एन फेस माउस भ्रूण में प्लानर मोर्फोजेनेसिस विश्लेषण के लिए एंडोकार्डियल कुशन तैयारी
Summary
शास्त्रीय रूप से, माउस भ्रूण वाल्व प्रिमोर्डियम के एंडोकार्डियम का विश्लेषण ट्रांसवर्सल, कोरोनल या धनु वर्गों का उपयोग करके किया गया है। वाल्वुलोजेनिक क्षेत्रों में एंडोकार्डियम की दो-आयामी इमेजिंग के लिए हमारा नया दृष्टिकोण वाल्व विकास के दौरान एंडोकार्डियम के प्लानर पोलैरिटी और सेल पुनर्व्यवस्था विश्लेषण की अनुमति देता है।
Abstract
स्तनधारी हृदय के विकास को अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन मानव जन्मजात हृदय रोग को संबोधित करने के लिए आवश्यक है। आदिम कार्डियक वाल्व के विकास में स्थानीय प्रेरक मायोकार्डियल और एंडोकार्डियल संकेतों के जवाब में हृदय के एट्रियोवेंट्रिकुलर नहर (एवीसी) और बहिर्वाह पथ (ओएफटी) क्षेत्रों से एंडोकार्डियल कोशिकाओं के उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) शामिल हैं। एक बार जब कोशिकाएं एंडोकार्डियम और मायोकार्डियम के बीच स्थित बाह्य मैट्रिक्स (कार्डियक जेली) पर आक्रमण करती हैं, तो आदिम एंडोकार्डियल कुशन (ईसी) का गठन होता है। इस प्रक्रिया का तात्पर्य है कि एंडोकार्डियम को डिलेमिनेटेड कोशिकाओं द्वारा छोड़े गए अंतराल को भरना पड़ता है और एक अक्ष के साथ अभिसरण (संकीर्ण) या विस्तार (लंबा) करने के लिए खुद को पुनर्गठित करना पड़ता है। वर्तमान शोध ने इस प्रक्रिया में शामिल कारकों के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को विनियमित करने में प्लानर सेल पोलैरिटी (पीसीपी) मार्ग को फंसाया है। शास्त्रीय रूप से, कार्डियक वाल्व विकास के प्रारंभिक चरणों का अध्ययन भ्रूण के दिल के क्रॉस-सेक्शन में या कोलेजन जैल पर संवर्धित विवो एवीसी या ओएफटी खोजों में किया गया है। ये दृष्टिकोण एपिको-बेसल ध्रुवीयता के विश्लेषण की अनुमति देते हैं लेकिन उपकला के तल के भीतर या माइग्रेटिंग कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों के सेल व्यवहार के विश्लेषण की अनुमति नहीं देते हैं। यहां, हम एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण दिखाते हैं जो कोशिकाओं के प्लानर क्षेत्र के रूप में वाल्वुलोजेनिक क्षेत्रों में एंडोकार्डियम के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। यह प्रयोगात्मक दृष्टिकोण वाल्व विकास के दौरान ओएफटी और एवीसी के एंडोकार्डियम के भीतर पीसीपी, प्लानर टोपोलॉजी और इंटरसेलुलर संचार का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। कार्डियक वाल्व मोर्फोजेनेसिस में शामिल नए सेलुलर तंत्र को समझना एंडोकार्डियल कुशन दोषों से जुड़े जन्मजात हृदय रोग को समझने में योगदान कर सकता है।
Introduction
हृदय एक स्तनधारी भ्रूण का पहला कार्यात्मक अंग है। चूहों में भ्रूण दिवस (ई) 7.5 के आसपास, द्विपक्षीय प्रीकार्डियक मेसोडर्म कोशिकाएं उदर पक्ष1 में कार्डियक अर्धचंद्र बनाती हैं। कार्डियक अर्धचंद्र में प्रीकार्डियक कोशिकाओं की दो आबादी होती है जिसमें मायोकार्डियम और एंडोकार्डियम2 के पूर्वज शामिल होते हैं। ई 8.0 के आसपास, कार्डियक अग्रदूत मध्य रेखा में फ्यूज होते हैं, जो आदिम हृदय ट्यूब का निर्माण करते हैं जिसमें दो उपकला ऊतक, बाहरी मायोकार्डियम और आंतरिक एंडोकार्डियम शामिल होते हैं, जो कार्डियक जेली नामक बाह्य मैट्रिक्स द्वारा अलग किया गया एक विशेष एंडोथेलियम है। बाद में, E8.5 पर, हृदय ट्यूब दाईं ओर लूपिंग से गुजरती है। लूप किए गए दिल में विशिष्ट आणविक हस्ताक्षर जैसे बहिर्वाह पथ (ओएफटी), वेंट्रिकल्स और एट्रियो-वेंट्रिकुलर नहर (एवीसी) 3 के साथ अलग-अलग शारीरिक क्षेत्र होते हैं। यद्यपि प्रारंभ में हृदय ट्यूब कोशिकाओं4 के अतिरिक्त, E9.5 पर अपने प्रवाह पक्ष पर फैलती है, गहन हृदय प्रसार के परिणामस्वरूप कक्षों का गुब्बारा बढ़ता है और ट्रिब्युलर नेटवर्क5 की स्थापना होती है। वाल्व गठन एवीसी (भविष्य के माइट्रल और ट्राइकसपिड वाल्व) और ओएफटी (भविष्य के महाधमनी और फुफ्फुसीय वाल्व) में होता है।
एंडोकार्डियम वाल्व विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंडोकार्डियल कोशिकाएं एंडोकार्डियल कुशन बनाने के लिए एवीसी और ओएफटी में उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरती हैं, एक संरचना जो वाल्व विकास की शुरुआत में दिखाई देती है। विभिन्न सिग्नलिंग मार्ग इस प्रक्रिया को सक्रिय करते हैं; चूहों में E9.5 पर, मायोकार्डियल-व्युत्पन्न BMP2 के जवाब में एंडोकार्डियम में सक्रिय नॉच TGF2 और SNAIL (SNAI1) के सक्रियण के माध्यम से AVC और OFT क्षेत्रों में एंडोकार्डियल कोशिकाओं के आक्रामक EMT को बढ़ावा देता है, जो सीधे संवहनी एंडोथेलियल कैडरिन (VE-कैडरिन) की अभिव्यक्ति को दबाता है, जो पालन जंक्शनों (AJs) 6,7,8 का एक ट्रांसमेम्ब्रेन घटक है। . ओएफटी में, ईएमटी शुरू करने के लिए एंडोकार्डियम की सक्रियता एफजीएफ 8 और बीएमपी 4 द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जिसकी अभिव्यक्ति नॉच 9,10,11,12 द्वारा सक्रिय होती है।
ईएमटी की प्रगति में सेलुलर गतिशीलता शामिल होती है क्योंकि कोशिकाएं आकार बदलती हैं, अपने पड़ोसियों के साथ जंक्शनों को तोड़ती हैं और रीमेक करती हैं, डीलैमिनेट करती हैं, और13 को स्थानांतरित करना शुरू करती हैं। इन परिवर्तनों में एजे रीमॉडल औरक्रमिक विघटन 14,15, प्लानर सेल पोलैरिटी (पीसीपी) सिग्नलिंग, एपिको-बेसल पोलैरिटी (एबीपी), एपिकल कसना और साइटोस्केलेटल संगठन16,17 का नुकसान शामिल है। एबीपी एक सेल के पूर्ववर्ती-पीछे की धुरी के साथ प्रोटीन के वितरण को संदर्भित करता है। विकासशील हृदय में, वेंट्रिकुलरविकास के लिए कार्डियोमायोसाइट्स में एबीपी विनियमन की आवश्यकता होती है। पीसीपी एक ऊतक के तल में कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन के ध्रुवीकृत वितरण को संदर्भित करता है और सेलुलर वितरण को नियंत्रित करता है; एक स्थिर ज्यामिति के साथ एपिथेलिया हेक्सागोन के आकार की कोशिकाओं से बना होता है, जहां केवल तीन कोशिकाएं19,20,21,22 शीर्ष पर एकत्रित होती हैं। उपकला मोर्फोजेनेसिस के दौरान होने वाली विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाएं, जैसे कोशिका विभाजन, पड़ोसी विनिमय, या डिलेमिनेशन, उन कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि का उत्पादन करती हैं जो एक शीर्ष पर अभिसरण करती हैं और पड़ोसी कोशिकाओं की संख्या जो किसी दिए गए सेल में22 होती हैं। पीसीपी से संबंधित इन सेलुलर व्यवहारों को विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों, एक्टिन गतिशीलता, या इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग23 द्वारा विनियमित किया जा सकता है।
चूहों में वाल्व विकास का अध्ययन करने वाले उत्पन्न डेटा को ई 8.5 और ई 9.5 भ्रूण के दिल के ट्रांसवर्सल, कोरोनल या धनु वर्गों से प्राप्त किया गया है, जहां एंडोकार्डियम को कोशिकाओं के क्षेत्र के बजाय कोशिकाओं की एक पंक्ति के रूप में दिखाया गया है – एंडोकार्डियम हृदय ट्यूब24 की पूरी आंतरिक सतह को कवर करता है। भ्रूण अनुभाग माउस भ्रूण के एंडोकार्डियम में पीसीपी के विश्लेषण की अनुमति नहीं देते हैं। हमारी नई प्रयोगात्मक विधि एंडोकार्डियल सेल वितरण, एजे अनिसोट्रॉपी और एकल-सेल आकार विश्लेषण के विश्लेषण की अनुमति देती है, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है। पीसीपी विश्लेषण के लिए इस प्रकार के डेटा की आवश्यकता होती है, साथ ही पीसीपी से संबंधित अन्य अणुओं के विवरण के साथ, इस रिपोर्ट में नहीं दिखाया गया है। होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, विशिष्ट नमूना तैयारी और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग चूहों में वाल्व विकास की शुरुआत में एंडोकार्डियम में प्लानर ध्रुवीयता विश्लेषण को सक्षम करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंडोकार्डियम एक उपकला मोनोलेयर है जो भ्रूण के हृदय ट्यूब की पूरी आंतरिक सतह को कवर करता है। वाल्व विकास के दौरान, संभावित वाल्वुलर क्षेत्रों में एंडोकार्डियल कोशिकाएं ईएमटी से गुजरती हैं, इस प्रकार ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को एमसीआईएन/एईआई/10.13039/501100011033 से जे.एल.पी.जे.जी.-बी. को पीआईडी 2019-104776आरबी-आई00 और सीबी16/11/00399 (सीआईबीईआर सीवी) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। कोमुनिडाड डी मैड्रिड (2020-5/ बीएमडी-19729) से प्रोग्रामा डी एट्राकिओन डी टैलेंटो द्वारा वित्त पोषित किया गया था। टी.जी.-सी. प्रोफेसर यूनिवर्सिटेरियो (एफपीयू 18/01054) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम माइक्रोस्कोपी और डायनेमिक इमेजिंग की सीएनआईसी इकाई, सीएनआईसी, आईसीटीएस-रीडिब को धन्यवाद देते हैं, जो एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033 और फेडर “यूरोप बनाने का एक तरीका” (#ICTS-2018-04-सीएनआईसी -16) द्वारा सह-वित्तपोषित है। हम माउस पालन के लिए ए गैलिसिया और एल मेन्डेज़ को भी धन्यवाद देते हैं। इस प्रकाशन की लागत यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष से धन द्वारा समर्थित थी। सीएनआईसी को आईएससीIII, एमसीआईएन और प्रो सीएनआईसी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया है और यह एक सेवेरो ओचोआ सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (अनुदान CEX2020-001041-S) है जो MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 द्वारा वित्तपोषित है।
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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