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Immunology and Infection

एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल में लूसिफर पीले रंग का उपयोग करके आंतों की पारगम्यता का निर्धारण करना

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64215
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 3, 1
1Division of Pediatric Surgery, Oklahoma Children's Hospital, 2Oklahoma University Health Sciences Center, 3Department of Surgery, University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक विधि को रेखांकित करता है जो आंतों की पारगम्यता निर्धारित करने के लिए एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल में लूसिफर पीले रंग का उपयोग करता है। इस विधि का उपयोग एंटरोइड्स में पैरासेलुलर पारगम्यता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जो सूजन आंत्र रोगों जैसे नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस को मॉडल करते हैं।

Abstract

एंटरोइड्स सूजन आंत्र रोगों जैसे नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) के अध्ययन में एक उभरता हुआ शोध उपकरण है। वे पारंपरिक रूप से बेसोलेटरल-आउट (बीओ) रचना में उगाए जाते हैं, जहां उपकला कोशिका की एपिकल सतह आंतरिक लुमेन का सामना करती है। इस मॉडल में, उपचार और प्रयोग के लिए एंटरोइड्स की ल्यूमिनल सतह तक पहुंच चुनौतीपूर्ण है, जो मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को सीमित करती है। इसे दरकिनार करने के लिए, नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस के लिए एक नवजात एपिकल-आउट (एओ) मॉडल बनाया गया था। चूंकि आंतों के उपकला कोशिका पारगम्यता परिवर्तन एनईसी के लिए पैथोग्नोमोनिक हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल पैरासेलुलर पारगम्यता के मार्कर के रूप में लूसिफर पीले (एलवाई) का उपयोग करता है। एलवाई सभी तीन प्रमुख पैरासेलुलर मार्गों के माध्यम से आंतों के उपकला अवरोध को पार करता है: छिद्र, रिसाव और अप्रतिबंधित। एओ मॉडल में एलवाई का उपयोग एनईसी में पारगम्यता के व्यापक अध्ययन की अनुमति देता है। आईआरबी अनुमोदन और माता-पिता की सहमति के बाद, मानव अपरिपक्व नवजात शिशुओं से आंतों के ऊतकों के सर्जिकल नमूने एकत्र किए गए थे। आंतों की स्टेम कोशिकाओं को क्रिप्ट अलगाव के माध्यम से काटा गया था और एंटरोइड्स को विकसित करने के लिए उपयोग किया गया था। एंटरोइड्स को परिपक्वता के लिए उगाया गया और फिर एओ को बदल दिया गया या बीओ रचना में छोड़ दिया गया। इनका या तो इलाज (नियंत्रण) नहीं किया गया था या लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के साथ इलाज किया गया था और इन विट्रो एनईसी के प्रेरण के लिए हाइपोक्सिक स्थितियों के अधीन किया गया था। पारगम्यता का आकलन करने के लिए एलवाई का उपयोग किया गया था। एपिकल प्रोटीन ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स -1 और बेसोलेटरल प्रोटीन β-कैटेनिन के इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग ने एओ अनुरूपता की पुष्टि की। एलपीएस और हाइपोक्सिया के साथ इलाज किए गए एओ और बीओ एंटरोइड्स दोनों ने नियंत्रण की तुलना में पैरासेलुलर पारगम्यता में काफी वृद्धि का प्रदर्शन किया। एओ और बीओ एंटरोइड्स दोनों ने नियंत्रण की तुलना में इलाज किए गए एंटरोइड्स के लुमेन में एलवाई के तेज में वृद्धि दिखाई। एओ एंटरॉइड मॉडल में एलवाई का उपयोग पैरासेल्युलर पारगम्यता के सभी तीन प्रमुख मार्गों की जांच के लिए अनुमति देता है। यह मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की जांच के लिए अतिरिक्त रूप से अनुमति देता है और यह बीओ एंटरॉइड मॉडल की तुलना में पारगम्यता को कैसे प्रभावित कर सकता है।

Introduction

एंटरोइड्स अंग-प्रतिबंधित मानव आंतों के स्टेम सेल 1,2 से प्राप्त त्रि-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं। वे पूरी तरह से उपकला वंश से बने होते हैं और इसमें सभी विभेदित आंतों के उपकला कोशिका प्रकारहोते हैं। एंटरोइड्स एक एपिकल ल्यूमिनल सतह से बने सेलुलर ध्रुवीयता को भी बनाए रखते हैं जो एक आंतरिक डिब्बे और आसपास के मीडिया के सामने एक बेसोलेटरल सतह बनाते हैं। एंटरोइड्स एक अद्वितीय मॉडल है जिसमें वे मेजबान की विशेषताओं को संरक्षित करते हैं जिससेवे उत्पन्न हुए थे। इस प्रकार, समय से पहले मानव शिशुओं से उत्पन्न एंटरोइडएक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं जो मुख्य रूप से इस आबादी को प्रभावित करने वाली बीमारियों की जांच के लिए उपयोगी है, जैसे कि नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी)।

पारंपरिक एंटरॉइड मॉडल को बेसोलेटरल-आउट (बीओ) रचना में उगाया जाता है, जहां एंटरोइड को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमएम) के गुंबद में घेर लिया जाता है। बीएमएम एंटरॉइड को बाहर की ओर बेसोलेटरल सतह के साथ 3 डी संरचना बनाए रखने के लिए प्रेरित करता है। बीओ एंटरोइड्स एनईसी के लिए एक उपयुक्त मॉडल है जो दो आयामी (2 डी) प्राथमिक मानव सेल लाइनों और विवो पशु मॉडल 2,4 के बीच की खाईको पुल करता है। एनईसी को एंटरोइड्स के आसपास के मीडिया में एलपीएस या बैक्टीरिया जैसे रोगजनकों को रखकर एंटरोइड्स में प्रेरित किया जाता है, इसके बाद हाइपोक्सिक स्थितियों 2,3 के संपर्क में आता है। बीओ एंटरॉइड एनईसी मॉडल के साथ चुनौती यह है कि यह मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के प्रभावी अध्ययन की अनुमति नहीं देता है, जो विवो में एपिकल सतह पर होता है। आंतों की पारगम्यता में परिवर्तन इन मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के कारण होते हैं। बेहतर ढंग से समझने के लिए कि पारगम्यता रोग के पैथोफिजियोलॉजिकल आधार को कैसे प्रभावित करती है, एक मॉडल बनाया जाना चाहिए जिसमें एपिकल सतह का इलाज शामिल है।

को एट अल यह प्रदर्शित करने वाले पहले व्यक्ति थे कि परिपक्व बीओ एंटरोइड्स को बीएमएम गुंबदों को हटाकर और उन्हें मीडिया5 में पुन: निलंबित करके एक एपिकल-आउट (एओ) रचना बनाने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इस लेख से पता चला है कि एओ एंटरोइड्स ने सही उपकला ध्रुवीयता बनाए रखी, जिसमें सभी आंतों के सेल प्रकार शामिल थे, आंतों के उपकला अवरोध को बरकरार रखा, और एपिकल सतह5 तक पहुंच की अनुमति दी। एनईसी मॉडल के रूप में एओ एंटरोइड्स का उपयोग रोग प्रक्रिया के शारीरिक प्रजनन और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के अध्ययन को प्राप्त करता है।

एनईसी के पैथोफिज़ियोलॉजी में एक प्रमुख योगदानकर्ता आंतों की पारगम्यतामें वृद्धि है। विट्रो 7 में आंतों की पारगम्यता के परीक्षण के तरीके के रूप में कई अणुओं को प्रस्तावित किया गया है। इनमें से, लूसिफर पीला (एलवाई)क्रमशः 428 एनएम और 540 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन शिखर के साथ एक हाइड्रोफिलिक डाई है। जैसा कि यह सभी प्रमुख पैरासेलुलर मार्गों के माध्यम से पार करता है, इसका उपयोग रक्त-मस्तिष्क और आंतों के उपकलाअवरोधों सहित विभिन्न अनुप्रयोगों में पैरासेलुलर पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है। एलवाई का पारंपरिक अनुप्रयोग अर्ध-पारगम्य सतह10 पर मोनोलेयर में उगाई गई कोशिकाओं का उपयोग करता है। एलवाई को एपिकल सतह पर लागू किया जाता है और बेसोलेटरल साइड पर इकट्ठा होने के लिए पैरासेल्युलर तंग जंक्शन प्रोटीन के माध्यम से पार करता है। बेसोलेटरल डिब्बे में उच्च एलवाई सांद्रता बाद में आंतों के उपकला कोशिका अवरोध टूटने और बढ़ी हुई पारगम्यता10 के साथ तंग जंक्शन प्रोटीन में कमी का संकेत देती है। इसे 3 डी बीओ एंटरॉइड मॉडल में भी वर्णित किया गया है जहां एलवाई को मीडिया में जोड़ा गया था और लुमेन11 में एलवाई के उत्थान के लिए व्यक्तिगत एंटरोइड्स को चित्रित किया गया था। यद्यपि यह एलवाई अपटेक के विज़ुअलाइज़ेशन के माध्यम से गुणात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है, मात्रात्मक विश्लेषण सीमित है। यह प्रोटोकॉल एक अनूठी तकनीक को रेखांकित करता है जो 3 डी अभिविन्यास को बनाए रखते हुए एओ एंटरोइड्स में इन विट्रो एनईसी एंटरॉइड मॉडल का उपयोग करके पैरासेल्युलर पारगम्यता का आकलन करने के लिए एलवाई का उपयोग करता है। इस विधि का उपयोग पारगम्यता के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

वर्तमान शोध ओकलाहोमा विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदन (आईआरबी, # 11610, 11611) के अनुपालन में किया गया था। आईआरबी विनिर्देशों के अनुसार मानव शल्य चिकित्सा नमूने एकत्र करने से पहले माता-पिता की सहमति आवश्यक थी। आईआरबी अनुमोदन और माता-पिता की सहमति के बाद, मानव छोटे आंतों के ऊतकों को शिशुओं (नमूना संग्रह के समय 36-41 सप्ताह से लेकर गर्भकालीन आयु (जीए) को ठीक किया गया था, सभी 25-34 सप्ताह के अनुमानित जीए में अपरिपक्व जन्म के इतिहास के साथ, 2: 1 एम: एफ) एनईसी या अन्य आंतों के शोधन के लिए सर्जरी से गुजर रहे थे, जैसे कि ओस्टोमी टेकडाउन या एट्रेसिया मरम्मत। एंटरोइड्स या तो जेजुनम या इलियम से प्राप्त ऊतक से उत्पन्न हुए थे।

1. मानव शिशु-व्युत्पन्न एंटरॉइड संस्कृतियां: पूरे ऊतक से क्रिप्ट अलगाव और चढ़ाना

  1. पिछली रिपोर्ट4 के बाद संस्कृति मीडिया, चेलेटिंग बफर # 1, और चेलेटिंग बफर # 2 (तालिका 1) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर चेलेटिंग बफर स्टोर करें और 48 घंटे के भीतर उनका उपयोग करें।
  2. मानव मिनीगट मीडिया तैयार करें (तालिका 1)। स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म करें।
  3. 50% एल-डब्ल्यूआरएन वातानुकूलित मीडिया (सीएम) तैयार करें (तालिका 1)। स्टॉक को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: वातानुकूलित मीडिया के लिए 100% एल-डब्ल्यूआरएन आधार को मियोशी एट अल.12 द्वारा एक प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है।
  4. पिछली रिपोर्ट4 के बाद सर्जिकल नमूनों से प्राप्त छोटे आंतों के ऊतकों के नमूनों से एंटरोइड उत्पन्न करें। आंतों के ऊतकों के 0.75-2.5 ग्राम टुकड़े से 24-वेल प्लेट में एंटरोइड्स के चार कुओं को प्लेट करें।
    नोट: एंटरोइड्स को 30 एमएल रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम में 48 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में संग्रहीत ऊतक से सफलतापूर्वक उत्पन्न किया जा सकता है।
  5. बीएमएम गुंबदों के पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए15-20 मिनट के लिए24-वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में उल्टा रखें।
  6. प्रत्येक कुएं में वाई -27632, रॉक अवरोधक (आरआई, सामग्री की तालिका देखें) के 0.5 μL के साथ 50% L-WRN CM (जैसा कि चरण 1.3 में वर्णित है) का 500 μL जोड़ें। 2-3 दिनों के बाद, आरआई के बिना 50% एल-डब्ल्यूआरएन सीएम के साथ बदलें।

2. एओ एंटरोइड्स की पीढ़ी

  1. 50% एल-डब्ल्यूआरएन सीएम 4 के साथ 7-10 दिनों के लिए बीएमएम में एम्बेडेडएंटरोइड्स उगाएं।
  2. मीडिया को निकालें और एक कुएं में सेल रिकवरी समाधान (सीआरएस, सामग्री की तालिका देखें) के 500 μL जोड़ें। गुंबद को खुरचें, पिपेट को कई बार ऊपर और नीचे करें, फिर अगले कुएं में सीआरएस / एंटरोइड / बीएमएम समाधान जोड़ें।
  3. गुंबद को खुरचें, पिपेट को कई बार ऊपर और नीचे करें, और घोल को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। दूसरे कुएं में 500 μL CRS डालें, ऊपर और नीचे पिपेट करें, फिर इसे पहले कुएं में जोड़ें। इस समाधान को उसी 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. चरण 2.3 को दोहराएं, दो कुओं को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तब तक पूल करें जब तक कि सभी कुएं की सामग्री सीआरएस में न हो।
    नोट: एओ एंटरोइड्स की बड़ी मात्रा उत्पन्न होने पर दो से अधिक कुओं को एक बड़े 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल किया जा सकता है। बीएमएम के पूर्ण घुलनशीलता को सुनिश्चित करने के लिए 500 μL CRS प्रति कुएं अनुपात को बनाए रखना महत्वपूर्ण है।
  5. बीएमएम को घुलनशील बनाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक घूर्णन पर पूल किए गए सीआरएस / एंटरोइड / बीएमएम समाधान के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (चरण 2.3) को रखें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 200 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर गोली को पीछे छोड़ते हुए माइक्रोपिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  7. एंटरॉइड पेलेट को 50% एल-डब्ल्यूआरएन सीएम (चरण 1.3 में तैयार किया गया है) प्रति माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 24-वेल टिशू कल्चर प्लेटों के प्रत्येक कुएं में फिर से निलंबित एंटरॉइड / मीडिया समाधान के 500 μL को धीरे से पिपेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. प्रयोग से पहले 3 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के माध्यम से एओ एंटरॉइड रचना का सत्यापन

  1. 3 दिनों के लिए मीडिया निलंबन में एंटरोइड्स के इनक्यूबेशन के बाद, एंटरोइड / मीडिया निलंबन को एक कुएं से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें।
  2. मीडिया निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। एक माइक्रोपिपेट के साथ सुपरनैटेंट को हटा दें।
  3. बीएमएम के 20 μL में एंटरोइड्स को पुन: निलंबित करें। पिपेट 10 μL एंटरॉइड निलंबन को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ले जाता है और इसे लगभग 1 सेमी बाय 1 सेमी वर्ग की पतली परत में फैलाता है। उसी स्लाइड के एक अलग हिस्से पर एंटरॉइड निलंबन के शेष 10 μL के साथ दोहराएं ताकि एंटरोइड / बीएमएम निलंबन के दो स्मीयर हों।
  4. बीएमएम स्मीयर को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर जमने दें।
  5. फ्यूम हुड में काम करते हुए, स्लाइड को एक धुंधला जार में रखें और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड से भरें जब तक कि यह एंटरॉइड / बीएमएम स्मीयर को कवर न करे (10 स्लाइड क्षमता वाले ग्लास स्टेनिंग जार का उपयोग करके एक स्लाइड के लिए ~ 30 एमएल)। निर्धारण के लिए 30 मिनट (कमरे के तापमान पर) की अनुमति दें।
    चेतावनी: 4% पैराफॉर्मलडिहाइड खतरनाक है और आंखों की क्षति / जलन, त्वचा की जलन और कैंसर का कारण बन सकता है। इसका उपयोग करते समय हमेशा एक फ्यूम हुड के नीचे काम करें। इसे संभालते समय सुरक्षात्मक दस्ताने और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। इसे एक अनुमोदित अपशिष्ट निपटान कंटेनर में निपटाएं।
  6. एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड को छोड़ दें। धुंधला जार में 30 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) जोड़ें या जब तक पीबीएस एंटरॉइड / बीएमएम स्मीयर को कवर न करे। इसे आरटी में 3 मिनट के लिए बैठने दें, और फिर पीबीएस को पैराफॉर्मलडिहाइड अपशिष्ट बोतल में छोड़ दें। कुल तीन वॉश के लिए इस चरण को दो बार दोहराएं।
  7. पीबीएस में पतला 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के 30 एमएल के साथ एक नया धुंधला जार भरें। ट्राइटन घोल में एंटरॉइड / बीएमएम स्मीयर के साथ स्लाइड रखें और इसे आरटी पर 20 मिनट के लिए स्थिर होने दें।
  8. पीबीएस में पतला 0.5% ट्राइटन एक्स -100 को छोड़ दें। धुंधला जार में 30 एमएल पीबीएस जोड़ें और इसे 3 मिनट के लिए बैठने दें। पीबीएस को डिकेंट करके छोड़ दें।
  9. बीएमएम स्मीयर के चारों ओर स्लाइड को धीरे से पोंछें, सावधान रहें कि उन्हें बाधित न करें। हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन (बैरियर पीएपी पेन, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, प्रत्येक एंटरोइड / बीएमएम स्मीयर के चारों ओर एक सर्कल खींचें। एक 20% सीरम बनाएं, जो उस जानवर के लिए विशिष्ट है जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी उठाया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  10. माइक्रोस्कोप स्लाइड फ्लैट को लैब बेंच पर रखें। हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन द्वारा रिंग किए गए प्रत्येक एंटरॉइड /बीएमएम स्मीयर पर चरण 3.9 से विशिष्ट 20% सीरम के 100 μL को पाइप करके 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड को 1 घंटे के लिए अवरुद्ध करें।
  11. पीबीएस में पतला क्रमशः β-कैटेनिन और जेडओ -1 प्राथमिक एंटीबॉडी के 1:100 और 1:200 कमजोर पड़ने के साथ 100 μL समाधान तैयार करें।
    नोट: प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी को एक अलग जानवर से होना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि छवि बनने पर उनके पास अलग-अलग इम्यूनोफ्लोरोसेंट चैनल होंगे। वर्तमान अध्ययन एक माउस β-कैटेनिन एंटीबॉडी और एक खरगोश जेडओ -1 एंटीबॉडी का उपयोग करता है (सामग्री की तालिका देखें)।
  12. 20% सीरम को हटाने के लिए काउंटर पर स्लाइड टैप करें और धीरे से सूखा पोंछ लें, सावधान रहें कि एंटरोइड / बीएमएम स्मीयर को बाधित न करें। 100 μL β-कैटेनिन / ZO-1 प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान एंटरोइड / बीएमएम स्मीयर में से एक पर। प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना पीबीएस का पिपेट 100 μL एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में दूसरे एंटरोइड / बीएमएम स्मीयर पर।
  13. ह्यूमिडिफ़ायर कंटेनर बनाने के लिए गीले पेपर तौलिया के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर के निचले हिस्से को पंक्तिबद्ध करें। कंटेनर में स्लाइड रखें, सावधान रहें कि एंटरॉइड / बीएमएम स्मीयर को कवर करने वाले समाधानों को बाधित न करें। सील करने के लिए कंटेनर पर ढक्कन रखें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सपाट स्टोर करें।
    नोट: स्लाइड को सूखने न दें। सुनिश्चित करें कि निर्जलीकरण से बचने के लिए कंटेनर बंद है।
  14. आगे बढ़ने के लिए तैयार होने के बाद, एंटरॉइड / बीएमएम स्मीयर से प्राथमिक एंटीबॉडी और पीबीएस को हटाने के लिए काउंटर पर स्लाइड टैप करें।
  15. स्लाइड को एक धुंधला जार में रखकर और पीबीएस के 30 एमएल से भरकर या जब तक पीबीएस एंटरॉइड / बीएमएम स्मीयर को कवर नहीं करता है, तब तक एक वॉश स्टेप करें। इसे कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए छोड़ दें। पीबीएस को छोड़ दें और कुल तीन धोने के लिए इस चरण को दो बार दोहराएं।
  16. दो अलग-अलग इम्यूनोफ्लोरोसेंट चैनलों के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के 200 μL तैयार करें, जिसमें प्रत्येक एंटीबॉडी में पीबीएस में 1: 1000 कमजोर पड़ने हो ( सामग्री की तालिका देखें)। घोल को प्रकाश से दूर रखें।
  17. बीएमएम स्मीयर में से प्रत्येक पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान का 100 μL। इसे अंधेरे में रखें और इसे आरटी पर 1 घंटे तक बैठने दें।
  18. द्वितीयक एंटीबॉडी को हटाने के लिए काउंटर पर स्लाइड टैप करें। चरण 3.15 में उल्लिखित धोने के चरणों को दोहराएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी धुले अंधेरे में किए गए हैं।
  19. प्रत्येक एंटरॉइड/बीएमएम स्मीयर में 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई के साथ फ्लोरोशील्ड, सामग्री की तालिका देखें) की एक बूंद जोड़ें और यह सुनिश्चित करने के लिए एक कवरस्लिप लागू करें कि दोनों स्मीयर पर्याप्त रूप से कवर किए गए हैं। कवरस्लिप के नीचे बुलबुले को फंसाने से बचें। माइक्रोस्कोप के नीचे देखने के लिए तैयार होने तक स्लाइड को अंधेरे में रखें।
    नोट: स्लाइड्स की तत्काल इमेजिंग सबसे इष्टतम परिणाम देती है; हालांकि, स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर कंटेनर में फ्लैट संग्रहीत किया जा सकता है और डीएपीआई को जोड़ने के बाद 1 सप्ताह तक छवि बनाई जा सकती है।

4. प्रायोगिक एनईसी का प्रेरण

  1. सुनिश्चित करें कि एओ एंटरोइड्स उपयोग से पहले कम से कम 72 घंटे के लिए निलंबन में रहे हैं।
  2. धीरे से प्रत्येक कुएं से सभी एंटरोइड / मीडिया निलंबन को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें।
    नोट: यदि कुओं की एक बड़ी मात्रा का इलाज किया जाता है तो कई कुओं को एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए प्रति उपचार समूह कम से कम तीन कुओं की सिफारिश की जाती है।
  3. आरटी में 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
  4. लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस, सामग्री की तालिका देखें) के 500 μL को प्रति कुएं 50% LWRN CM (अंतिम सांद्रता 100 μg / mL LPS) के 500 μL जोड़ें।
  5. 50% एलडब्ल्यूआरएन + एलपीएस में उपचार समूह के रूप में नामित एओ एंटरोइड्स और 24-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में निलंबन के 500 μL एलिकोट। 50% एलडब्ल्यूआरएन सीएम प्रति कुएं के 500 μL में अनुपचारित नियंत्रण के रूप में नामित एओ एंटरोइड्स को पुन: निलंबित करें। इस निलंबन के 500 μL को एक अलग 24-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में बदलें।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1% ओ 2, 5% सीओ 2, और 94% एन 2 के साथ मॉड्यूलर इनक्यूबेटर चैंबर (एमआईसी) के माध्यम से एलपीएस-उपचारित एओ एंटरोइड्स में हाइपोक्सिया को प्रेरित करें (सामग्री की तालिका देखें)। 24 घंटे के लिए हाइपोक्सिया और एलपीएस के साथ एंटरोइड्स का इलाज करें।
  7. अनुपचारित और एलपीएस + हाइपोक्सिया-उपचारित संस्कृतियों को, अभी भी एमआईसी कक्ष में, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में24 घंटे के लिए रखें।

5. एलवाई का उपयोग करके पैरासेल्युलर पारगम्यता का मापन

  1. धीरे से प्रत्येक कुएं से एंटरॉइड / मीडिया निलंबन को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म डीपीबीएस और 50% एलआरडब्ल्यूएन सीएम।
  2. आरटी पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर एंटरोइड / मीडिया निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. मीडिया को हटा दें। एंटरोइड्स को गर्म 500 μL DPBS के साथ धो लें।
  4. RT पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज. एक माइक्रोपिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें.
  5. चरण 5.3-5.4 को कुल दो बार दोहराएं।
  6. धोने के बाद, 450 μL गर्म 50% LWRN CM जोड़ें (जैसा कि चरण 1.3 में तैयार किया गया है)।
  7. प्रत्येक कुएं में 2.5 mg/mL LY का 50 μL जोड़ें (अंतिम सांद्रता 0.25 μg/μL है, सामग्री की तालिका देखें) और मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे घुमाएं। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  8. धीरे से प्रत्येक कुएं से एंटरॉइड / मीडिया निलंबन को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें।
  9. आरटी में 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज, फिर एंटरॉइड पेलेट को पीछे छोड़ते हुए सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  10. एंटरोइड्स को 500 μL गर्म DPBS के साथ धो लें।
  11. आरटी में 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, फिर एंटरॉइड पेलेट को पीछे छोड़कर सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  12. चरण 5.10-5.11 को कुल चार धोने के लिए तीन बार दोहराएं।
  13. प्रत्येक गोली को 1,000 μL ठंडे DPBS के साथ पुन: निलंबित करें और एंटरोइड्स को अलग करने के लिए सख्ती से ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  14. डीपीबीएस (100 एनजी/एमएल; 50 एनजी/एमएल; 25 एनजी/एमएल; 12.5 एनजी/एमएल; 6.25 एनजी/एमएल; 3.13 एनजी/एमएल; 1.57 एनजी/एमएल; 0 एनजी/एमएल) में पतला एलवाई मानक वक्र के लिए मानक तैयार करें।
  15. पिपेट 96-वेल प्लेट पर तीन प्रति कुएं में प्रत्येक नमूने का 150 μL।
  16. प्रतिदीप्ति पढ़ने में सक्षम प्लेट रीडर पर 428 एनएम के उत्तेजना शिखर और 536 एनएम के उत्सर्जन शिखर पर प्रतिदीप्ति को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)। सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), मानक वक्र को इंटरपोल करके और चार-पैरामीटर वक्र का उपयोग करके सांद्रता की गणना करें।

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Representative Results

एओ रचना
72 घंटे के लिए 50% एलडब्ल्यूआरएन मीडिया में निलंबित एंटरोइडएक एओ अनुरूपता ग्रहण करते हैं (चित्रा 1)। इसकी पुष्टि इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के माध्यम से एपिकल प्रोटीन, ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स -1 (जेडओ -1), और बेसोलेटरल प्रोटीन, β-कैटेनिन (चित्रा 1) के एंटरॉइड पूरे माउंट का उपयोग करके की गई थी। एओ एंटरोइड एंटरॉइड की बाहरी, एपिकल सतह पर जेडओ -1 (हरा) दिखाते हैं, जबकि β-कैटेनिन (लाल) आंतरिक, बेसोलेटरल सतह पर होता है (चित्रा 1 ए)। बीओ एंटरोइड्स बाहरी सतह पर β-कैटेनिन (लाल) और आंतरिक, ल्यूमिनल सतह पर जेडओ -1 (हरे) के साथ व्युत्क्रम प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 1 बी)। ये परिणाम यह पुष्टि करने के लिए अपेक्षित ध्रुवीयता रिवर्सल दिखाते हैं कि प्रयोग से पहले एंटरोइड एओ हैं।

एलवाई परख परिणाम
एंटरॉइड लुमेन में एलवाई डाई के बढ़े हुए उत्थान से प्रदर्शित बढ़ी हुई पारगम्यता, एनईसी6 में अपेक्षित है। एलपीएस और हाइपोक्सिया के साथ इलाज किए गए बीओ एंटरोइड्स ने इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक का उपयोग करके अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में काफी बढ़ी हुई पारगम्यता दिखाई (चित्रा 2 ए, ** पी = 0.005)। यह उस साहित्य से सहमत है जिसने एनईसी 4,13 के बीओ एंटरॉइड मॉडल में बढ़ी हुई पारगम्यता का वर्णन किया है। इसी तरह, एलपीएस और हाइपोक्सिया के साथ इलाज किए गए एओ एंटरोइड्स ने अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में काफी बढ़ी हुई पारगम्यता का प्रदर्शन किया, जैसा कि एनईसी मॉडल (चित्रा 3 ए, * पी = 0.02) में अपेक्षित है। उपचारित एओ एंटरोइड्स ने अनुपचारित नियंत्रणों (चित्रा 3 बी) की तुलना में इलाज किए गए एंटरोइड्स (चित्रा 3 सी) के लुमेन में एलवाई के तेज में वृद्धि दिखाई। यह बीओ एंटरोइड्स में देखे जाने के समान है, जहां एलवाई को एंटरॉइड लुमेन (चित्रा 2 बी) में देखा जाता है। एंटरॉइड के लुमेन में एलवाई डाई अपटेक में वृद्धि के परिणामस्वरूप इलाज किए गए एंटरोइड्स में प्रतिदीप्ति में वृद्धि होती है, जिससे विभिन्न कुओं से एओ एंटरोइड्स का उपयोग करके माइक्रोप्लेट रीडर के माध्यम से मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति मिलती है (चित्रा 3 ए)। यह दर्शाता है कि एलवाई का उपयोग करके इस तकनीक का उपयोग 3 डी एंटरोइड्स में पारगम्यता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। उपचार समूहों की एलवाई सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र को इंटरपोल करने में सक्षम सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण किया जा सकता है। एक छात्र का टी-टेस्ट, जैसा कि चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है, समूहों के बीच महत्व निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: एओ अनुरूपता का सत्यापन। (ए) एपिकल-आउट (एओ) एंटरॉइड (बी) बेसोलेटरल आउट (बीओ) एंटरोइड की तुलना में रिवर्स पोलैरिटी दिखाता है, जो 20x आवर्धन पर पारंपरिक ध्रुवीयता दिखाता है, स्केल बार 100 μm पर सेट होता है। DAPI, नीला; बीटा-कैटेनिन (बेसोलेटरल प्रोटीन), लाल; ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स -1 (एपिकल प्रोटीन), हरा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एलवाई परख द्वारा मापा गया इन विट्रो एनईसी प्रेरण के बाद बीओ एंटरॉइड मॉडल में बढ़ी हुई पारगम्यता। (ए) एलपीएस और हाइपोक्सिया-उपचारित बेसोलेटरल-आउट एंटरोइड्स ने लूसिफर पीले परख का उपयोग करके अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में पारगम्यता में काफी वृद्धि की है; त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि दिखाती हैं; ** पी = 0.005। (बी) 10x आवर्धन, 300 μm स्केल बार पर लूसिफर पीले डाई के साथ मीडिया के उपचार के बाद लुसिफर पीले रंग के साथ बेसोलेटरल-आउट एंटरोइड्स की छवि को लुमेन में देखा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एलवाई परख द्वारा मापा गया इन विट्रो एनईसी प्रेरण के बाद एओ एंटरॉइड मॉडल में बढ़ी हुई पारगम्यता। (ए) एलपीएस और हाइपोक्सिया-उपचारित एपिकल-आउट एंटरोइड्स ने लूसिफर पीले परख का उपयोग करके अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में पारगम्यता में काफी वृद्धि की है; त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि दिखाती हैं; * पी = 0.02। (बी) 10x पर अनुपचारित नियंत्रण एपिकल-आउट (एओ) एंटरॉइड की एक प्रतिनिधि छवि; स्केल बार को 100 μm पर सेट किया गया है। (C) एलवाई के साथ एलपीएस और हाइपोक्सिया-उपचारित एओ एंटरॉइड की एक प्रतिनिधि छवि को 10x पर लुमेन में देखा जाता है; स्केल पट्टी 100 μm पर सेट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले समाधान, बफर और मीडिया की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

आंतों की पारगम्यता उपकला बाधा समारोह का जटिल और प्रतिबिंबित है। आंतों की बाधा में उपकला कोशिकाओं की एक एकल परत शामिल होती है जो ट्रांससेलुलर और पैरासेलुलर परिवहन की मध्यस्थता करतीहै। पैरासेल्युलर पारगम्यता तंग जंक्शन प्रोटीन पर निर्भर करती है जो उपकला कोशिकाओं के बीच की जगह को सील करतीहै। इस पैरासेलुलर परिवहन के भीतर, तीन अलग-अलग मार्ग हैं जिनके द्वारा अणु पार कर सकते हैं: छिद्र, रिसाव और अप्रतिबंधित15। छिद्र मार्ग छोटे आवेशित आयनों के लिए पारगम्यता की अनुमति देता है, जबकि रिसाव मार्ग15 में बड़े, अनचार्ज अणुओं की अनुमति देता है। तीसरा, अप्रतिबंधित मार्ग उपकला क्षति या मृत्यु के लिए द्वितीयक पारगम्यता कोदर्शाता है। यद्यपि कई अणुओं का उपयोग पैरासेलुलर पारगम्यता का आकलन करने के लिए किया जाता है, अणु का प्रकार और आकार प्रभावित करता है कि किस पारगम्यता मार्ग की जांच की जाएगी।

एक छोटे, हाइड्रोफिलिक अणु के रूप में, एलवाई सभी तीन पैरासेल्युलर मार्गों को पार कर सकता है, जिससे यह पैरासेल्युलर पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम उपकरण बन जाता है। इसके विपरीत, 4 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान, एक चीनी अणु जिसका उपयोग पैरासेलुलर पारगम्यता के मार्कर के रूप में किया जाता है, केवल रिसाव और अप्रतिबंधित मार्गों को पार कर सकता है। बड़ा, 70 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान सिर्फ अप्रतिबंधित मार्ग तक सीमित है। पैरासेलुलर पारगम्यता निर्धारित करने की एक और विधि ट्रांसएपिथेलियल प्रतिरोध माप (टीईईआर) के माध्यम से है, जो मोनोलेयर में विद्युत प्रतिरोध को मापती है। यह विधि केवल छिद्र मार्ग17 को मापती है। इस प्रकार, एलवाई सभी तीन मार्गों को लक्षित करके समग्र पैरासेलुलर पारगम्यता में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल पैरासेलुलर पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए एलवाई का उपयोग करके इसे भुनाता है।

एंटरॉइड मॉडल को इस प्रोटोकॉल में चुना गया था क्योंकि यह अध्ययन करने के लिए 3 डी मिनी-आंत बनाकर विवो स्थितियों में अधिक बारीकी से नकल करता है। हालांकि, पारंपरिक बीओ एंटरॉइड मॉडल के साथ चुनौती यह है कि मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन और बाद में पारगम्यता परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एपिकल सतह तक कैसे पहुंचा जाए। एओ एंटरॉइड मॉडल ध्रुवीयता को उलटकर इस चुनौती को दूर करता है जहां एपिकल सतह आसपास के मीडिया के संपर्क में है। एंटरोइड्स की एपिकल सतह तक पहुंचने के कई वैकल्पिक तरीकों का वर्णन किया गया है। इनमें आंत-चिप सिस्टम, माइक्रोइंजेक्शन, विखंडन और मोनोलेयर18,19 में बढ़ते एंटरोइड शामिल हैं। आंत-चिप प्रणालियों में प्रगति ने आंतों के वातावरण की नकल करने के लिए संवहनी और पेरिस्टलसिस के संदर्भ में ऑर्गेनोइड्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति दीहै। माइक्रोइंजेक्शन में माइक्रोमैनिपुलेटर और माइक्रोइंजेक्टर19 जैसे विशेष उपकरणों के उपयोग के माध्यम से बीओ एंटरॉइड लुमेन में इंजेक्शन शामिल है। विखंडन एकल कोशिकाओं में एंटरोइड्स के पृथक्करण का उपयोग करता है जो तब 3 डी संरचना19 में सुधार करने से पहले रोगज़नक़ के साथ मीडिया में इनक्यूबेट किए जाते हैं। एपिकल सतह के बाद के उपचार के साथ एंटरोइड्स का 2 डी मोनोलेयर में परिवर्तनभी वर्णित किया गया है। एओ एंटरॉइड मॉडल महंगे उपकरणों की आवश्यकता के बिना या एंटरॉइड की संरचनात्मक अखंडता से समझौता किए बिना एपिकल सतह को उजागर करने का एक सरल, प्रभावी तरीका प्रदान करके इन मॉडलों की कुछ कठिनाइयों को संबोधित करता है।

यद्यपि एओ मॉडल में एलवाई का उपयोग करने से मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के लिए द्वितीयक पैरासेलुलर पारगम्यता के व्यापक अध्ययन की अनुमति मिलती है, इस प्रोटोकॉल को बीओ एंटरोइड्स के साथ-साथ एलवाई के बजाय एफआईटीसी-डेक्सट्रान के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। बीओ एंटरोइड्स के लिए उपयोग किए जाने के लिए इसे संशोधित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में दो प्रमुख परिवर्तनों की आवश्यकता है। सबसे पहले, बीओ एंटरोइड्स को एलवाई जोड़ने से पहले और बाद में सभी धोने के चरणों के लिए बीएमएम गुंबदों में बनाए रखा जा सकता है। बीएमएम गुंबद के घुलनशीलता को रोकने के लिए इन धोने के चरणों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म समाधानों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, बीएमएम गुंबद को ठंडे डीपीबीएस के साथ बाधित करने और सभी धोने के चरणों के पूरा होने के बाद कुएं को पिपेट टिप के साथ स्क्रैप करने की आवश्यकता होती है ताकि विघटित एंटरोइड्स और एलवाई के पूर्ण पुन: निलंबन की अनुमति मिल सके। यदि एफआईटीसी-डेक्सट्रान को एलवाई के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है, तो 4 केडीए अणु का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह तीन पैरासेल्युलर मार्गों में से दो के माध्यम से पार करता है।

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों में एंटरॉइड के बाहर समाधान से किसी भी ट्रेस एलवाई को हटाने के लिए पर्याप्त वॉश सुनिश्चित करना शामिल है। माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करने के लिए तैयार होने तक लुमेन से एलवाई के पृथक्करण और संभावित रिलीज से बचने के लिए एंटरोइड्स को धीरे से धोना भी महत्वपूर्ण है। धोने के चरणों के दौरान गर्म समाधान का उपयोग करने से एंटरोइड्स पर तनाव भी कम हो जाता है। यदि ठंडे समाधान का उपयोग किया जाता है, तो एंटरोइड्स एपोप्टोसिस से गुजर सकते हैं, जिससे गलत परिणाम हो सकते हैं।

इस विधि की सीमाओं में एओ एंटरोइड्स को फैलाने में असमर्थता और ध्रुवीयता को उलटने के लिए आवश्यक अतिरिक्त 72 घंटे के कारण लंबे समय तक संवर्धन समय शामिल है। नियंत्रण की तुलना में इलाज किए गए एओ एंटरॉइड की संख्या में 2% -5% की कमी भी है। हालांकि यह समग्र रूप से नगण्य है, इससे परिणामों का कम आकलन हो सकता है। एलवाई का उपयोग करने की सीमाएं अन्य पारगम्यता अणुओं के समान हैं, जैसे कि 4 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान, जहां ट्रेस मात्रा ट्रांसकाइटोसिस20 के माध्यम से आंतों के उपकला अवरोध को पार कर सकती है। हालांकि यह राशि नगण्य है, यह परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इन निष्कर्षों के आधार पर, एओ एंटरोइड्स के मीडिया में एलवाई को लागू करना 3 डी मॉडल में मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से पैरासेलुलर आंत्र पारगम्यता का विश्लेषण करने का एक सुरुचिपूर्ण और अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखक इस लेख में उल्लिखित किसी भी उत्पाद या अवधारणा में कोई मालिकाना या व्यावसायिक हित की रिपोर्ट नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम रोचेस्टर मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय से एशले नेल्सन को हमारे एंटरॉइड मॉडल के साथ उनकी सहायक मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इस परियोजना के समर्थन के लिए ओकलाहोमा विश्वविद्यालय में बाल चिकित्सा सर्जरी विभाग को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ [एनआईएच ग्रांट आर 03 डीके 117216-01 ए 1], ओक्लाहोमा सेंटर फॉर एडल्ट स्टेम सेल रिसर्च, और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन ग्रांट # 20180587 द्वारा ओक्लाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय में सर्जरी विभाग को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[leu] 15-gastrin 1 Millipore Sigma G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer Corning 431752
100% LWRN conditioned media Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate Corning 3526
96-well black, clear bottom plate Greiner Bio-One 655090
A-83-01 R&D Systems 2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11032
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 Cell Signaling #D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 Cell Signaling #14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 17504-044
Barrier PAP pen Scientific Device Laboratory 9804-02
BMM (Matrigel) Corning CB-40230C
Cell Recovery Solution Corning 354270
Dissecting scissors
DMEM Thermo Fisher Scientific 11-965-118
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320-082
DPBS Thermo Fisher Scientific 14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore Sigma GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Millipore Sigma EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system Invitrogen AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Products 100-525
Fluoroshield with DAPI Millipore Sigma F6057-20mL
Forceps
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050-061
GraphPad Prism 9 Dotmatics
Insulin Thermo Fisher Scientific 12585014
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt Invitrogen L453
Modular incubator chamber Billups Rothenberg Inc. MIC101
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) Thermo Fisher Scientific 15630-080
N-Acetylcysteine Millipore Sigma A9165-5G
Nicotinamide Millipore Sigma N0636-100G
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093
SB202190 Millipore Sigma S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader Molecular devices
Tube Revolver Rotator ThermoFisher Scientific 88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate Corning 3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI) Tocris 1254

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 185
एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल में लूसिफर पीले रंग का उपयोग करके आंतों की पारगम्यता का निर्धारण करना
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Liebe, H., Schlegel, C., Cai, X.,… More

Liebe, H., Schlegel, C., Cai, X., Golubkova, A., Leiva, T., Berry, W. L., Hunter, C. J. Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model. J. Vis. Exp. (185), e64215, doi:10.3791/64215 (2022).

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