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Biology

Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

Summary

Este método cuantifica la abundancia microbiana utilizando un formato de placa de 96 pocillos para unidades formadoras de colonias de placas (UFC) y se aplica al microbioma de Drosophila en muestras de homogeneización de mosca entera. Las CFU se cuentan con un software automatizado de análisis de imágenes que se proporciona aquí.

Abstract

Los intestinos de los animales son colonizados por microbios comensales, que afectan el desarrollo, la salud y el comportamiento del huésped. La cuantificación precisa de la colonización es esencial para estudiar las complejas interacciones entre el huésped y el microbio, tanto para validar la composición microbiana como para estudiar sus efectos. Drosophila melanogaster, que tiene una baja diversidad microbiana nativa y es económica de criar con una composición microbiana definida, se ha convertido en un organismo modelo para estudiar el microbioma intestinal. El análisis del microbioma de un organismo individual requiere la identificación de qué especies microbianas están presentes y la cuantificación de su abundancia absoluta. Este artículo presenta un método para el análisis de un gran número de microbiomas de moscas individuales. Las moscas se preparan en placas de 96 pocillos, lo que permite el manejo de una gran cantidad de muestras a la vez. La abundancia microbiana se cuantifica colocando hasta 96 homogeneizados de mosca entera en una sola placa de agar en una serie de puntos y luego contando las unidades formadoras de colonias (UFC) que crecen en cada lugar. Este sistema de recubrimiento se combina con una plataforma automatizada de cuantificación de UFC, que incorpora fotografía de las placas, diferenciación de colonias fluorescentes y conteo automatizado de las colonias utilizando un complemento ImageJ. Las ventajas son que (i) este método es lo suficientemente sensible como para detectar diferencias entre los tratamientos, (ii) el método de recubrimiento puntual es tan preciso como los métodos tradicionales de recubrimiento, y (iii) el proceso de conteo automatizado es preciso y más rápido que el conteo manual. El flujo de trabajo presentado aquí permite la cuantificación de alto rendimiento de UFC en un gran número de réplicas y se puede aplicar a otros sistemas de estudio de microbiología, incluidos modelos in vitro y otros modelos de animales pequeños.

Introduction

La relación entre la microbiota intestinal y su huésped animal está cada vez más a la vanguardia de los estudios biológicos1, que muestran que la composición de la cepa del microbioma es importante para la fisiología del huésped 2,3,4. El ritmo de descubrimiento ha sido limitado por factores de confusión como la alta variación interindividual natural y la alta diversidad de bacterias colonizadoras 5,6,7. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha convertido en un modelo prometedor debido a su microbioma naturalmente de baja diversidad, facilidad de manejo y robusta genética del huésped 8,9,10,11. Las moscas pueden liberarse de gérmenes y volver a asociarse con una microbiota definida12, y se ha demostrado que la flora influye en los rasgos fisiológicos de las moscas13,14. La flora innata consiste en un conjunto limitado de bacterias que son todas cultivables, y los parientes cercanos de estos también son endógenos al intestino de los mamíferos, incluidos los lactobacilos, las proteobacterias y los enterococos15.

El estudio de la influencia del microbioma en los rasgos del huésped requiere la cuantificación del microbioma en términos de qué especies están presentes y sus abundancias absolutas16. Las formas predominantes de analizar el microbioma de la mosca son los recuentos17 de unidades formadoras de colonias (UFC), la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA9 y la qPCR del gen 16S rRNA18. Los recuentos de UFC se pueden obtener sin reactivos costosos, y confirman la viabilidad de las células bacterianas19. Las técnicas 16S, incluida la qPCR, tienen ventajas en que las identidades taxonómicas de los microbios pueden determinarse sin tener en cuenta sus requisitos de crecimiento o morfologías de colonias20.

En el caso de que los experimentos utilicen moscas con un microbioma definido de bacterias conocidas (moscas gnotobióticas), los recuentos de UFC tienen ventajas particulares sobre la secuenciación21. La secuenciación es costosa, ya que requiere extracción de ADN, preparación de bibliotecas basada en PCR y secuenciación de alto rendimiento para obtener abundancias relativas22. Debido al alto costo, los métodos de secuenciación de alto rendimiento generalmente deben realizarse a granel para reducir el precio por muestra23. Se requieren métodos adicionales como la qPCR para obtener abundancias absolutas16. En contraste, los recuentos de UFC son rápidos y baratos y dan el número absoluto de células viables. Drosophila8 y otros modelos de microbiomas pequeños 24, incluyendo el gusano, Caenorhabditis elegans 25,26, y el pez cebra larval, Danio rerio, cultivado gnotabióticamente 27, tienen una gama limitada de bacterias, que tienen características de crecimiento conocidas 28. En estos casos, particularmente con animales gnotobióticos, el conteo de UFC puede diferenciar todas las especies de bacterias dentro de las comunidades intestinales multiespecies21,27,29. Los métodos de conteo de UFC de mayor rendimiento mejorarían aún más la rentabilidad y la velocidad de medición de la composición del microbioma y podrían aplicarse a muchos otros experimentos de microbiología.

El recuento de UFC mediante el recubrimiento de dilución en serie de una suspensión bacteriana en medios de crecimiento a base de agar es un método estándar en todo el campo de la microbiología. Las colonias que crecen en las placas se cuentan manualmente. Las diluciones permiten al investigador seleccionar una densidad de colonias que sea contable (por ejemplo, ~ 100 UFC por placa), lo que significa que las colonias no están creciendo entre sí y se pueden contar en un período de tiempo razonable. La mayoría de los microbiólogos utilizan esencialmente el mismo método de conteo de UFC desarrollado hace 140 años en el laboratorio de Robert Koch, y para muchas aplicaciones, este método sigue siendo adecuado. Sin embargo, surge un problema cuando se busca cuantificar un gran número de muestras. Una sola muestra puede requerir el recubrimiento de 1 a 10 diluciones seriadas de la muestra para obtener UFC contables, por lo que los experimentos que involucran más de unas pocas docenas de muestras se vuelven agotadores. Se han desarrollado varios métodos para aumentar la eficiencia del enumeramiento de UFC. El recubrimiento en espiral automatizado elimina la necesidad de diluciones en serie30, lo que hace que solo se necesite una placa para el conteo de UFC, pero aumenta el tiempo para platear la muestra. El manchado de dilución en serie de placa única (SP-SDS) permite estimaciones de UFC a partir de menos placas por muestra31. Estos métodos son una mejora en el método tradicional de recubrimiento extendido, pero aún requieren el manejo y el recubrimiento de muestras bacterianas individualmente y, por lo tanto, no son ideales para un alto rendimiento. El manejo de muestras en placas de 96 pocillos y el recubrimiento puntual de esas 96 muestras en placas rectangulares de agar mejora en gran medida el rendimiento de las muestras19.

Los microbiomas se componen típicamente de múltiples cepas y especies. Mientras que las especies a menudo se pueden distinguir por la morfología de la colonia o los medios de crecimiento, la fluorescencia se puede emplear para distinguir aún más los diferentes tipos de bacterias y sus rasgos de crecimiento32. Por ejemplo, diferentes genotipos de la misma especie pueden ser marcados con diferentes proteínas fluorescentes codificadas genéticamente. Los métodos de imagen en placa que incorporan fluorescencia permiten a los investigadores aprovechar estas técnicas genéticas en ensayos basados en UFC32. La incorporación de fluorescencia en los métodos de conteo de UFC de alto rendimiento mejoraría aún más su utilidad.

Contar las UFC manualmente se vuelve engorroso cuando hay una gran cantidad de muestras. El conteo automatizado de UFC se puede realizar fotografiando la placa y procesando la imagen utilizando un software especializado33. Sieuwerts et al. combinaron la eficiencia mejorada del recubrimiento puntual con el conteo automatizado de colonias utilizando fotografía digital convencional y el software ImageJ19.

Un método de alto rendimiento para detectar los fenotipos de microbios específicos y asociaciones de huéspedes ayudaría a los estudios de la asamblea de la comunidad del microbioma y el impacto en la salud y el estado físico del huésped. Para los estudios del microbioma de Drosophila , una plataforma de microbiología de alto rendimiento incorporaría el manejo de muestras de moscas en formato de placa de 96 pocillos, lisis de mosca sin lisis bacteriana, la eficiencia del recubrimiento puntual, la capacidad de usar fluorescencia y distinguir múltiples fluoróforos, un entorno de luz controlado para imágenes reproducibles de placas de UFC y un software confiable de conteo automatizado de colonias. Este artículo describe un método optimizado para el ensayo de UFC en moscas gnotobióticas, que es simple, rápido y automatizado. Este protocolo describe un flujo de trabajo novedoso que combina lo mejor de los métodos publicados anteriormente y optimizado para explorar el microbioma intestinal en Drosophila.

Protocol

1. Colonización de moscas

NOTA: Este método es adecuado para el análisis cuantitativo de moscas con un microbioma intestinal cultivable mediante placas de crecimiento de UFC. Un protocolo detallado para la cría de moscas gnotobióticas ha sido publicado previamente12.

  1. Establecer una colonización estable por una especie bacteriana comensal.
    1. Preparar un cultivo bacteriano fresco, pellet por centrifugación a 400 x g durante 3 min a temperatura ambiente, y resuspender el pellet celular en PBS a un OD600 de 1.0. Para este protocolo, Lactiplantibacillus plantarum (anteriormente conocido como Lactobacillus plantarum) se cultivó durante la noche a un OD600 de 2.0.
    2. Pipetear 100 μL sobre el alimento en un vial para moscas (ver Tabla de materiales). Extienda uniformemente y deje que el líquido se absorba durante 15-30 minutos.
    3. Transfiera 20 moscas libres de gérmenes a este vial utilizando la técnica estándar de volteo de vial a vial34. Cada mosca comerá aproximadamente la misma cantidad de la dosis bacteriana35. Alternativamente, se pueden agregar huevos libres de gérmenes.
    4. Transfiera las moscas a alimentos frescos estériles diariamente durante 3 días. Haga todo esto en un gabinete de bioseguridad y use una técnica estéril (Figura 1A-1).
  2. Antes de medir la carga de UFC, transfiera las moscas a un vial que contenga agua estéril de agar durante 4 h para eliminar las bacterias transitorias del intestino. Los viales de agua de agar proporcionan una fuente de humedad para la mosca, pero no nutrientes para la mosca o las bacterias en la superficie. Se preparan en los mismos viales estériles para moscas que con los alimentos estándar, pero contienen solo agua desionizada y un 1,5% de agar.

2. Homogeneización de moscas individualmente en una placa de PCR de 96 pocillos

  1. Prepare los platos batidores de cuentas con anticipación.
    1. Vierta perlas de vidrio de 0,5 μm (consulte la Tabla de materiales) en la bandeja de medición de cuentas (impresa en 3D con la ayuda del archivo de codificación suplementario 1 S1-bead-measurer.stl). Extienda las cuentas en la bandeja para que todos los pocillos estén llenos y nivelados, y luego cepille el exceso de cuentas en un tubo cónico para recuperarlas.
    2. Coloque una placa de PCR semifalda (consulte la Tabla de materiales) boca abajo en la bandeja de medición y alinéela con los pocillos encajándola en la hendidura de la bandeja de medición. Luego, voltéelo rápidamente para transferir las cuentas.
    3. Retire el exceso de perlas de la superficie de la placa de PCR y cúbrala con papel de aluminio. Inspeccione la placa de PCR para asegurarse de que todos los pocillos contengan perlas. Use una cuchara de pesaje si es necesario para agregar cuentas a un solo pozo. Si la electricidad estática está causando que las perlas se peguen en las superficies de la placa, limpie o rocíe la parte posterior de la bandeja de medición y la placa de PCR con etanol al 70%.
    4. Cubrir con papel de aluminio. Muchas placas se pueden preparar de esta manera y luego en autoclave y almacenarse para su uso posterior. Cuando esté listo para su uso, agregue 100 μL de PBS a cada pocillo utilizando la pipeta de 96 canales (consulte la Tabla de materiales).
  2. Esterilice superficialmente las moscas colonizadas por microbios (ver paso 1) con etanol al 70% antes de la homogeneización.
    1. Anestesiar a las moscas con 100% CO2 durante 5 s. Transfiera las moscas anestesiadas del vial a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando un pequeño embudo (Figura 1A-2). En este estudio, se agregaron típicamente 25 moscas por tubo.
    2. Rocíe inmediatamente ~ 1 ml de etanol al 70% en el tubo, cierre el tubo y mezcle por inversión durante 10 s. Luego, aspire el etanol con una pipeta P1000, teniendo cuidado de no aspirar moscas. Repita una vez más con etanol, luego dos veces con PBS estéril (Figura 1A-3).
  3. Después del lavado final de PBS, cierre el tubo y, con la tapa hacia abajo, golpee con fuerza varias veces en el banco para que las moscas entren en la tapa.
  4. Abra el tubo y dispense moscas en los pozos usando fórceps (Figura 1A-4). Coloque una mosca en cada pocillo (Figura 1A-5). Mantenga el plato en hielo mientras carga para mantener a las moscas anestesiadas.
  5. Selle la placa con una lámina de sellado térmico de enlace térmico (consulte la Tabla de materiales).
    1. Primero, retire las perlas perdidas que estén cerca de los pozos, ya que pueden causar fugas en el sello de la lámina. Asegúrese de que el lado opaco de la lámina esté orientado hacia abajo en la placa y el lado brillante hacia arriba hacia el sellador térmico. Presione firmemente el termosellador (consulte la Tabla de materiales) hacia abajo durante 5 s (Figura 1A-6). Bruñir con el aplicador manual (ver Tabla de materiales) para asegurar la lámina.
      NOTA: Un sellado deficiente es una causa de pérdida de muestra.
  6. Asegure la placa en el agitador de placas. Homogeneizar durante 5 min (Figura 1A-7). Gire la placa de talón durante 30 s en un mini spinner de placas (consulte la Tabla de materiales) a 350 x g para eliminar el líquido de la lámina de sellado.
  7. Retire la lámina mientras sostiene la placa para no salpicar gotas de homogeneización de mosca fuera de los pozos.

3. Dilución en serie del homogeneizado de mosca y manchado en placas de UFC

  1. Coloque cuatro placas rectangulares de crecimiento de agar MRS (consulte la Tabla de materiales) en el gabinete de bioseguridad y retire sus tapas. En este protocolo, se utilizó agar MRS para el crecimiento de L. plantarum. Deje que estos platos se sequen durante al menos 10 minutos (20 minutos si están recién vertidos o fríos del almacenamiento).
    NOTA: Si las placas están húmedas, las gotas de la placa de 96 pocillos correrán juntas y arruinarán los recuentos.
  2. Prepare tres placas de dilución agregando 100 μL de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos utilizando un pipetor de 96 canales. Cargue un bastidor de puntas P20 en el pipete de 96 canales.
  3. Realizar una dilución 1:10 aspirando 11,1 μL de homogeneizado de la placa de muestra preparada en la sección 2 (Figura 1A-8). Asegúrese de dibujar desde el centro de los pozos en lugar del fondo de los pozos porque el homogeneizado de la mosca y las perlas de vidrio obstruirán las pipetas. Las cuentas se hunden y las partículas de la mosca flotan, dejando la capa media casi despejada.
  4. Dispensar los 11,1 μL en la primera placa de dilución, que ya contiene 100 μL de PBS estéril por pocillo. Mantenga la placa de dilución en el agitador de placas durante 10 s a 600 rpm. Mezclar de nuevo pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante cinco ciclos. Transfiera 11,1 μL de la primera placa de dilución a la segunda placa de dilución y repita los pasos de mezcla para las dos placas de dilución siguientes.
  5. Realice el recubrimiento en serie de dilución como se describe a continuación.
    1. Recupere las placas de crecimiento del gabinete de bioseguridad.
    2. Comenzando con la placa más diluida, detectar 2 μL de cada pocillo en las placas de agar utilizando la pipeta de 96 pocillos (Figura 1A-9).
      1. Baje la cabeza de la pipeta lentamente sobre el plato, teniendo cuidado de no apuñalar el agar. Examine la placa cuidadosamente y asegúrese de que se hayan dispensado todas las manchas; si no es así, agregue manualmente 2 μL a la posición apropiada. Verifique que las manchas líquidas penetren rápidamente en el agar y no corran juntas.
      2. Si las manchas corren juntas, seque un nuevo juego de placas de agar fresco durante un período más largo y vuelva a hacer el manchado. Si hay varios tipos de placas (por ejemplo, diferentes medios o con antibióticos), localícelos también. Dispense cualquier solución restante de nuevo en la placa de dilución y proceda a la siguiente concentración más alta.
        NOTA: Al detectar diluciones, mezcle la siguiente dilución cinco veces para asegurarse de que el contenido de las puntas de la pipeta se elimine de la dilución anterior. Las placas de dilución pueden almacenarse >8 h a 4 °C sin afectar al recuento de colonias35.
  6. Repita el proceso de recubrimiento como se describe en el paso 3.5 para las placas de dilución restantes, progresando de más diluido a más concentrado hasta la placa con el homogeneizado original.
  7. Cuando todo el líquido haya sido absorbido por el agar, invierta las placas y colóquelas en la incubadora (Figura 1A-10). Para Lactiplantibacillus y Acetobacter de Drosophila, la temperatura óptima es de 30 °C en medios MRS. Incubar hasta que las colonias hayan alcanzado el tamaño óptimo: las colonias son lo suficientemente grandes como para verlas claramente, pero no tan grandes como para fusionarse o interferir con el crecimiento de las demás (ver los resultados representativos para la cuantificación del tamaño óptimo).
    NOTA: Las condiciones óptimas de crecimiento dependen de la cepa y deben determinarse empíricamente. Para Lactiplantibacillus de Drosophila, el tiempo óptimo de incubación es de 26 h a 30 h en agar MRS. Para Acetobacter de Drosophila, el tiempo óptimo de incubación es de 30 h a 48 h en MRS dependiendo de la cepa.
  8. Después de la incubación, conservar las placas a 4 °C si es necesario hasta que estén listas para el recuento.

4. Cuantificación de las UFC

  1. Cuantifique las UFC fotografiando las placas y luego contando las colonias utilizando un software automatizado, como se detalla a continuación. Si las placas se almacenaron a 4 °C, primero déjelas alcanzar la temperatura ambiente para que no haya condensación en las placas, lo que produce deslumbramiento.
  2. Organice las placas en una secuencia lógica y manténgalas en ese orden mientras fotografía: facilita el nombre de los archivos. Oriente todas las placas de modo que A1 esté en la esquina superior izquierda de todas las placas. Se recomienda etiquetar la esquina A1 con una identificación única para garantizar que no haya confusión de las fotos. Apile cada serie de dilución en orden.
  3. Retire la tapa de la placa y coloque la placa en el escenario con A1 orientado en la esquina correcta. Se incluyen diseños para la caja de fotos de la placa (Archivo suplementario 1, Archivo complementario 2), que está optimizada para fotografiar estas placas de bandeja e incluye opciones de iluminación y filtro para obtener imágenes de colonias fluorescentes.
  4. Imagen de las placas. Utilice la cámara (consulte Tabla de materiales) con ajustes manuales para lograr un nivel de exposición constante entre placas. Se recomienda un ajuste de distancia focal larga para minimizar la distorsión de la perspectiva. Captura la foto con un obturador remoto para minimizar el desenfoque del movimiento de la cámara.
  5. Transfiera las imágenes a una computadora y cámbieles el nombre, incluido el nombre del experimento, el tipo de medio, el factor de dilución y cualquier otro detalle pertinente. Algunos sistemas operativos (consulte Tabla de materiales) tienen una útil función de cambio de nombre por lotes en el Finder haciendo clic con el botón derecho en una selección de archivos.

5. Conteo automatizado de colonias usando la suite Count-On-It (Archivo Suplementario 3)

  1. Recorte las imágenes utilizando el complemento Croptacular proporcionado (Archivo de codificación suplementario 2) para ImageJ. Este complemento ayuda a dividir la imagen en una matriz ordenada de subregiones (por ejemplo, 8 x 12 para una placa de 96 pocillos). Las subregiones se contabilizarán individualmente.
    NOTA: Un complemento separado para contar placas circulares llamado Circus se describe en el Archivo de codificación suplementaria 3 Circus_.ijm.
    1. Organice las imágenes que se procesarán para su cuantificación en una carpeta. Elija nombres de archivo que distingan las placas, ya que estos nombres de archivo se convierten en títulos de columna para cada conjunto de recuentos. Dentro de esta carpeta, cree subcarpetas denominadas "recortado" y "recibos".
    2. Inicie Croptacular y haga clic en Aceptar para comenzar a recortar.
      NOTA:Se muestran los valores predeterminados y suelen ser suficientes. Dependiendo de la resolución de la imagen, la iluminación, el tamaño del punto, etc., puede ser útil ajustar los parámetros base.
    3. Si la imagen ya está recta, simplemente presione Espacio. De lo contrario, endereza la imagen dibujando una línea a lo largo de un borde que debería volverse horizontal. Vuelva a dibujar la línea tantas veces como sea necesario si la imagen aún no aparece enderezada.
    4. A continuación, dibuje un cuadro de límite del área para la cual se debe realizar el conteo. Ajuste el tamaño y la proporción hasta que todas las manchas estén dentro de sus celdas. Arrastre el cursor fuera del cuadro de límite para actualizar la cuadrícula. Cuando la cuadrícula se vea bien, presione Espacio.
    5. Asegúrese de que la siguiente imagen gire automáticamente al mismo ángulo que la primera; El plugin asume que todas las fotos están alineadas de la misma manera. Si esto es correcto, presione Espacio para continuar. De lo contrario, endereza la imagen como antes. La cuadrícula también recuerda la misma posición que la imagen anterior; ajuste si es necesario y, a continuación, presione Espacio.
  2. Enumere las colonias en las placas utilizando el complemento Count-On-It: Gridiron proporcionado para ImageJ (Archivo de codificación suplementario 4). Las instrucciones detalladas para instalar y usar el complemento se incluyen en el Archivo complementario 3.
    1. Inicie Count-On-It > Gridiron. Utilice la misma configuración de cuadrícula que con Croptacular. Los usuarios pueden agrupar por lotes una carpeta completa, analizar una sola imagen o comenzar desde la imagen actual.
    2. Establezca el umbral en función de un valor de intensidad de píxeles superior e inferior. Haga que el umbral sea lo más estricto posible mientras se seleccionan todas las colonias. Idealmente, habrá algo de espacio entre las colonias seleccionadas, pero el software es capaz de segmentar las manchas hasta cierto punto. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo "Acción requerida" cuando el umbral sea satisfactorio.
    3. Para inspeccionar los resultados, amplíe y observe más de cerca los recuentos de colonias. Al hacer clic en cancelar, se abortará el complemento. Haga clic en Aceptar para continuar.
    4. En la primera imagen, asegúrese de que se da la opción de continuar o volver al menú de configuración, por ejemplo, para cambiar el tamaño mínimo de la colonia. Para continuar con el proceso por lotes, haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione una carpeta para mantener la tabla de recibos y resultados. Utilice la carpeta "recibos" o cree una nueva carpeta.
    5. Después de la primera imagen, las siguientes imágenes tendrán por defecto el mismo umbral que la configuración anterior. Haga clic en Aceptar para utilizar esta configuración o ajustarla. Si las fotos son coherentes y la configuración es precisa, haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo "Acción requerida".
      NOTA: Una vez completadas todas las imágenes del lote, la tabla de resultados se guarda automáticamente en la misma carpeta que los recibos.
    6. Revise los recibos de recuento producidos por el software y corrija manualmente cualquier error de conteo. El complemento ImageJ es estadísticamente preciso, pero se producen errores. Pruebe los recibos para examinar los valores atípicos e identificar los errores de conteo. El software guarda los datos de CFU como un archivo .csv en la misma carpeta que los recibos.
  3. Analice los datos utilizando el software preferido por el usuario.

Representative Results

Enumeración de UFC en cientos de moscas individuales en formato de placa de 96 pocillos mediante ensayo de colonización
Para comprender la composición de muchos microbiomas de moscas individuales, las UFC se midieron utilizando el protocolo adjunto, que permitió la identificación de las especies presentes, el porcentaje de moscas colonizadas y la abundancia absoluta de bacterias en cada mosca. Las razones de la gran variación observada de individuo a individuo en la composición del microbioma son poco conocidas, y cuantificar la distribución estadística de la colonización puede ayudar a estudiar esta variación36,37. Para obtener un número significativo de réplicas biológicas, se desarrolló una tubería de alto rendimiento para la cuantificación de la abundancia de microbios en muchas moscas individuales utilizando recuentos de UFC (Figura 1A).

La cuantificación final de las UFC puede verse afectada por la forma en que se manejan las moscas antes del análisis, por ejemplo, factores que incluyen la esterilización de la superficie, el tiempo transcurrido desde el consumo de bacterias y la eliminación de bacterias transitorias del intestino. Primero, centrándose en la especie bacteriana Comensal de Drosophila L. plantarum (Lp; ver cepa Lp WF en Obadia et al.36), las moscas fueron alimentadas con una dosis de ~105 UFC de Lp y mantenidas en grupos de 25 moscas por vial. Estas moscas se mantuvieron en el mismo vial durante 3 días o se transfirieron diariamente (transferidas) a alimentos frescos y estériles (Figura 1B). Las moscas no transferidas se lavaron en etanol para eliminar las bacterias de la superficie (lavadas) o no lavadas (sin lavar). El lavado produjo una reducción no significativa en el total de UFC medidas (Figura 1B), lo que indica que bajo estas condiciones de inoculación altamente controladas, la superficie de la mosca no se coloniza significativamente por bacterias en 3 días. Los otros grupos de moscas se transfirieron todos los días para reducir la acumulación de bacterias del crecimiento en los alimentos (Transferred); además, un grupo fue transferido a alimentos frescos durante 4 h antes del muestreo (Post-Transferido), o se colocaron en viales con solo agua estéril de agar durante 4 h (Cleared) para permitir que los microbios ingeridos transitoriamente se eliminen del intestino. Cada uno de estos pasos para proporcionar una medición de colonización más estricta produjo una reducción estadísticamente significativa en la abundancia de UFC en las moscas, con la excepción del lavado superficial en etanol. La transferencia a alimentos estériles (post-transferido) o agua de agar (despejada) durante 4 h antes de la medición produjo efectos indistinguibles, lo que indica que la transferencia a condiciones estériles 4 h antes de la medición reduce la carga bacteriana. Este resultado es consistente con la interpretación de que algunas bacterias intestinales en el intestino de la mosca son transitorias, mientras que otras están asociadas de manera más estable35. La abundancia de Lp varió de 1 x 10 4.3 UFC/mosca en moscas despejadas a 1 x 104.9 UFC en las moscas sin lavar (n = 724 moscas).

A continuación, se realizó el mismo ensayo utilizando Acetobacter indonesiensis (Ai), una bacteria gramnegativa que coloniza el intestino de la mosca (Figura 1C; ver cepa Ai SB003 en Obadia et al.36). Al igual que con las moscas colonizadas por Lp, la esterilización superficial produjo una reducción no significativa de las UFC. Del mismo modo, la transferencia diaria a alimentos estériles redujo significativamente la carga bacteriana, y la transferencia a condiciones estériles durante 4 h antes de la homogeneización produjo una reducción adicional en la carga bacteriana. La abundancia de Ai varió de 1 x 104.7 UFC/mosca en moscas despejadas a 1 x 105.0 UFC en las moscas sin lavar (n = 528 moscas). Por lo tanto, la cuantificación precisa de las bacterias intestinales depende de la frecuencia de transferencia, incluido el día de la transferencia. La eliminación de la carga bacteriana externa mediante el lavado en etanol tuvo un efecto no significativo, pero se pueden observar efectos más significativos para diferentes cepas de bacterias o diferentes condiciones de cultivo. Estos factores deben ser controlados experimentalmente.

También se probó el efecto potencial del método de homogeneización sobre los recuentos de UFC. Las moscas se homogeneizaron utilizando un batidor de cuentas con perlas de vidrio de 0,5 μm en 100 μL de PBS, lo que podría reducir la viabilidad de las células bacterianas. Primero, se preparó una suspensión de bacterias Lp del cultivo en PBS y luego se colocó en placas para contar las UFC como un control positivo. El mismo cultivo se colocó en la placa batidora de perlas y (i) se homogeneizó con perlas, (ii) se homogeneizó con perlas y una mosca libre de gérmenes, o (iii) se homogeneizó en PBS sin perlas (Figura 1D). La homogeneización en perlas cuando una mosca estaba presente no afectó significativamente la abundancia de células viables en solución, mientras que la homogeneización de bacterias en ausencia de una mosca mató a un número significativo de células bacterianas. La homogeneización en PBS sin perlas también redujo significativamente el número de células viables. Del mismo modo, la viabilidad de Ai se preservó cuando se homogeneizó en presencia de una mosca, mientras que la homogeneización sin una mosca redujo el número de células viables en solución (Figura 1E). Estos resultados indican que el tejido de la mosca protege a las bacterias de ser destruidas por las perlas durante la homogeneización. Sin embargo, los experimentos en la Figura 1D y la Figura 1E se realizaron con más de 108 UFC por pocillo. En la práctica, se encontró que los pozos con ~10 6 células por pocillo o menos mostraban poca pérdida de células cuando se usaban perlas sin una mosca. Enfriar la placa en hielo a la mitad del batido de cuentas también mejora la viabilidad celular. La importancia de estos resultados es que los lectores deben ser conscientes de estos problemas potenciales y diseñar controles apropiados para su caso de uso específico.

Precisión del recubrimiento puntual de placas de 96 pocillos para la cuantificación de UFC de alto rendimiento
Dado que el objetivo es medir las abundancias de UFC para cientos a miles de moscas individuales, los métodos tradicionales de recubrimiento extendido son prohibitivamente intensivos en tiempo y material. El recubrimiento puntual es un método eficaz y eficiente para el crecimiento y la enumeración de UFC19,31. El método de recubrimiento por puntos utiliza una pipeta de 96 canales para dispensar 2 μL de suspensión bacteriana en medios preparados en placas de bandeja rectangulares (Figura 2A). Cada punto representa la carga bacteriana de una sola muestra, por lo que se pueden analizar 96 moscas con una sola placa (Figura 2B). La precisión del recubrimiento puntual se comparó con el recubrimiento tradicional mediante la inoculación de placas de crecimiento utilizando exactamente la misma suspensión de 0,0001 OD de Lp para ambos métodos. La suspensión se diluyó en serie cinco veces en PBS. Como comparación directa, 50 μL del inóculo se extendieron sobre placas redondas individuales, o se hicieron puntos de 2 μL en placas MRS rectangulares. Las placas se incubaron a 30 °C hasta que las colonias fueran contables. Los recuentos de UFC resultantes para cada dilución se utilizaron para calcular la concentración original de la suspensión y se compararon (Figura 2C). Las placas redondas con 50-500 UFC se contaron como control. No se observaron diferencias significativas entre los métodos de recubrimiento redondo tradicionales y de alto rendimiento.

Como la densidad de colonias puede afectar su crecimiento y cuantificación, se probó el efecto de la densidad de UFC en los recuentos finales. Las manchas con 2 a 25 colonias por mancha no mostraron diferencias en el recuento final en comparación con el método tradicional de placa redonda (Figura 2C). Las manchas con un promedio de 35 colonias produjeron resultados ligeramente sesgados que las placas de propagación de control (Figura 2C; p = 0,0017). Un examen detallado de las fotografías de manchas individuales indicó que este sesgo se debía a que las colonias se superponían en lugares densos. Las mediciones basadas en manchas con un promedio de 11 colonias por mancha dieron como resultado concentraciones más cercanas a las basadas en las placas extendidas (Figura 2C; Placas extendidas: media = 1 x 104,4 UFC; DE = 0,086 vs. manchas con 11 colonias promedio: media = 1 x 104,4 UFC; SD = 0,12, p = 0,42, prueba t de Welch).

Generación de imágenes de alta calidad para cuantificación utilizando una plataforma fotográfica especializada con luz blanca o fluorescencia
El recubrimiento puntual de alto rendimiento genera naturalmente una gran cantidad de áreas objetivo, que deben contarse con precisión. Las fotografías de calidad se pueden utilizar para documentar los datos y facilitar el conteo de UFC. Se desarrolló una plataforma fotográfica robusta y sencilla utilizando materiales disponibles comercialmente (Figura 3A). Una cámara digital estaba unida a un soporte en la parte superior de una caja de luz hecha a medida, llamada FluoroBox, y apuntaba directamente hacia abajo, perpendicular al centro de la placa. Un filtro de emisión de color se colocó opcionalmente delante de la lente utilizando un control deslizante de filtro. Un escudo de luz evitó el destello de la lente al bloquear la luz directa de las tiras de LED a continuación. Las tiras de LED iluminaban la placa desde los lados, en lugar de arriba, para evitar el deslumbramiento en la placa. Además de la luz blanca, se utilizaron LED azules y verdes de un solo color para excitar las proteínas fluorescentes verdes y rojas, respectivamente. La placa se mantuvo en su lugar mediante un soporte de placa en el cajón, y el cajón estaba equipado con controles deslizantes de cajón para facilitar la inserción de la placa. Los diseños completos están disponibles en el Archivo Suplementario 1 y en el Archivo Suplementario 2.

Se tomó una foto de una placa puntual de colonias de Lp utilizando LED de luz blanca y una cámara digital para ayudar a contar colonias y distinguir diferentes colores y morfologías (Figura 3B). Para validar que la intensidad de la iluminación era uniforme, se midió la intensidad de fondo del agar en diferentes regiones de una fotografía de placa (Figura 3C). Para demostrar que las colonias se pueden distinguir claramente del fondo, se midió la intensidad a través del diámetro de 10 colonias diferentes en diferentes partes de la placa y se encontró que era aproximadamente ~ 300% más alta que el fondo (Figura 3C). La placa se inoculó con Lp con un plásmido expresador de proteína fluorescente mCherry, así como algo de Lp que no contenía el plásmido, por lo que las colonias eran mCherry-positivo o mCherry-negativo. Para distinguir estos dos tipos de colonias, la placa fue fotografiada usando la misma cámara con luz LED verde (515-525 nm) y un filtro rojo (Tiffen #29), causando que las colonias mCherry-positivas emitan fluorescencia (Figura 3D). La diferencia de intensidad entre mCherry-positivo y mCherry-negativo se cuantificó midiendo la intensidad en una muestra de colonias (n = 10 colonias). Las colonias mCherry-positivas fueron ~1,000% más intensidad que mCherry-negativo (Figura 3E). Las colonias de Ai que expresan GFP y las colonias de Ai que no expresan fluorescencia fueron fotografiadas usando luces LED azules (465-475 nm) y un filtro verde (Tiffen #58) (Figura 3F). Las colonias GFP positivas mostraron una intensidad 200% mayor que las GFP negativas (Figura 3G).

Conteo automatizado de UFC en placas puntuales utilizando el complemento personalizado de ImageJ Count-On-It
Las fotos por sí solas ayudan a contar colonias (por ejemplo, almacenando los datos, compartiendo los datos, ampliando, marcando una superposición, separando colores, etc.). Sin embargo, el acto de contar y organizar manualmente los resultados de cientos de puntos puede ser tedioso, lento y propenso a diferencias de persona a persona en los recuentos finales. Para acelerar el proceso de conteo y estandarizar la reproducibilidad de los recuentos, se desarrolló un complemento especializado de ImageJ llamado Count-On-It (Figura 4A). Este plug-in permite un conteo semiautomático preciso de UFC en placas de agar. El usuario prepara las imágenes para el conteo recortándolas primero y enderezándolas utilizando el complemento Croptacular adicional. Las fotos se pueden procesar opcionalmente por lotes y el umbral se puede ajustar para cada placa. Varias otras opciones permiten al usuario aumentar la precisión del conteo de placas, incluido el ajuste de las longitudes de onda de la luz (imágenes RGB), el establecimiento de un rango de tamaño de colonia (en píxeles), el cambio de la relación de aspecto máxima y la personalización de las dimensiones de la cuadrícula de selección activa. Count-On-It genera una tabla de resultados con cada placa representada como una columna de recuentos de UFC. También genera un recibo fotográfico que muestra una superposición para documentar visualmente sus resultados de conteo y ayudar en la corrección manual de errores (Figura 4B). Si bien ocurren errores, cuando el número de colonias contadas manualmente se comparó con el número de colonias contadas usando este complemento (Figura 4C), la relación fue generalmente equivalente, con regresión lineal entre los recuentos manuales y automatizados que mostraron una pendiente de 0.95 con más del 90% de precisión (R2 = 0.93), aunque el error aumentó cuando el número de colonias excedió 20.

Count-On-It también se puede utilizar para contar por separado las colonias fluorescentes utilizando la función de fluorescencia del FluoroBox. Los recuentos de colonias mCherry-positive (Figura 4D) por complemento de software versus manual tuvieron un R2 de 0.92 (Figura 4E). De manera similar, las colonias positivas para GFP (Figura 4F) contadas con plug-in de software versus manual tuvieron un R2 de 0.90 (Figura 4G). Las colonias fluorescentes frente a las no fluorescentes se pueden distinguir dentro de una sola muestra, y el tamaño y la forma de la colonia también se pueden usar para distinguir subpoblaciones separadas (Figura 4H-K). Los recibos con foto proporcionan un registro que permite al usuario verificar rápidamente la precisión de los recuentos y corregir manualmente los errores. En la Figura 4C,E,G,I,K, los recibos fotográficos no se han utilizado para mejorar la precisión del conteo para que los lectores puedan ver la salida sin procesar del método. Casos como en la Figura 4G, donde un recuento manual de 1 arrojó un recuento automático de 21, se pueden detectar rápidamente utilizando los recibos de fotos. En este caso, el resplandor en el borde de la placa creó manchas que se contaron como colonias. Para cada caso de uso, la configuración óptima para el complemento de software debe determinarse antes de un recuento de alto rendimiento.

Figure 1
Figura 1: El ensayo de colonización mide las UFC en cientos de moscas individuales utilizando un formato de placa de 96 pocillos. (A) Resumen gráfico del ensayo de colonización y el método de cuantificación de alto rendimiento utilizado como se describe en la sección del protocolo. (B) La abundancia de Lactiplantibacillus plantarum (Lp) en moscas después del ensayo de colonización se midió en condiciones variables utilizando el método de cuantificación de UFC de alto rendimiento. Las moscas se mantuvieron en el mismo vial durante 3 días y luego se homogeneizaron y se colocaron en placas (sin lavar), se lavaron en etanol antes del recubrimiento (lavadas), se lavaron y transfirieron todos los días (transferidas), se transfirieron diariamente y luego se mantuvieron en alimentos estériles antes del emplatado (posttransferidas) o se mantuvieron en viales con solo agua durante 4 h (eliminadas) (n = 724 moscas en total, 3 réplicas biológicas y ~ 72 moscas en total por tratamiento). (C) El mismo ensayo que en (B) se realizó utilizando Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 moscas). (D) La suspensión bacteriana de Lp se preparó en PBS y luego se colocó en placas para contar UFC o se homogeneizó primero mediante batido de perlas, se batió con perlas en combinación con una mosca libre de gérmenes (GF) o se agitó en el batidor de cuentas sin perlas o una mosca (n = 236 pocillos de muestra). (E) La viabilidad de Ai después de la homogeneización se probó de la misma manera que en (D) (n = 282 pozos de muestra). La significación estadística para los paneles (B-E) se calculó utilizando una prueba de Kruskal-Wallis seguida de pruebas de suma de rangos de Wilcoxon por pares con la corrección de comparaciones múltiples de Bonferroni. Box da rango intercuartílico. La línea indica la mediana. Los bigotes dan un rango total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Precisión del recubrimiento puntual de placas de 96 pocillos para la cuantificación de UFC de alto rendimiento. A) Recubrimiento puntual con una pipeta de 96 canales para dispensar 2 μL en medios preparados en placas de bandeja rectangulares. (B) Placa de crecimiento MRS-agar con 96 manchas de colonias de Lp . (C) Concentración de suspensión de Lp basada en los recuentos de UFC de placas redondas tradicionales (n = 24 placas) en comparación con la concentración basada en los recuentos de UFC de placas puntuales (n = 680 puntos) diluidos en serie y ordenados por recuento promedio de colonias por punto (se contaron ~ 48 puntos para cada factor de dilución único para tres placas replicadas). Cada punto de datos representa las colonias exactas por punto, mientras que cada columna representa las colonias promedio para esa dilución. La línea punteada horizontal indica el recuento calculado de UFC del cultivo que se plateó. Los puntos delineados verdes resaltan los recuentos tradicionales de placas redondas. Los puntos rellenos de rojo resaltan la densidad óptima de colonias de 11 UFC por punto de 2 μL. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA unidireccional ordinario comparando la media de cada columna con la media de la columna de control de placa extendida con la corrección de comparaciones múltiples de Bonferroni. Box da rango intercuartílico. La línea indica la mediana. Los bigotes dan un rango total. **p < 0,01. ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Una plataforma fotográfica produce imágenes cuantificables de placas utilizando luz blanca o fluorescencia . (A) Descripción general del diseño de FluoroBox. (B) Foto de una placa puntual de colonias de Lp usando luz blanca. (C) Perfil de intensidad de colonias individuales bajo luz blanca en comparación con la intensidad del fondo (BKG) (n = 10 colonias, la línea discontinua representa la desviación estándar). (D) Foto de la misma placa puntual que en (B), usando luces verdes de un solo color y el filtro rojo para seleccionar colonias de Lp mCherry-positivas. (E) Perfil de intensidad de colonias individuales que ilustra la diferencia entre colonias con y sin emisión de cereza. (F) Foto de una placa puntual que contiene colonias de Ai , algunas de las cuales tienen una etiqueta GFP. (G) Perfil de intensidad de colonias individuales que ilustra la diferencia entre colonias GFP negativas y GFP positivas. E, F, G: n = 10 colonias para cada parcela. Los diámetros de la colonia son de aproximadamente 1,5 mm. La línea discontinua es SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Conteo preciso de placas puntuales mediante el complemento Count-On-It ImageJ. (A) Captura de pantalla de la ventana de configuración del plug-in. (B) El plug-in genera un recibo para el recuento de documentos y ayuda en la corrección de errores. Intercalación: Superposición con el número de colonias contadas para cada región de punto; El contorno amarillo indica que se contó una sola colonia y el rojo que se contaron múltiples colonias. (C) Gráfico que muestra el número de colonias contadas manualmente en comparación con el número de colonias contadas utilizando el plug-in (automatizado) cuando se utilizó una imagen de luz blanca, donde cada punto en el gráfico representa un solo punto contado manual o automáticamente (pendiente de ajuste = 0.95, línea cian; la línea 1: 1 está punteada en rojo; R2 = 0,93, coeficiente de correlación de Pearson, p < 0,0001). (D) Imagen de recibo de foto del plug-in cuando se seleccionaron colonias mCherry-positivas utilizando la función de fluorescencia de la caja de fotos. (E) Gráfico que muestra el número de colonias mCherry-positivas contadas usando el método manual en comparación con el método automatizado cuando se utilizó fluorescencia roja (pendiente de ajuste = 1.1, línea cian; la línea 1: 1 está punteada en rojo; R2 = 0,92, coeficiente de correlación de Pearson, p < 0,0001). Tenga en cuenta que los valores atípicos y los errores no se han corregido utilizando los recibos de análisis para E,G,I,K. (F) Imagen de recibo de foto del plug-in cuando se seleccionaron colonias GFP positivas utilizando la función de fluorescencia verde del cuadro de fotos y seleccionando el canal verde con el plug-in. (G) Gráfico que muestra el número de colonias positivas para GFP contadas usando el método manual en comparación con el método automatizado cuando se utilizó iluminación de fluorescencia verde (pendiente de ajuste = 1.1, línea cian; la línea 1: 1 está punteada en rojo; R2 = 0,90, coeficiente de correlación de Pearson, p < 0,0001). (H) colonias mCherry-positivas seleccionadas de morfologías de colonias mixtas utilizando un umbral de fluorescencia alto en el plug-in. (I) Gráfico que muestra el número de colonias mCherry-positivas contadas usando el método manual en comparación con el método automatizado cuando se utilizó iluminación de fluorescencia roja (pendiente de ajuste = 0.99; R2 = 0,91, coeficiente de correlación de Pearson, p < 0,0001). (J) colonias mCherry-negativas seleccionadas de morfologías de colonias mixtas utilizando un umbral de fluorescencia bajo. (K) Gráfico que muestra el número de colonias mCherry-negativas contadas usando el método manual en comparación con el método automatizado cuando el umbral de intensidad se estableció para seleccionar colonias no fluorescentes (pendiente de ajuste = 1.1; R2 = 0,85, coeficiente de correlación de Pearson, p < 0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Instrucciones de montaje de FluoroBox. Este archivo guía al lector paso a paso a través de la construcción de la caja de iluminación controlada utilizada en el video. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Corte láser acrílico FluoroBox. Este archivo proporciona una plantilla de corte para cortar con láser las piezas de acrílico para la caja de iluminación controlada. El archivo se puede enviar a un proveedor de acrílico cortado con láser. Consulte la tabla de materiales para el proveedor utilizado en este protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Instrucciones de software. Este archivo guía al lector paso a paso a través de la instalación y el uso del software Croptacular y Count-On-It proporcionado con este protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación complementario 1: código de impresión 3D para la bandeja de medición de cuentas (S1-bead-measurer.stl). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: Complemento ImageJ del recortador de fotos de placa rectangular (Croptacular_.ijm). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación complementario 3: Plugin de recorte de fotos de placa redonda (Circus_.ijm). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 4: complemento de contador de puntos de placa rectangular 96 (Gridiron_.ijm). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Las técnicas detalladas presentadas aquí permiten un aumento de >100 veces en el número de muestras que se pueden evaluar en un experimento de conteo de UFC. Esta técnica avanza los métodos existentes para experimentos de microbioma en Drosophila 12,35,36 mediante el uso del formato de placa de 96 pocillos para analizar moscas individuales. Además, aplica un método de recubrimiento puntual más eficiente19,31 y un flujo de trabajo automatizado con una plataforma de fotografía y conteo de colonias. La importancia de este método para Drosophila es estandarizar los experimentos al formato de placa de 96 pocillos, lo que permite el manejo simultáneo de un gran número de réplicas biológicas con automatización para lograr una cuantificación de alto rendimiento de las UFC.

La plataforma de 96 pocillos muestra que el aumento de la frecuencia de transferencia y la "limpieza" de bacterias transitorias causa una reducción significativa tanto en la abundancia media como en la variación entre muestras (Figura 1B, C), lo que demuestra la rigurosidad de este protocolo mejorado. Una limitación de la co-vivienda de moscas es la transferencia horizontal de bacterias entre moscas. Una solución propuesta es mantener las moscas individualmente en un formato de placa de 96 pocillos, como el Whole Animal Feeding Flat38.

Aunque no se observó una reducción significativa en la carga bacteriana cuando las moscas se lavaron en etanol, estas moscas solo se mantuvieron en presencia de bacterias externas durante 3 días. El alojamiento por períodos de tiempo más largos podría permitir que se acumule una mayor carga bacteriana39. Por lo tanto, todavía se recomienda el lavado en etanol.

La transferencia de moscas a la placa de 96 pocillos es el primer paso crítico para configurar el flujo de trabajo (Figura 1A). Una vez que se lavan las moscas, se distribuyen en los pozos una a la vez. Un gráfico de placas es útil en esta etapa para anotar qué condiciones están presentes en cada pozo y agregar cualquier nota como "la mosca se perdió". La homogeneización es otro paso crítico con algunas advertencias importantes. Las bacterias sobreviven al proceso de homogeneización cuando están en presencia de una mosca (Figura 1D, E), y presumiblemente, este principio también es cierto cuando las bacterias están dentro del intestino de la mosca. Sin embargo, las bacterias también mueren cuando se homogeneizan solo en placas batidoras de cuentas, lo que demuestra que la homogeneización puede matar las células bacterianas en ciertas circunstancias, una limitación que puede ser importante si uno está homogeneizando intestinos disecados, por ejemplo. En particular, la pérdida de UFC al homogeneizar depende del número de UFC en la muestra, y la pérdida es mínima cuando se utilizan ~ 105 UFC por pocillo. Se puede lograr una mayor preservación de las UFC deteniendo la homogeneización a mitad de camino y enfriando la placa en hielo.

La homogeneización se realizó durante 5 min en este protocolo basado en experimentos de control donde un número conocido de UFC se mezclaron con una mosca libre de gérmenes, y esto funcionó empíricamente para las bacterias de la mosca. Menos golpes causaron la presencia de partes de moscas más grandes, lo que interfiere con el pipeteo, mientras que los tiempos de homogeneización significativamente más largos de ~ 10 min hicieron que los recuentos de UFC fueran más variables. Se observó que el volumen más pequeño y la forma en ángulo de los pocillos de placa cónica reducen la eficiencia del batido de perlas en comparación con los tubos cilíndricos de 2 ml. Muchas variaciones en este enfoque general son posibles, incluyendo qué cepas bacterianas, qué recipiente de batido de cuentas, qué cuentas y qué genotipo de mosca se utilizan. Los casos de usuarios individuales necesitan usar controles positivos para establecer su enfoque.

El método de recubrimiento puntual se empleó de una manera específica: se detectaron diluciones 1:2 de L. plantarum WF en PBS en placas MRS y se incubaron a 30 °C durante 2 días (se pueden implementar tiempos de incubación más cortos para generar tamaños de colonia más pequeños). El método requiere cierta inversión inicial en equipos, principalmente el batidor de perlas y la pipeta de 96 canales (Figura 2A), que es necesaria tanto para la serie de dilución como para el recubrimiento puntual. Sin embargo, hay opciones menos costosas disponibles, incluido un replicador de placas de 96 pocillos con pines ranurados. La serie de dilución es un paso crítico que afecta la precisión de los resultados del conteo de UFC. En términos de modos de fallo, es posible obstruir las puntas de la pipeta con piezas de mosca o perlas de vidrio y que las puntas de la pipeta no se sellen correctamente en la pipeta o fallen por alguna otra razón. Todos estos problemas resultan en un recuento insuficiente de los pozos afectados y deben ser monitoreados. La mezcla adecuada en cada paso de la serie de dilución también es crucial. Cada dilución debe mezclarse bien, ya sea colocando la placa en un agitador de placas o pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15-20 veces, lo que también sirve para enjuagar las puntas. Al manchar desde la placa más diluida hasta la menos diluida, las puntas se pueden reutilizar para toda la serie de dilución. Con diluciones 1:2, el conteo es preciso en un rango de 2-25 colonias, que abarca un orden de magnitud (Figura 2C). Por lo tanto, las diluciones 1:10 ahorran tiempo y materiales. Otra variable que se puede aprovechar es el tiempo de incubación, que se puede ajustar para producir colonias más pequeñas y, así, aumentar el rango de manchas contables al evitar la fusión de colonias adyacentes.

Una foto de calidad de la placa es esencial, ya que se convierte en la fuente de datos sin procesar a partir de los cuales se analizan las UFC y se pueden archivar indefinidamente. El FluoroBox está diseñado para producir fotos de las placas con una intensidad de luz uniforme, lo que minimiza el deslumbramiento en la superficie del agar. Además, el diseño es capaz de fotografiar selectivamente colonias fluorescentes utilizando luces LED de un solo color y filtros fotográficos de colores (Figura 3A). La construcción de una configuración como el FluoroBox, con iluminación controlada y ajustes de cámara, puede aumentar en gran medida la reproducibilidad de las imágenes CFU, lo cual es importante para el análisis automatizado. Las morfologías de las colonias, la intensidad de la fluorescencia y los efectos del tiempo o la densidad en el crecimiento de las colonias son solo algunas de las propiedades que se pueden analizar utilizando las fotografías. La caja de fotos se puede construir sin los filtros de color y las luces de un solo color si no se utilizan bacterias fluorescentes, lo que reduce el costo y la complejidad. Diferentes luces de excitación y filtros de emisión podrían ser sustituidos por los recomendados aquí si un laboratorio utiliza un fluoróforo diferente. Una cámara que está conectada a una tableta a través de WiFi usando una aplicación es útil tanto para la función de obturador automático para evitar temblores como para facilitar la transferencia de datos. Las imágenes se pueden transferir a la tableta y luego a una computadora portátil utilizando un software de transferencia inalámbrica de archivos. Las cámaras recomendadas con estas capacidades se indican en la Tabla de materiales.

Count-On-It es un plug-in escrito en ImageJ. El software automatizado de conteo de CFU segmenta la imagen de la placa en una cuadrícula uniforme de 96 pocillos, cuenta las colonias en cada celda de la cuadrícula y agrupa los resultados en una hoja de cálculo simple. Como siempre hay variación en la posición de la cuadrícula puntual en la placa y en la foto, el usuario debe ajustar manualmente la cuadrícula a la foto utilizando el complemento Croptacular. Esto también ayuda a excluir áreas cerca del borde de la placa, que tienen resplandor. Establecer el umbral es clave para obtener el recuento de UFC más preciso de la imagen. Si el umbral se establece demasiado alto, las colonias se fusionarán; Si el umbral se establece demasiado bajo, las colonias serán excluidas. Una vez establecido el umbral, la macro aplica el desenfoque gaussiano para suavizar los bordes y reducir el aliasing, el filtro de cuenca divide las colonias superpuestas y las manchas se cuentan mediante partículas de análisis.

A veces, la densidad de colonias es demasiado alta en un lugar en particular. Count-On-It proporciona una manera de lidiar con esto. Para estimar el número de colonias en una celda de cuadrícula con colonias parcialmente fusionadas, primero el área promedio de una mancha circular de toda la placa se toma como C promedio. Luego, el área de la mancha A 1 se divide por el área promedio de una mancha circular A1/Cpromedio. Este número se redondea al entero más cercano, y esa es la estimación de cuántas colonias hay en una mancha. Esta función es una de las razones por las que el umbral puede influir en los resultados del recuento: el área de colonia promedio relativa frente a un área de blob combinada será diferente dependiendo de cómo el umbral afectó a los blobs combinados.

Los métodos presentados tienen varias limitaciones. Estos incluyen la necesidad de equipos para dispensar medios líquidos con precisión desde placas de 96 pocillos. Este equipo, ya sea una pipeta de 96 canales o una herramienta de pin replicador ranurado, puede costar miles de dólares para obtener. Existen alternativas más baratas, pero son menos precisas. El conteo automatizado a través de Count-On-It también presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, si dos tipos de colonias en una población mixta se delimitaran basándose únicamente en el tamaño, el recuento de manchas no podría asignar colonias al tipo correcto. En este caso, las manchas con manchas tendrían que eliminarse de los recuentos. Una mayor diferenciación de colonias basada en la morfología sería una extensión valiosa del método que no se implementa actualmente. El uso de medios selectivos que incluyen nutrientes específicos de la cepa y antibióticos simplifica la necesidad de un análisis de imágenes complejo.

El mantenimiento de experimentos con moscas de la fruta en placas de 96 pocillos multiplica el número de muestras y condiciones que se pueden probar en un solo experimento y puede facilitar las pantallas de alto rendimiento en fenotipos de asociación Drosophila-bacteria. Prevemos que este método se puede extender mediante el uso de medios selectivos para diferenciar muchas cepas bacterianas en mezclas complejas. El método no se limita al estudio del microbioma de la mosca. La cuantificación de UFC es común en muchas aplicaciones de la microbiología, desde los recuentos de coliformes en el agua potable hasta la identificación de patógenos. El sistema de recubrimiento CFU presentado aquí permite pantallas de alto rendimiento, así como la adquisición, procesamiento, almacenamiento y entrega automatizados de resultados.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El Dr. Kerwyn Casey Huang, el Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper y miembros del laboratorio de Ludington dieron valiosos aportes sobre el desarrollo de este protocolo. El financiamiento fue proporcionado por NSF IOS grant 2032985, NIH grant DP5OD017851, una subvención de la Carnegie Institution of Canada y el Carnegie Institute for Science's Endowment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials Genesee 32-121 autoclavable
Fly vial stoppers Genesee 59-201 autoclavable
Hand Applicator 3M 3M PA1
Heat Sealer Eppendorf 5390
Mini-Beadbeater 96 BioSpec 1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm BioSpec  11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner Labnet LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor Mettler Toledo 30296705 Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural USA scientific 1402-9220 Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil 4titude 4ti-0591 Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile SPL Life Sciences 31001 For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2) Amazon ASIN: B07BP1WR3H To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut  Amazon UPC: 799862376780 AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3) Amazon ASIN: B003QZSZY4 For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer Amazon UPC: 611982484599 Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft Superbrightleds.com WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 Superbrightleds.com WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 Superbrightleds.com SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-1 
6” drawer handle Amazon ASIN: B07Z331P99 Any drawer handle should work.
6” Drawer slides Btibpse UPC: 712243424979 Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) Amazon ASIN: B00HYLZB98 Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) Amazon ASIN: B07KX9T7NF To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue SCIGRIP Ean: 7844908489337 SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long  Superbrightleds.com CT-B04-10
Camera L-Bracket WLPREOE, Vikerer, Unbranded ASIN: B09X46YKQZ The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. 1894C002 The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters Superbrightleds.com STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters Superbrightleds.com STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters  Superbrightleds.com STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits Black & Decker ‎BDCDD12PK Brand not important. 
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte Rustoleum 331182 Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls Big Blue Saw www.bigbluesaw.com Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera 
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt  Superbrightleds.com LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. DMC-ZS100K Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch ASIN: B07417F21D Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes BAZIC Products Alliance Rubber 26649 Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 Superbrightleds.com CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 Superbrightleds.com RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm  Tiffen 72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm Tiffen 7258
Software
ImageJ64 https://imagej.net/downloads N/A Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
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Biología Número 191
Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma <em>de Drosophila</em>
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Dodge, R., Ludington, W. B. Fast… More

Dodge, R., Ludington, W. B. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (191), e64298, doi:10.3791/64298 (2023).

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