Summary
Klasik olarak, fare embriyonik kapak primordiyumunun endokardiyumu transversal, koronal veya sagital kesitler kullanılarak analiz edilmiştir. Valvulojenik bölgelerde endokardın en yüzlü, iki boyutlu görüntülenmesi için yeni yaklaşımımız, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel polarite ve hücre yeniden düzenleme analizine izin verir.
Abstract
Memeli kalbinin gelişiminin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesi, insan konjenital kalp hastalığını ele almak için esastır. İlkel kalp kapakçıklarının gelişimi, lokal endüktif miyokard ve endokardiyal sinyallere yanıt olarak endikonitriyal hücrelerin atriyoventriküler kanal (AVC) ve kalbin çıkış yolu (OFT) bölgelerinden epitel-mezenkimal geçişini (EMT) içerir. Hücreler delaminasyona girdiğinde ve endokard ile miyokard arasında bulunan hücre dışı matriksi (kardiyak jöle) istila ettiğinde, ilkel endokardiyal yastıklar (EC) oluşur. Bu işlem, endokardın delamine edilmiş hücreler tarafından bırakılan boşlukları doldurması ve bir eksen boyunca yakınsamak (daralmak) veya uzatmak (uzatmak) için kendini yeniden organize etmesi gerektiği anlamına gelir. Mevcut araştırmalar, bu süreçte yer alan faktörlerin hücre altı lokalizasyonunu düzenlemede düzlemsel hücre polaritesi (PCP) yolunu etkilemiştir. Klasik olarak, kalp kapağı gelişiminin ilk aşamaları, embriyonik kalplerin kesitlerinde veya kollajen jelleri üzerinde kültürlenmiş ex vivo AVC veya OFT eksplantlarında incelenmiştir. Bu yaklaşımlar apiko-bazal polaritenin analizine izin verir, ancak epitel düzlemindeki hücre davranışının veya göç eden hücrelerin morfolojik değişikliklerinin analizine izin vermez. Burada, valvulojenik bölgelerdeki endokardın hücrelerin düzlemsel bir alanı olarak görselleştirilmesini sağlayan deneysel bir yaklaşım sunuyoruz. Bu deneysel yaklaşım, valf gelişimi sırasında OFT ve AVC'nin endokardiyumunda PCP, düzlemsel topoloji ve hücreler arası iletişimi inceleme fırsatı sunar. Kardiyak kapak morfogenezinde rol oynayan yeni hücresel mekanizmaların deşifre edilmesi, endokardiyal yastık defekti ile ilişkili konjenital kalp hastalığının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Introduction
Kalp, bir memeli embriyosunun ilk fonksiyonel organıdır. Farelerde embriyonik gün (E) 7.5 civarında, bilateral prekardiyak mezoderm hücreleri ventral taraftaki kardiyak hilali oluşturur1. Kardiyak hilal, miyokard ve endokard2'nin progenitörlerini içeren iki prekardiyak hücre popülasyonu içerir. E8.0 civarında, kardiyak öncüller orta hatta kaynaşır ve iki epitel dokusundan, dış miyokarddan ve kardiyak jöle adı verilen hücre dışı bir matrisle ayrılmış özel bir endotel olan iç endokarddan oluşan ilkel kalp tüpünü oluşturur. Daha sonra, E8.5'te, kalp tüpü sağa doğru döngüye girer. Döngülü kalp, çıkış yolu (OFT), ventriküller ve atrio-ventriküler kanal (AVC)3 gibi spesifik moleküler imzalara sahip farklı anatomik bölgelere sahiptir. Başlangıçta kalp tüpü,hücre 4'ün eklenmesiyle giriş tarafında genişlemiş olsa da, E9.5'te, yoğun kardiyak proliferasyon, odaların balonlaşmasına ve trabeküler ağın kurulmasına neden olur5. Kapak oluşumu AVC'de (gelecekteki mitral ve triküspid kapaklar) ve OFT'de (gelecekteki aort ve pulmoner kapaklar) gerçekleşir.
Endokard, kapak gelişiminde çok önemli rol oynar. Endokardiyal hücreler, kapak gelişiminin başlangıcında ortaya çıkan bir yapı olan endokardiyal yastıkları oluşturmak için AVC ve OFT'de epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) uğrar. Farklı sinyal yolları bu süreci aktive eder; farelerde E9.5'te, miyokardiyal kaynaklı BMP2'ye yanıt olarak endokardda aktive edilen NOTCH, TGFβ2 ve salyangozun (SNAI1) aktivasyonu yoluyla AVC ve OFT bölgelerindeki endokardiyal hücrelerin invaziv EMT'sini teşvik eder, bu da aderans kavşaklarının (AJ'ler) bir transmembran bileşeni olan vasküler endotelyal kadherinin (VE-kadherin) ekspresyonunu doğrudan bastırır6,7,8 . OFT'de, EMT'yi başlatmak için endokardın aktivasyonu, ifadesi NOTCH 9,10,11,12 tarafından aktive edilen FGF8 ve BMP4 tarafından aracılık edilir.
EMT'nin ilerlemesi, hücreler şekil değiştirirken, komşularıyla kavşakları kırıp yeniden oluştururken, delaminasyona girerken ve göç etmeye başlarken hücresel dinamikleri içerir13. Bu değişiklikler arasında AJ remodelizasyonu ve kademeli olarak sökülmesi14,15, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalizasyonu, apiko-bazal polarite kaybı (ABP), apikal daralma ve sitoiskelet organizasyonu16,17 bulunmaktadır. ABP, proteinlerin bir hücrenin ön-arka ekseni boyunca dağılımını ifade eder. Gelişmekte olan kalpte, ventrikül gelişimi için kardiyomiyositlerde ABP regülasyonu gereklidir18. PCP, proteinlerin bir doku düzlemi boyunca hücreler içindeki polarize dağılımını ifade eder ve hücresel dağılımı düzenler; Kararlı bir geometriye sahip epitelya, altıgen şekilli hücrelerden oluşur ve burada sadece üç hücre19,20,21,22 köşelerinde birleşir. Epitel morfogenezi sırasında meydana gelen hücre bölünmesi, komşu değişimi veya delaminasyon gibi farklı hücresel süreçler, bir köşede birleşen hücrelerin sayısında ve belirli bir hücreninsahip olduğu komşu hücrelerin sayısında bir artış üretir. PCP ile ilgili bu hücresel davranışlar farklı sinyal yolakları, aktin dinamikleri veya hücre içi kaçakçılıktarafından düzenlenebilir 23.
Farelerde kapak gelişimini inceleyen veriler, endokardın bir hücre alanı yerine bir hücre çizgisi olarak gösterildiği E8.5 ve E9.5 embriyonik kalplerinin enine, koronal veya sagital bölümlerinden elde edilmiştir - endokard, kalp tüpünün tüm iç yüzeyini kaplar24. Embriyonik kesitler, fare embriyolarının endokardında PCP analizine izin vermez. Yeni deneysel yöntemimiz, temsili sonuçlarda gösterildiği gibi endokardiyal hücre dağılımının, AJ anizotropisinin ve tek hücreli şekil analizinin analizine izin verir. Bu tür veriler, PCP analizi için, bu raporda gösterilmeyen PCP ile ilgili diğer moleküllerin tanımı ile birlikte gereklidir. Tam montajlı immünofloresan, spesifik numune hazırlama ve genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımı, farelerde kapak gelişiminin başlangıcında endokardda düzlemsel polarite analizini mümkün kılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Hayvan Deneyleri Etik Komitesi ve Madrid Topluluğu tarafından onaylanmıştır (ref. PROEX 155.7/20). Tüm hayvan prosedürleri, Real Decreto 1201/2005 kapsamında İspanyol yasalarında yürürlüğe giren, deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63EU sayılı AB Direktifi ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı'na uygundur.
1. ESÜ ve / veya OFT'lerin obtensiyonu (Xiao ve ark. 25)
- Öğleden sonra kadın mTmG ve erkek VE-Cadherin-Cre-ERT / + arasında haçlar ayarlayın.
- Ertesi sabah, vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin. Vajinal tıkaç varsa, yarım gün olarak sayın (E0.5). İlgilenilen deneye bağlı olarak, 8 gün veya 9 gün sayın.
- Diseksiyondan 24 saat önce, hamile kadını mısır yağında seyreltilmiş 50 μL 5 mg / mL 4-OH-Tamoksifen ile ağızdan gizleyin.
NOT: Bu doz, GFP-pozitif klonların varlığı ile ortaya çıkan sınırlı miktarda CRE aracılı rekombinasyonu indükleyecektir. Her yeni 4-OH-Tamoksifen partisi ile uygun dozun belirlenmesi gerekecektir. - Hamile kadını servikal çıkık ile E8.5 veya E9.5'te feda edin.
- Hamile farelerin karnını makas kullanarak açın ve makas ve ince forseps kullanarak embriyoları içeren uterusu çıkarın.
- Rahimi,% 0.1 Tween-20 (PBT) ile buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabına yerleştirin.
- Bireysel deciduae'yi diseksiyon mikroskobu altında ve ince forseps kullanarak uterustan çıkarın.
- İnce cımbız kullanarak, embriyonun bulunduğu yer olan decidua'nın beyaz kısmında bir kesi yapın, nazikçe çıkarın, çekmekten kaçının ve embriyoları, ucu kesilmiş bir P1000 kullanarak taze PBT'li yeni bir Petri kabına aktarın ve embriyonun kırılmadan geçmesi için yeterince büyük bir çap bırakın.
- Genotipleme için, yumurta sarısı kesesinin küçük bir parçasını (0.5 mm2) veya kuyruğun bir parçasını (arka uçtan, başa doğru 5 ila 10 somit sayarak) alın ve 100 μL uygun tamponda sindirin.
- Duman başlığının altında, embriyoları 4 ° C'de bir mikrosantrifüj (2 mL) tüpünde steril filtrelenmiş PBS'de buz soğuk% 4 paraformaldehit'e (% 4 PFA) aktarın. Embriyoları bir nutator üzerinde 4 °C'de 2 saatten gece boyunca (O / N) sabitleyin.
- Duman başlığının altında, embriyolara dokunmadan mikrosantrifüj tüplerinden% 4 PFA fiksatifini çıkarın. PFA'yı uygun bir kaba atın.
- Embriyoları soğuk PBT'de 5 kat oda sıcaklığında (RT) her biri 10 dakika yıkayın.
- İnce forseps kullanarak kalbi çıkarın ve taze PBT'li yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. Fare embriyonik kalbinin tüm montaj immünofloresansı
- PBT'yi PBSTr ile değiştirin (PBS'de %0,4 Triton X-100) ve numuneleri RT'de yörüngesel bir çalkalayıcıda 3x, her biri 5 dakika yıkayın.
- PBSTr'yi bloke edici çözelti ile değiştirin (PBSTr% 10 ısı ile inaktive edilmiş sığır serumu ile). Yörüngesel bir çalkalayıcıda 4 °C'de 2 saatten O/N'ye kadar inkübe edin.
- İstenilen konsantrasyonda primer antikor içeren bloke edici çözelti ile bloke edici çözeltiyi değiştirin (anti-GFP veya anti-VE-Kadherin antikoru için 1:1000 seyreltme kullanın). O/N'yi yörüngesel bir çalkalayıcıda 4 °C'de inkübe edin.
- 4 °C'de O / N inkübasyonundan sonra, yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 1,5 saat inkübe edin. Bu adım, sinyal-gürültü oranını artırmak için çok önemlidir.
- Gelecekteki üç deney için birincil antikor çözeltisini 4 ° C'de çıkarın ve saklayın (en iyi koruma için% 0.02'lik bir son konsantrasyona sodyum azid ekleyin).
- Embriyoları her biri 3 dakika boyunca PBSTr ile 3 kat yıkayın.
- Embriyoları PBSTr 3x ile 4 ° C'de yörüngesel bir çalkalayıcıda her biri 30 dakika boyunca yıkayın.
- Son yıkamadan sonra, birincil antikor konakçı türlerine karşı 1:1000 floresan konjuge sekonjuge sekonder antikor içeren 1 mL bloke edici çözelti ekleyin. Ayrıca çözeltiye 1:3000 DAPI ekleyin ve embriyoları O / N'yi 4 ° C'de yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- 4 °C'de O / N inkübasyonundan sonra, yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 1,5 saat inkübe edin. Bu adım, sinyal-gürültü oranını artırmak için çok önemlidir.
- Embriyoları her biri 3 dakika boyunca PBSTr ile 3 kat yıkayın.
- Embriyoları RT'de yörüngesel bir çalkalayıcıda her biri 30 dakika boyunca PBSTr 3x-5x ile yıkayın.
3. Fare embriyonik AVC veya OFT'lerin montajı
- Kalpleri PBS içeren bir Petri kabına (35 mm) koyun.
- Bir tungsten tel ve ince forseps kullanarak, AVC'yi veya OFT'yi izole edin ve uzunlamasına26 kesin.
- DAPI olmadan floresan için kapaklar (22 mm x 22 mm), kızaklar (60 mm x 24 mm), forsepsler, uygun uçlara sahip bir P200 pipet, kağıt havlu ve sulu gliserol bazlı montaj ortamları hazırlayın.
- Xiao, C. ve ark.25'te olduğu gibi benzer bir yaklaşım kullanarak, örneklerin ezmeden orijinal şeklini korumalarını sağlayacak bir 3D oda alanı oluşturmak için 0.3-0.6 cm ile ayrılmış bir slayta iki bant şeridi yapıştırın.
- Dikkatli bir şekilde ve minimum tampon hacmini kullanarak, kesilmiş bir P200 uç pipeti kullanarak numuneleri bant şeritleri arasındaki slayda bırakın. Doğruluğu artırmak için diseksiyon mikroskobu kullanın.
- İnce forseps kullanarak, örnekleri endokardiyumu yukarı bakacak şekilde yerleştirin (slaytta miyokard).
- Fazla PBS'yi bir kağıt havluyla çıkarın (numuneye dokunmaktan kaçının) ve ardından numunelerin slayda yapışmasını sağlamak için numuneleri RT'de 1-2 dakika kurulayın.
- Dokuya 40 μL sulu bazlı montaj ortamı ekleyin.
- Kapak kaymasını iki bant parçasının üzerine yerleştirin ve bir iğne veya forseps ile yavaşça dokunun üzerine indirin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
- Kapak fişinin her köşesine bir damla oje kullanarak kapak kapağını kapatın.
- Oje kuruduktan sonra, emici bir kağıt havlu kullanarak fazla montaj ortamını kapak kapağının kenarlarından temizleyin. Kapak kapağını hareket ettirmekten kaçının.
- Montaj ortamının buharlaşmasını önleyerek kapağın kayma kenarları boyunca oje ekleyin.
- Dik veya ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak, genel görünüm için 10x'te ve ayrıntılı görüntüler için 3x yakınlaştırma ile 63x'te görüntüler çekin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak üretilen veriler, AVC'nin endokardının en yüz görüntülemesinin gerçekleştirilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir. İlk amaç, kapakçıkların oluşumu sırasında endokardın hücre şeklini hücresel çözünürlükte analiz etmekti (Şekil 1). E9.5'teki bireysel endokardiyal hücreleri vurgulamak için, iki transgenik fare suşu kullandık. (1) ROSAmT/mG, hücre zarında floresansı tespit edilen iki renkli floresan Cre muhabir alelidir (tdTomato/mT ve EGFP/mG). Krem aracılı aktivasyon olmadan, transgen tdDomates'i (mT) eksprese eder. Krem aracılı aktivasyon üzerine, tdDomates ekspresyonu, spesifik hücrelerde ve klonal türevlerde EGFP floresan ekspresyonu (mG) ile değiştirilir27. (2) Cdh5CreERT2/+ fare hattı, embriyonik evre28'de vasküler endotel ve endokardda eksprese edilen vasküler endotelyal kadherin promotörünün (Cdh5) regülasyonu altında tamoksifen ile indüklenebilir CRE-rekombinazı (CreERT2) ifade eder. Endokardın bireysel hücrelerinde GFP ekspresyonunu aktive etmek için iki transgeni taşıyan embriyoları elde etmek için her genotipten bir erkek ve bir dişi geçtik. Bunu başarmak için, daha az sayıda hücrede CRE ekspresyonunu aktive etmek için düşük dozlarda tamoksifen aşıladık. Sonuç olarak, tek hücreler veya birkaç hücrenin klonları, endokardda GFP'yi eksprese etti (Şekil 1A). GFP ekspresyonu (Şekil 1A,B), VE-Kadherin hücre altı lokalizasyonu ile kombinasyon halinde (Şekil 1C), EMT öncesi hücrelerde AJ dinamiği ve filopodia oluşumu arasındaki ilişkiyi incelemek için etkili bir yaklaşımdır, çünkü bu hücreler AJ'ler29'u çözerken membran çıkıntıları geliştirir. PCP sinyalleri, AJ'lere anizotropik kontraktiliteyi verebilir ve epitel30'da polarize morfogenezi teşvik eden hücresel kuvvetler üretebilir. Endokarddaki VE-Kadherin boyamasının yoğunluğunda farklılıklar bulduk (Şekil 2), AVC'nin embriyonik endokardiyumundaki anizotropik kontraktiliteyi pre-valvüler aşamalarda atamayacağımızı gösteriyor.
İkinci amaç, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel topolojisini analiz etmekti (Şekil 2). Tek bir tepe noktasında yakınsak olan hücre sayısını tanımlamak için tüm kalbi E8.5 ve E9.5'te VE-Kadherin antikoru ile boyadım (Şekil 2A,B). Endokardiyal hücrenin hücre-hücre temaslarında lokalize olan diğer moleküller de bu amaç için yararlı olacaktır (örneğin, β-Katenin). E8.5'te, ESÜ'nün endokardiumu stabil bir epitel organizasyonuna sahip olma eğilimindedir ve dörtten fazla hücrenin oluşturduğu köşeleri tespit edemedik (Şekil 2A, C). Daha sonra E9.5'te, daha önce aktif hücre yeniden düzenlemelerinden geçen epitelia'da tarif edilen hücresel organizasyona benzer şekilde, rozet benzeri yapılar oluşturan altı hücreye kadar köşeler bulduk (Şekil 2B, D), ESÜ endokardının kapak gelişimi sırasında aktif hücresel yeniden düzenlemeden geçtiğini düşündürmektedir.
Şekil 1: Prevalvüler endokardda tek hücreli şekil analizi. (A) E9.5 fare embriyosundan AVC, dağınık GFP pozitif hücreleri gösteren uzunlamasına açılmıştır. (B) Tek hücrelerdeki GFP ekspresyonu, hücresel çözünürlükte hücre şeklini tanımlar. (C) VE-Cadherin'in tamamen monte boyanması AJ'leri vurgular. Filopodia, hücrenin VE-Cadherin'i (mor oklar) lokalize etmeyen alanlarında üretilir ve bunun tersi de, VE-Cadherin, hücrenin pürüzsüz ve filopodia (mavi ok uçları) oluşturmayan alanlarında lokalize olur. v, ventral; d, sırt. A'daki ölçek çubuğu 100 μm'dir; B ve C'de 10 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: AV kanalındaki endokardın en face görüntülerinde düzlemsel olarak lokalize proteinlerin düzlemsel topolojisi ve anizotropisi tanımlanabilir. VE-Kadherin, endokardın hücre-hücre temaslarında lokalizedir. Embriyolardan (A) E8.5 ve (B) E9.5 AVC uzunlamasına açıldı. (C) ve (D)'deki büyütmeler, bir tepe noktasında birleşen hücrelerin sayısını gözlemlememize izin verdi. Ek olarak, VE-Kadherin boyamasındaki farklı yoğunlukları ayırt edebiliriz, bu da ESÜ'deki konumunun anizotropik olduğunu gösterir. A ve B'deki ölçek çubuğu 100 μm'dir; C ve D'de 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endokard, embriyonik kalp tüpünün tüm iç yüzeyini kaplayan epitel tek katmanlıdır. Kapak gelişimi sırasında, prospektif kapak bölgelerindeki endokardiyal hücreler EMT'ye maruz kalır, böylece endokardiyal hücreler endokarddan kardiyak jöleye doğru delaminasyon yapmak için sitoiskeletlerini dönüştürür ve yeniden düzenler. Biz ve diğerleri, endokardın 6,8,24,32 hücre sırası olarak gösterildiği E8.5 ve E9.5 embriyonik kalplerinin enine bölümlerini analiz ederek fare embriyolarında kapak gelişimi hakkında ilgili veriler elde ettik. Bu yaklaşım, sinyal yollarının ve kapak gelişiminde yer alan diğer moleküllerin ekspresyonunun analizine izin verdi, ancak pre-valvüler endokardın mekansal yönlerini analiz etmek mümkün değildi.
AVC veya OFT eksplantları esas olarak EC'yi bir 3D kollajen jeli üzerinde dönüştürmek için kullanıldı. Eksplantlar, EMT ölçümü, dönüşüm kapasitesinin analizi veya 6,7,11,33 kültüründe birkaç gün sonra ilaçların test edilmesi için yararlıdır. Bu ex vivo deneyler aynı zamanda endokardın kollajen jelinin üzerine tek katmanlı olarak genişlemesine izin verir, ancak ex vivo kardiyak eksplantların yetiştirildiği çevresel koşullar utero koşullardan farklıdır. Örneğin, tek yönlü kan akışı, uygun kapak gelişimiiçin gereklidir 34,35 ve ex vivo, eksplantlarda değil, sadece in utero'da elde edilir.
Bu yeni yaklaşım, kapak gelişiminin başlangıcında herhangi bir çevresel manipülasyon olmaksızın bozulmamış kapak endokardiyumunu gözlemlememizi sağlar. Kapak endokardının hücresel dağılımının analizine ve ayrıca utero koşullarda EMT öncesi ve sırasında tek hücreli şekil analizine izin verir. EMT sırasında hücre-hücre temaslarının yoğunluğunu ve organizasyonunu ve ilgili moleküllerin hücre altı dağılımını da gözlemleyebilir ve analiz edebiliriz. Bu teknik aynı zamanda endokardın hücre altı yapılarını, muhabir genleri kullanarak sinyal yolaklarının aktivasyonunu, gen inaktivasyonunun hücresel davranış üzerindeki etkisini ve vahşi tip komşu hücreleri nasıl etkileyebileceğini analiz etme imkanı sunar.
Yüksek kaliteli numuneler elde etmek için, bunları kullanırken çok dikkatli olmak önemlidir, çünkü dokuya yapışan safsızlıklar (örneğin, mikrofiberler) görüntülerin yakalanması sırasında eserlere neden olabilir. Ek olarak, çok küçük numuneler oldukları için, kırılma riski yüksektir, bu nedenle dokuyu (adım 1. ve adım 2.) yavaş çalkalayıcılarda yıkamak gerekir. Pipetli ortamın değiştirilmesi sırasında, yanlışlıkla emilmesi durumunda dokunun uçtan geçerken çökmesini önlemek için ucun kesilmesini öneririz. Bu teknikte uzman olmak için, araştırmacının mikromanipülasyondaki önceki deneyimine bağlı olarak daha uzun veya daha kısa olacak bir öğrenme eğrisi gereklidir.
Doğru fiksatif ve fiksasyon zamanını seçmek, floresan proteinleri eksprese eden transgenlerin kullanılması durumunda önemli olabilir. Anatomik yapı, etanol% 70, metanol,% 4 PFA veya% 10 formalin gibi farklı fiksatörlerden etkilenmez.
Çekirdeklerin karşı boyanması için, numunelerin DAPI ile inkübasyonunu öneririz, çünkü penetrasyon, DAPI ile montaj ortamı kullanmaktan çok daha verimlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033'den J. L. P. J.G.-B.'ye PID2019-104776RB-I00 ve CB16/11/00399 (CIBER CV) hibeleri ile desteklenmiştir. Comunidad de Madrid'den Programa de Atracción de Talento tarafından finanse edildi (2020-5ª / BMD-19729). T.G.-C. Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054) tarafından finanse edilmiştir. MCIN/AEI /10.13039/501100011033 ve FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16) tarafından ortaklaşa finanse edilen CNIC Mikroskopi ve Dinamik Görüntüleme Birimi, CNIC, ICTS-ReDib'e teşekkür ederiz. Ayrıca A. Galiçya ve L. Méndez'e fare yetiştiriciliği için teşekkür ederiz. Bu yayının maliyeti kısmen Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'ndan gelen fonlarla desteklendi. CNIC, ISCIII, MCIN ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir ve MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 tarafından finanse edilen bir Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezi'dir (hibe CEX2020-001041-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
