coloque o útero em uma placa de Petri contendo solução salina gelada 1x tamponada com fosfato (PBS) com Tween-20 (PBT) a 0,1%.
- Remova as decíduas individuais do útero sob um microscópio de dissecação e usando pinça fina.
- Usando pinças finas, faça uma incisão na parte branca da decídua, que é onde o embrião está, remova-o suavemente, evitando puxar, e transfira os embriões para uma nova placa de Petri com PBT fresco usando um P1000 com a ponta cortada, deixando um diâmetro grande o suficiente para um embrião passar sem quebrar.
- Para genotipagem, pegue um pequeno pedaço do saco vitelino (0,5 mm2) ou um pedaço da cauda (da extremidade posterior, contando 5 a 10 somitos em direção à cabeça) e diga-o em 100 μL de tampão apropriado.
- Sob o exaustor, transfira os embriões para paraformaldeído gelado a 4% (4% de PFA) em PBS filtrado estéril em um tubo de microcentrífuga (2 mL) a 4 °C. Fixar os embriões de 2 h durante a noite (O/N) a 4 °C num nutador.
- Sob o exaustor, remova o fixador de PFA a 4% dos tubos de microcentrífuga sem tocar nos embriões. Rejeitar o PFA num recipiente adequado.
- Lave os embriões 5x em PBT frio por 10 min cada um à temperatura ambiente (RT).
- Usando pinça fina, remova o coração e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com PBT fresco.
2. Imunofluorescência de montagem inteira do coração embrionário do rato
- Substitua o PBT por PBSTr (0,4% Triton X-100 em PBS) e lave as amostras 3x, 5 min cada, no RT em um agitador orbital.
- Substitua o PBSTr por solução de bloqueio (PBSTr por soro bovino inativado pelo calor a 10%). Incubar de 2 h a O/N a 4 °C num agitador orbital.
- Substitua a solução de bloqueio por uma solução de bloqueio contendo anticorpos primários na concentração desejada (para anticorpo anti-GFP ou anti-VE-Caderina, use diluição 1:1000). Incubar O/N num agitador orbital a 4 °C.
- Após incubação O/N a 4 °C, incubar durante 1,5 h a RT num agitador orbital. Este passo é muito importante para aumentar a relação sinal-ruído.
- Remover e manter a 4 °C a solução primária de anticorpos para até três experiências futuras (adicionar azida de sódio a uma concentração final de 0,02% para uma melhor conservação).
- Lave os embriões 3x com PBSTr por 3 min cada.
- Lavar os embriões com PBSTr 3x durante 30 min cada um num agitador orbital a 4 °C.
- Após a última lavagem, adicionar 1 mL de solução bloqueadora contendo 1:1000 anticorpos secundários conjugados com fluorescência contra a espécie hospedeira de anticorpos primários. Adicionar também 1:3000 DAPI à solução e incubar os embriões O/N num agitador orbital a 4 °C.
- Após incubação O/N a 4 °C, incubar durante 1,5 h a RT num agitador orbital. Este passo é muito importante para aumentar a relação sinal-ruído.
- Lave os embriões 3x com PBSTr por 3 min cada.
- Lave os embriões com PBSTr 3x-5x por 30 min cada em um agitador orbital no RT.
3. Montagem do AVC embrionário do rato ou OFTs
- Coloque os corações em uma placa de Petri (35 mm) contendo PBS.
- Usando um fio de tungstênio e uma pinça fina, isole o AVC ou o OFT e corte-os longitudinalmente26.
- Prepare folhas de cobertura (22 mm x 22 mm), corrediças (60 mm x 24 mm), pinças, uma pipeta P200 com as pontas apropriadas, papel toalha e qualquer meio de montagem aquoso à base de glicerol para fluorescência, sem DAPI.
- Usando uma abordagem semelhante à de Xiao, C. et al.25, colem duas tiras de fita adesiva em uma lâmina, separadas por 0,3-0,6 cm, a fim de criar um espaço de sala 3D que permitirá que as amostras conservem sua forma original sem esmagá-las.
- Cuidadosamente, e usando o volume mínimo de buffer, solte as amostras no slide entre as listras de fita usando uma pipeta de ponta P200 cortada. Use um microscópio de dissecação para aumentar a precisão.
- Usando pinça fina, coloque as amostras com o endocárdio voltado para cima (miocárdio para baixo na lâmina).
- Remova o excesso de PBS com uma toalha de papel (evite tocar na amostra) e, em seguida, seque as amostras por 1-2 min no RT para fazer com que as amostras grudem na lâmina.
- Adicionar 40 μL de meio de montagem aquoso no tecido.
- Coloque a tampa sobre os dois pedaços de fita adesiva e abaixe-a lentamente sobre o tecido com uma agulha ou pinça. Evite criar bolhas de ar.
- Sele a tampa usando uma gota de esmalte em cada vértice da tampa.
- Uma vez que o esmalte esteja seco, limpe o meio de montagem em excesso das laterais da tampa usando uma toalha de papel absorvente. Evite mover a tampa.
- Adicione esmalte ao longo das bordas da tampa para selá-lo completamente, evitando a evaporação do meio de montagem.
- Usando um microscópio confocal vertical ou invertido, tire imagens a 10x para visualização geral e a 63x com zoom de 3x para imagens detalhadas.
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Representative Results
Os dados gerados por meio desse protocolo mostram que é possível realizar imagens de face do endocárdio da AVC. O primeiro objetivo foi analisar a forma celular do endocárdio durante a formação das valvas em resolução celular (Figura 1). Para destacar as células endocárdicas individuais em E9.5, foram utilizadas duas cepas transgênicas de camundongos. (1) ROSAmT/mG é um alelo repórter Cre fluorescente de duas cores (tdTomato/mT e EGFP/mG) cuja fluorescência é detectada na membrana celular. Sem ativação mediada por Cre, o transgene expressa tdTomato (mT). Após a ativação mediada por Cre, a expressão de tdTomato é substituída pela expressão de fluorescência de EGFP (mG) em células específicas e derivados clonais27. (2) A linhagem de camundongos Cdh5CreERT2/+ expressa CRE-recombinase induzível por tamoxifeno (CreERT2) sob a regulação do promotor de caderina endotelial vascular (Cdh5), que é expresso no endotélio vascular e no endocárdio nos estágios embrionários28. Cruzamos um macho e uma fêmea de cada genótipo para obter embriões portadores dos dois transgenes, a fim de ativar a expressão de GFP em células individuais do endocárdio. Para conseguir isso, inoculamos baixas doses de tamoxifeno para ativar a expressão de CRE em um número reduzido de células. Como resultado, células únicas, ou clones de poucas células, expressaram GFP no endocárdio (Figura 1A). A expressão de GFP (Figura 1A,B) em combinação com a localização subcelular VE-Cadherin (Figura 1C) é uma abordagem eficaz para estudar a relação entre a dinâmica de AJ e a formação de filópodes em células pré-EMT, uma vez que essas células desenvolvem saliências de membrana à medida que os AJs se dissolvem29. Os sinais de PCP podem conferir contratilidade anisotrópica aos AJs, produzindo forças celulares que promovem morfogênese polarizada no epitélio30. Encontramos diferenças na intensidade da coloração VE-Caderina no endocárdio (Figura 2), indicando que não podemos descartar a contratilidade anisotrópica no endocárdio embrionário da CVA nos estádios pré-valvares.
O segundo objetivo foi analisar a topologia planar do endocárdio durante o desenvolvimento valvar (Figura 2). Para definir o número de células convergindo em um único vértice, coramos todo o coração com o anticorpo VE-Caderreina em E8.5 e E9.5 (Figura 2A,B). Outras moléculas localizadas nos contatos célula-célula da célula endocárdica também seriam úteis para esse fim (por exemplo, β-Catenina). Em E8.5, o endocárdio da CVA tende a ter uma organização epitelial estável, e não foi possível detectar vértices formados por mais de quatro células (Figura 2A,C). Posteriormente, em E9.5, encontramos vértices constituídos por até seis células formando estruturas semelhantes a rosetas (Figura 2B,D), semelhantes à organização celular descrita anteriormente em epitélios submetidos a rearranjos celulares ativos31, sugerindo que o endocárdio AVC está passando por rearranjo celular ativo durante o desenvolvimento valvar.
Figura 1: Análise da forma unicelular no endocárdio pré-valvar. (A) AVC de embrião de camundongo E9.5 aberto longitudinalmente mostrando células GFP positivas dispersas. (B) A expressão de GFP em células únicas define a forma da célula na resolução celular. (C) Coloração de montagem inteira de VE-Cadherin destaca AJs. Os filópodes são gerados em domínios da célula que não localizam VE-Caderina (setas roxas), e vice-versa, VE-Caderina localiza-se em domínios da célula que são lisos e não formam filópodes (pontas de seta azuis). v, ventral; d, dorsal. A barra de escala em A é de 100 μm; em B e C é de 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A topologia planar e a anisotropia de proteínas planarmente localizadas podem ser definidas em imagens en face de endocárdio no canal AV. A VE-Caderrina localiza-se nos contactos célula-célula do endocárdio. (A) E8.5 e (B) E9.5 AVC de embriões foram abertos longitudinalmente. Ampliações em (C) e (D) nos permitiram observar o número de células que convergem em um vértice. Além disso, podemos distinguir diferentes intensidades na coloração VE-Caderrein, indicando que sua localização na CVA é anisotrópica. A barra de escala em A e B é de 100 μm; em C e D é de 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O endocárdio é uma monocamada epitelial que cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco embrionário. Durante o desenvolvimento valvar, as células endocárdicas nas regiões valvares prospectivas sofrem EMT, assim, as células endocárdicas se transformam e reorganizam seu citoesqueleto para delaminar do endocárdio em direção à geleia cardíaca. Nós e outros obtivemos dados relevantes sobre o desenvolvimento valvar em embriões de camundongos analisando cortes transversais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endocárdio é mostrado como uma fileira de células 6,8,24,32. Essa abordagem permitiu a análise da expressão das vias de sinalização e de outras moléculas envolvidas no desenvolvimento valvar, mas não foi possível analisar aspectos espaciais do endocárdio pré-valvar.
Explantes AVC ou OFT foram usados principalmente para estudar a transformação de CE em um gel de colágeno 3D. Explantes são úteis para quantificação de EMT, análise da capacidade de transformação ou teste de fármacos após poucos dias em cultura 6,7,11,33. Esses experimentos ex vivo também permitem a expansão do endocárdio em cima do gel de colágeno como uma monocamada, mas as condições ambientais em que os explantes cardíacos ex vivo são cultivados diferem das condições do útero. Por exemplo, o fluxo sanguíneo unidirecional é essencial para o desenvolvimento adequado da valva34,35 e só é alcançado em explantes in utero, e não ex vivo.
Esta nova abordagem permite-nos observar o endocárdio valvar intacto na face durante o início do desenvolvimento valvar sem qualquer manipulação ambiental. Permite a análise da distribuição celular do endocárdio valvar, bem como a análise da forma de célula única antes e durante a EMT em condições no útero . Também podemos observar e analisar a intensidade e a organização dos contatos célula-célula e a distribuição subcelular de moléculas relevantes durante a EMT. Esta técnica também oferece a possibilidade de analisar as estruturas subcelulares do endocárdio, a ativação de vias de sinalização usando genes repórteres, o efeito que a inativação do gene pode ter sobre o comportamento celular e como isso pode afetar as células vizinhas do tipo selvagem.
Para obter amostras de alta qualidade, é importante ter muito cuidado ao manuseá-las, uma vez que as impurezas (por exemplo, microfibras) que aderem ao tecido podem resultar em artefatos durante a captura de imagens. Além disso, como são amostras muito pequenas, o risco de quebra é alto, por isso deve-se lavar o tecido (passo 1. e passo 2.) em agitadores lentos. Durante a troca de meios com pipetas, recomendamos cortar a ponta para evitar que o tecido entre em colapso à medida que passa pela ponta no caso de ser absorvido acidentalmente. Para se tornar um especialista nesta técnica, é necessária uma curva de aprendizado, que será mais longa ou mais curta, dependendo da experiência anterior do pesquisador em micromanipulação.
A escolha do fixador certo e o tempo de fixação podem ser importantes no caso do uso de transgenes que expressam proteínas fluorescentes. A estrutura anatômica não é afetada por diferentes fixadores, como etanol 70%, metanol, PFA 4% ou formalina 10%.
Para a contracoloração de núcleos, recomendamos a incubação de amostras com DAPI porque a penetração é muito mais eficiente do que o uso de meios de montagem com DAPI.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelas bolsas PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 para J. L. P. J.G.-B. foi financiado pelo Programa de Atracción de Talento da Comunidade de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. foi financiado pela Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos à Unidade CNIC de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciada pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Agradecemos também a A. Galicia e L. Méndez pela criação de ratos. O custo desta publicação foi parcialmente suportado por fundos do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional. O CNIC é apoiado pelo ISCIII, pelo MCIN e pela Fundação Pro CNIC e é um Centro de Excelência Severo Ochoa (bolsa CEX2020-001041-S) financiado pelo MCIN/AEI /10.13039/501100011033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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