En Лицо Подготовка эндокардиальной подушки к анализу планарного морфогенеза у эмбрионов мышей
Summary
Классически эндокард примордия эмбрионального клапана мыши был проанализирован с использованием поперечного, коронального или сагиттального сечений. Наш новый подход к двумерной визуализации эндокарда в вальвулогенных областях позволяет проводить анализ плоской полярности и клеточной перестройки эндокарда во время развития клапана.
Abstract
Изучение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе развития сердца млекопитающих, имеет важное значение для лечения врожденных пороков сердца человека. Развитие примитивных сердечных клапанов включает эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМТ) клеток эндокарда из атриовентрикулярного канала (АВК) и оттоковых путей (ОФТ) сердца в ответ на местные индуктивные сигналы миокарда и эндокарда. Как только клетки расслаиваются и вторгаются во внеклеточный матрикс (сердечный желе), расположенный между эндокардом и миокардом, образуются примитивные эндокардиальные подушки (ЭК). Этот процесс подразумевает, что эндокард должен заполнить пробелы, оставленные расслоенными клетками, и должен реорганизоваться, чтобы сойтись (сузить) или расширить (удлинить) вдоль оси. Текущие исследования показали, что путь полярности плоских клеток (PCP) регулирует субклеточную локализацию факторов, участвующих в этом процессе. Классически, начальные фазы развития сердечного клапана были изучены в поперечных сечениях эмбриональных сердец или эксплантатов in vivo AVC или OFT, культивируемых на коллагеновых гелях. Эти подходы позволяют анализировать апико-базальную полярность, но не позволяют анализировать поведение клеток в плоскости эпителия или морфологические изменения мигрирующих клеток. Здесь мы показываем экспериментальный подход, позволяющий визуализировать эндокард в вальвулогенных областях как плоское поле клеток. Такой экспериментальный подход дает возможность изучать ПЦП, планарную топологию и межклеточную связь в эндокарде OFT и AVC при разработке клапана. Расшифровка новых клеточных механизмов, участвующих в морфогенезе сердечного клапана, может способствовать пониманию врожденных пороков сердца, связанных с дефектами эндокардиальной подушки.
Introduction
Сердце является первым функциональным органом эмбриона млекопитающего. Около эмбрионального дня (E) 7,5 у мышей двусторонние клетки прекардиальной мезодермы образуют сердечный полумесяц в вентральной стороне1. Сердечный полумесяц содержит две популяции прекардиальных клеток, которые включают предшественников миокарда и эндокарда2. Около E8.0 сердечные предшественники сливаются в средней линии, образуя примитивную сердечную трубку, состоящую из двух эпителиальных тканей, наружного миокарда и внутреннего эндокарда, который представляет собой специализированный эндотелий, разделенный внеклеточным матриксом, называемым сердечным желе. Позже, при E8.5, сердечная трубка подвергается правой петле. Петлевое сердце имеет различные анатомические области со специфическими молекулярными сигнатурами, такими как отток (OFT), желудочки и атрио-желудочковый канал (AVC)3. Хотя первоначально сердечная трубка расширяется на стороне притока за счет добавления клеток4, при E9.5 интенсивная пролиферация сердца приводит к раздуванию камер и созданию трабекулярной сети5. Образование клапанов происходит в АВК (будущие митральные и трикуспидальные клапаны) и в ОФТ (будущие аортальные и легочные клапаны).
Эндокард играет решающую роль в развитии клапанов. Клетки эндокарда подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМТ) в АВК и ОФТ с образованием эндокардиальных подушек, структуры, которая появляется в начале развития клапана. Различные сигнальные пути активируют этот процесс; при E9.5 у мышей NOTCH активируется в эндокарде в ответ на BMP2, полученный из миокарда, способствует инвазивной ЭМТ эндокардиальных клеток в областях AVC и OFT посредством активации TGFβ2 и SNAIL (SNAI1), что непосредственно подавляет экспрессию сосудистого эндотелиального кадгерина (VE-кадгерина), трансмембранного компонента адгезивных переходов (AJs)6,7,8 . В OFT активация эндокарда для инициирования EMT опосредована FGF8 и BMP4, экспрессия которых активируется NOTCH 9,10,11,12.
Прогрессирование ЭМТ включает в себя клеточную динамику, поскольку клетки меняют форму, ломают и переделывают соединения со своими соседями, расслаиваются и начинают мигрировать13. Эти изменения включают ремоделирование AJ и постепенную разборку 14,15, передачу сигналов полярности плоских клеток (PCP), потерю апико-базальной полярности (ABP), апикальное сужение и цитоскелетную организацию 16,17. ABP относится к распределению белков вдоль передне-задней оси клетки. В развивающемся сердце регуляция АБП в кардиомиоцитах необходима для развития желудочков18. PCP относится к поляризованному распределению белков внутри клеток по всей плоскости ткани и регулирует клеточное распределение; эпителии со стабильной геометрией состоят из шестиугольных клеток, где только три клетки сходятся в вершинах 19,20,21,22. Различные клеточные процессы, такие как деление клеток, обмен соседей или расслоение, происходящие во время эпителиального морфогенеза, приводят к увеличению числа клеток, которые сходятся на вершине, и количества соседних клеток, которые данная клетка имеет22. Это клеточное поведение, связанное с PCP, может регулироваться различными сигнальными путями, динамикой актина или внутриклеточным трафиком23.
Полученные данные, изучающие развитие клапанов у мышей, были получены из поперечных, корональных или сагиттальных срезов эмбриональных сердец Е8,5 и Е9,5, где эндокард показан в виде линии клеток, а не как поле клеток — эндокард покрывает всю внутреннюю поверхность сердечной трубки24. Эмбриональные срезы не позволяют проводить анализ ПЦП в эндокарде эмбрионов мышей. Наш новый экспериментальный метод позволяет анализировать распределение клеток эндокарда, анизотропию AJ и анализ формы одной клетки, как показано в репрезентативных результатах. Этот тип данных необходим для анализа PCP вместе с описанием других молекул, связанных с PCP, не показанных в этом отчете. Цельная иммунофлуоресценция, специфическая пробоподготовка и использование генетически модифицированных мышей позволяют проводить планарный анализ полярности в эндокарде в начале развития клапана у мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эндокард представляет собой эпителиальный монослой, который покрывает всю внутреннюю поверхность эмбриональной сердечной трубки. Во время развития клапана клетки эндокарда в перспективных клапанных областях подвергаются ЭМТ, таким образом, клетки эндокарда трансформируются и пере?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами PID2019-104776RB-I00 и CB16/11/00399 (CIBER CV) от MCIN/AEI/10.13039/501100011033 J.L.P.J.G.-B. финансировался Программой развития талантов из Мадридской коммуны (2020-5ª/BMD-19729). Т.Г.-К. финансировался организацией «Аюдас за формирование университетских профессоров» (FPU18/01054). Мы благодарим Отдел микроскопии и динамической визуализации CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, совместно финансируемый MCIN/AEI /10.13039/501100011033 и FEDER «Способ сделать Европу» (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Мы также благодарим А. Галисию и Л. Мендеса за разведение мышей. Стоимость этой публикации была частично поддержана за счет средств Европейского фонда регионального развития. CNIC поддерживается ISCIII, MCIN и Pro CNIC Foundation и является Центром передового опыта Северо Очоа (грант CEX2020-001041-S), финансируемым MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
