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Immunology and Infection

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

면역형광 염색 중 티라마이드 신호 증폭은 HSV-1 감염 후 ZBP1 유발 괴사 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 민감한 검출을 가능하게 합니다.

Abstract

키나아제 수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 그 기질 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 중요한 항바이러스 기능을 가진 염증성 형태의 세포 사멸인 괴사증의 중요한 조절자입니다. RIPK3의 자가인산화는 괴사 MLKL의 기공 형성 실행자 단백질의 인산화 및 활성화를 유도합니다. 세포막에서 인산화된 MLKL의 트래피킹 및 올리고머화는 괴사 세포 사멸의 특징인 세포 용해를 초래합니다. 핵산 센서 ZBP1은 RNA 및 DNA 바이러스에 감염된 후 왼손잡이 Z형 이중가닥 RNA(Z-RNA)에 결합하여 활성화됩니다. ZBP1 활성화는 감염된 숙주 세포의 괴사를 포함한 조절된 세포 사멸을 유도하여 바이러스 감염을 제한합니다. 면역형광 현미경 검사를 사용하면 세포별로 ZBP1 매개 괴사의 다운스트림 다양한 신호 전달 단계를 시각화할 수 있습니다. 그러나 인간 RIPK3 및 MLKL에 대한 현재 상업적으로 이용 가능한 포스포 특이적 항체를 사용하는 표준 형광 현미경의 감도는 이러한 마커의 재현 가능한 이미징을 배제합니다. 여기에서는 단순 포진 바이러스 1(HSV-1)에 감염된 인간 HT-29 세포에서 세린(S) 인산화 RIPK3(S227) 및 MLKL(S358)에 대한 최적화된 염색 절차를 설명합니다. 면역형광 염색 프로토콜에 티라마이드 신호 증폭(TSA) 단계를 포함하면 S227 인산화 RIPK3의 특이적 검출이 가능합니다. 또한 TSA는 S358 인산화 MLKL의 검출 감도를 크게 높입니다. 함께,이 방법은 ZBP1 유발 괴사의 유도 동안이 두 가지 중요한 신호 이벤트의 시각화를 가능하게합니다.

Introduction

수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 괴사 세포 사멸 1,2의 중심 조절자입니다. 괴사증은 항 바이러스 면역 및자가 염증에 관여하는 조절 된 세포 사멸의 용질 및 염증성 형태입니다. 바이러스에 감염된 세포의 괴사는 즉시 바이러스 복제를 차단합니다. 괴사 유도 후 세포 용해는 또한 항 바이러스 면역을 자극하는 손상 관련 분자 패턴을 방출합니다 3,4. 괴사증은 3개의 업스트림 활성화 분자 중 하나와의 RIP 동형 상호작용 모티프(RHIM) 매개 상호작용에 따른 RIPK3의 활성화에 의해 시작됩니다: RIPK1 (TNF 수용체 1 [TNFR1] 관여시), TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF; 톨 유사 수용체 3 및 4 결합시) 또는 항바이러스 핵산 센서 Z-DNA 결합 단백질 1 (ZBP1)1,2 . 괴사증 신호 전달은 RIPK3의 자가 인산화로 시작하는 일련의 인산화 이벤트를 통해 진행됩니다. 키나아제 도메인 내부의 세린 (S) 227에서 인간 RIPK3의 자가 인산화는 MLKL과의 상호 작용을 가능하게함으로써 괴사를위한 전제 조건이며 일반적으로 인간 RIPK3 활성화 및 괴사 세포 사멸 1,5에 대한 생화학 적 마커로 사용됩니다. 일단 활성화되면, RIPK3는 트레오닌 (T)357 및 S3581에서 MLKL의 활성화 루프를 인산화한다. 이로 인해 MLKL 형태가 변경되어 N 단자 4 개의 나선 번들 도메인이 노출됩니다. 그런 다음 MLKL은 올리고머화되어 세포막으로 이동하여 지질 이중층에 노출된 4개의 나선 다발을 삽입하여 기공을 형성하여 결국 세포 사멸을 초래합니다 2,6.

ZBP1은 Z-형태(Z-RNA)에 이중 가닥 RNA를 포함하여 왼손잡이 Z형 핵산을 인식하는 항바이러스 핵산 센서입니다. Z-RNA 결합은 ZBP1의 N-말단에 위치한 두 개의 Zα-도메인을 통해 발생합니다. RNA 및 DNA 바이러스 감염 동안 축적되는 Z-RNA는 ZBP1 7,8과 직접 관여하는 것으로 생각된다. 활성화 된 ZBP1은 중앙 RHIM을 통해 RIPK3를 모집하고 괴사 9,10을 포함하여 조절 된 세포 사멸을 유도합니다. 바이러스는 ZBP1 유도 숙주 세포 괴사11에 대응하기 위해 수많은 탈출 메커니즘을 채택했습니다. 예를 들어, ICP6으로 알려져 있고 UL39에 의해 코딩되는 단순 포진 바이러스 1 (HSV-1) 리보 뉴클레오티드 환원 효소 서브 유닛 1은 인간 세포12,13,14,15에서 ZBP1 매개 RIPK3 활성화를 방해하는 N- 말단에 RHIM을 보유한다. ZBP1은 바이러스 복제를 제한 할뿐만 아니라 마우스 연구에 따르면 ZBP1 활성화는 염증성 질환을 유발하고 암 면역16,17,18,19,20,21을 자극합니다. 따라서 인간 세포에서 ZBP1 유발 괴사 중에 발생하는 신호 이벤트를 감지하는 프로토콜은 이러한 과정에서 ZBP1의 역할을 평가하는 데 중요합니다.

촉매 리포터 증착(CARD)이라고도 하는 티라마이드 신호 증폭(TSA)은 항체 기반 면역 분석에서 검출 한계 및 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 개발되었습니다. TSA 동안, 임의의 1차 항체가 관심있는 항원을 검출하는데 사용될 수 있다. 2차 항체에 결합된 고추냉이 과산화효소(HRP)는 과산화수소의 존재 하에 비오티닐화된 티라마이드 라디칼의 국소 축적을 촉매합니다. 이러한 활성화 된 비오틴-티라마이드 라디칼은 근위 티로신 잔기와 반응하여 공유 결합을 형성합니다. 잠재적인 티라미드-비오틴 기질은 항원 자체, 1차 및 2차 항체, 및 이웃 단백질을 포함한다. 따라서 TSA는 분석의 감도를 크게 향상시키지만 공간 분해능의 일부가 손실됩니다. 마지막 단계에서 비오틴 분자는 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출됩니다. HRP 반응은 관심 항원 위 또는 그 근처에 많은 티라마이드-비오틴 분자를 침착시킵니다. 이것은 스트렙타비딘-플루오로크롬 결합 부위의 수를 크게 증가시켜 분석의 감도를 크게 증폭시킵니다(그림 1). 대안적으로, 티라마이드는 형광 색소에 직접 결합될 수 있어 스트렙타비딘 결합 형광단의 필요성을 제거합니다. 단백질 면역 조직 화학 및 DNA / RNA 현장 혼성화는 TSA가 신호 강도를 개선하기 위해 사용 된 최초의 방법 중 하나였습니다22,23. 보다 최근에, TSA는 세포내 유세포분석법(24) 및 질량분석법(25)과 결합되었다.

여기에서는 면역형광현미경을 이용하여 HSV-1 감염에 의한 ZBP1의 활성화시 인산화된 인간 RIPK3(p-RIPK3[S227]) 및 인산화된 인간 MLKL(p-MLKL[S358])을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 인간 ZBP1을 안정적으로 발현하도록 형질도입된 괴사에 민감한 HT-29 인간 결장직장 선암 세포주를 사용합니다. 이 세포들은 바이러스 RHIM (VQCG) 내의 4 개의 핵심 아미노산이 알라닌 (AAAA)으로 대체 된 돌연변이 ICP6 단백질 (HSV-1 ICP6mutRHIM)을 발현하는 HSV-1 균주에 감염되어 ICP6가 ZBP1 매개 괴사13,14,15를 차단할 수 없게되었습니다. 면역염색26에서 p-RIPK3 및 p-MLKL에 대한 현재 상용화된 항체의 낮은 신호 대 잡음비 문제를 극복하기 위해 티라마이드 신호 증폭(TSA) 단계(그림 1)를 수행하여 인간 p-RIPK3의 강력한 검출(S227)을 달성하고 인간 p-MLKL의 검출 감도를 한 단계 향상시킵니다(S358).

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Protocol

1. 비오티닐화 티라마이드의 제조

  1. 비오틴-티라마이드에서 시작하는 비오티닐화 티라마이드를 준비합니다. 10mM 스톡 용액을 만들려면 3.6mg의 비오틴-티라마이드를 1mL의 DMSO에 녹입니다. 용해된 생성물을 품질 보존을 위해 -20°C의 분취량에 보관하십시오.

2. 배양에서 HT-29 세포 유지

참고: ZBP1-발현 HT-29는 인간 ZBP1을 코딩하는 렌티벡터27 을 사용한 형질도입에 의해 생성되었다.

  1. ZBP1 발현 HT-29 세포를 L- 글루타민, 나트륨-피루 베이트 및 10 % 태아 소 혈청이 보충 된 McCoy의 5A 배지 (이제부터는 전체 배지라고 함)에 보관하고 37 ° C의 인큐베이터에서 5 % 이산화탄소로 유지합니다. 이상적으로는 낮은 계대 수 (10 미만)의 셀을 사용하십시오. 실험 시작 전에 해동 주기 후 최소 5일 동안 세포를 회복하도록 두십시오.
  2. 배양 플라스크로부터 세포를 분리하기 위해, 배지를 제거하고, 세포를 5 mL의 PBS(37°C로 예열)로 세척한다. 다음으로, 적절한 양의 트립신/EDTA(각각 0.05% 트립신 및 0.032% EDTA, 37°C로 예열됨)를 세포에 추가합니다(T75 플라스크의 경우 2mL, T175 플라스크의 경우 3mL).
  3. 트립신/EDTA로 세포를 5% 이산화탄소와 함께 37°C의 인큐베이터에서 최대 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 플라스크를 두드리고 4x-20x 대물 배율의 현미경을 사용하여 플라스크에서 세포가 분리되었는지 육안으로 확인합니다.
  4. 세포가 완전히 분리되지 않은 경우 37°C에서 5분 더 배양합니다. 세포가 분리되면 플라스크에 6mL의 전체 배지를 추가하여 효소 반응을 중지합니다.
  5. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 모으십시오. 생존력을 평가하기 위해 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하고; 1:5 희석을 권장합니다. 세포의 생존율이 90 %를 초과하는 경우에만 실험을 진행하십시오.

3. 세포의 실험, 파종 및 자극 시작

  1. 고급 현미경 검사가 가능한 1cm² 표면적 웰 플레이트에 전체 배지에 90,000개의 ZBP1 발현 HT-29 세포를 시드합니다. 웰당 200μL의 종단 부피를 사용하십시오.
  2. 세포를 37°C에서 5% 이산화탄소와 함께 밤새 배양한다. 염색 제어를 위해 일부 추가 웰을 시드해야 한다는 점을 고려하며, 이는 5.6단계에서 더 자세히 설명합니다.
  3. 세포가 70%-80% 컨플루언스에 도달하면 세포에 괴사증 유발 자극을 추가합니다. 여기서, 세포를 HSV-1 ICP6mutRHIM (5의 감염 다중성[MOI], 세포 수로 나눈 플라크 형성 단위(pfu)으로 정의됨; pfu는 Vero 세포에 대한 플라크 분석을 사용하여 정량화됨)을 6시간, 8시간 또는 10시간 동안 감염시켰다.
  4. 괴사 유도에 대한 양성 대조군으로서, 30 ng/mL TNF, 20 μM의 범-카스파제 억제제 zVAD-fmk, 및 5 μM의 SMAC 모방체 BV6을 함유하는 괴사증 유도 칵테일로 세포를 4시간 동안 자극한다.
  5. p-RIPK3(S227) 염색을 위한 음성 대조군으로서, RIPK3 키나제 활성을 억제하고 S227의 자가인산화를 방지하는 GSK'840(1 μM)을 포함한다. 이상적으로는 치료되지 않은 상태와 괴사 자극 후에 억제제를 추가하십시오. 억제제는 바이러스 감염과 동시에 첨가 될 수 있습니다.
  6. 37°C로 예열된 완전 배지에서 자극을 준비한다. 모든 자극에 대해 웰당 200μL의 최종 부피를 사용하십시오.

4. 세포 고정

  1. 배지를 제거하고 세포를 200 μL의 1x PBS로 세척하였다. 그런 다음 150μL의 4% PFA(이미 실온에서 평형화됨)를 세포에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 쉽게 분리되는 셀을 사용하는 경우 다음과 같이 셀 고정을 최적화할 수 있습니다. 웰에서 100μL의 배지를 제거하여 100μL의 부피가 플레이트에 남아 있도록 합니다. 100 μL의 4 % PFA를 세포에 첨가하십시오. 세포를 실온에서 5분 동안 배양한다. 그런 다음 웰에서 배지/고정액을 제거하고 150μL의 4% PFA로 교체합니다. 세포의 완전한 고정을 보장하기 위해 실온에서 20분 더 세포를 배양합니다.
  2. 고정 후, 4% PFA를 제거하고, 세포를 200 μL의 1x PBS로 3x 세척하였다. 샘플은 추가 처리가 있을 때까지 밤새 4°C에서 과량(>200μL)의 1x PBS에 저장될 수 있다.

5. 투과화 및 1차 염색

  1. PBS를 제거하고 100 μL의 투과화 완충액(PBS 중 0.5% 트리톤 X-100)을 첨가한다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
  2. 투과화 완충액을 제거하고, 이어서 웰을 100 μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 세척한다. 이미징 챔버를 세척 버퍼로 틸팅 실험실 셰이커에서 실온에서 5분 동안 배양합니다(분당 20-30회 흔들기 동작).
  3. 1차 항체의 비특이적 결합을 방지하려면 차단 배지 100μL를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 대안적으로, 이러한 차단 단계는 실온에서 1시간 동안 PBS 중 3% BSA, 0.1% Triton-X-100으로 블로킹하는 것으로 대체될 수 있다.
  4. 웰을 100μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 3회 세척합니다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  5. 세척 완충액을 제거한 후, 1차 항체를 이미징 챔버에 첨가하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 100 μL의 끝 부피를 사용하여 웰을 덮으십시오. 4°C에서 밤새 배양하는 동안 이미징 챔버를 틸팅 실험실 셰이커 위에 놓지 마십시오.
    참고 : Anti p-MLKL (S358; 희석 : 1 : 200) 및 anti-p-RIPK3 (S227; 희석 : 1 : 200)은 토끼를 숙주 종으로 공유하므로 하나의 우물에서 결합되어서는 안됩니다. 바이러스 감염을 모니터링하려면 선택한 바이러스 단백질에 대한 1차 항체를 p-MLKL(S358) 또는 p-RIPK3(S227)와 결합합니다. 여기서, HSV-1 감염 세포를 감염시킨 후 ICP0 염색(희석: 1:50, 숙주종: 마우스)으로 감염시켰다.
  6. 이 시점에서 필요한 염색 제어를 고려하십시오. 마스킹 역치를 설정하기 위해 TSA 증폭 단계의 잠재적 배경을 시각화하기 위해 항상 1차 항체 없음을 포함합니다(9단계 참조).
    참고: 공동 염색 프로토콜(예: p-MLKL[S358] 또는 p-RIPK3[S227]을 바이러스 단백질에 대한 항체와 결합)의 경우 단일 염색도 사용하십시오. 단일 염색의 사용은 다른 이미징 채널에서 잠재적인 블리드스루 신호를 교정하는 데 중요합니다.

6. 티라마이드 신호 증폭 (TSA)

  1. 1차 항체 믹스를 제거하고 100μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 웰을 3배 세척합니다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  2. 세척 완충액을 제거하고 증폭이 필요한 1차 항체 종을 인식하는 HRP 표지된 2차 항체 100μL를 추가합니다. p-RIPK3 (S227) 또는 p-MLKL (S358) 신호를 증폭하기 위해 100μL의 항 토끼 -HRP를 추가하고 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 30 분 동안 배양합니다.
    참고: p-MLKL(S358) 또는 p-RIPK3(S227)만 증폭됩니다. 바이러스 단백질의 염색은 표준 간접 염색 방법을 사용하여 시각화됩니다.
  3. 그런 다음 웰을 100μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 3배 세척합니다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  4. 다음 단계에서는 비오티닐화된 티라마이드를 현미경 플레이트에 추가합니다. 2차 항체에 결합된 HRP 그룹을 사용하여, 효소 반응은 1차 표적에 근접하여 티라미드 라디칼의 형성을 촉발할 것이다(여기서, p-MLKL[S358] 또는 p-RIPK3[S227]).
  5. HRP의 효소 활성을 활성화하려면 비오티닐화 티라마이드와 함께 산화 기질을 추가하십시오. 이를 달성하기 위해, TSA 완충액 (0.1 M 붕산 [pH 8.5])을 0.03 M H 2 O2 로 보충하십시오. 구체적으로, 5 mL의 TSA 완충액을 취하고, 5 μL의 30 % H 2 O2를 첨가한다.
  6. 이제 비오틴-티라미드를H2O2-보충된 TSA 완충액에 1:1,000에서 1:20,000 범위로 희석합니다.
    참고: 비오틴-티라마이드의 희석 계수는 배치당 최적화되어야 합니다.
  7. 웰에서 세척 완충액을 제거하고 희석된 비오틴-티라미드를 웰에 100μL의 최종 부피가 되도록 첨가합니다. 틸팅 실험실 셰이커에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
  8. 다음으로, 웰을 100 μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 3배 세척한다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.

7. 형광단

참고: 1차 항체의 신호가 비오틴기로 전환되기 때문에 p-MLKL(S358) 및 p-RIPK3(S227)은 형광단에 결합된 스트렙타비딘을 사용하여 시각화됩니다(형광단 568, 희석: 1:500). 또한 핵은 DAPI(5μg/mL)로 염색됩니다. 바이러스 단백질이 염색 프로토콜에 포함되는 경우, 1차 항체의 숙주 종에 대해 적합한 형광 표지된 2차 항체를 포함시킨다. 대표적인 결과에서, 마우스 항-ICP0을 사용하였다. 2차 항체로서 염소 항-형광단 633에 결합된 마우스(희석: 1:1,000)가 포함되었다.

  1. 염색 혼합물을 상기 언급된 항체 및 염색을 함유하는 세척 완충액(PBS 중 0.1% Triton X-100)에서 확인한다. 세척 완충액을 제거하고, 염색 혼합물 100μL를 추가하고, 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계부터 이미징 챔버를 빛으로부터 차폐하십시오.
  2. 다음으로, 웰을 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 2배 세척한다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  3. 마지막으로 웰을 1x PBS로 2x 헹굽니다. 이미징 될 때까지 1x PBS의 초과 (> 200 μL)에 샘플을 보관하십시오. 또는 염색을 보존하기 위해 샘플을 장착 매체에 담그십시오. 이제 이미징 챔버를 컨포칼 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다.

8. 컨포칼 현미경을 사용한 이미징

  1. 이미징하기 최소 10분 전에 컨포칼 현미경과 레이저를 켭니다.
  2. 민감도를 위해 몰입 목표를 사용합니다. 가급적이면 40x 또는 63x 대물 배율을 사용합니다. 이미징하기 전에 적절한 면봉을 사용하여 렌즈 클리너로 침수 대물렌즈를 청소하십시오. 대물렌즈가 더러우면(예: 먼지로 인해) 이미지 품질이 저하될 수 있습니다.
  3. 이미징 챔버 바닥에 과도한 양의 오일을 넣으십시오. 또한 선택한 목적에 기름 한 방울을 추가하십시오.
  4. 이미징 챔버를 현미경에 놓습니다. DAPI 염색 또는 명시야 이미징을 사용하여 초점 필드를 찾습니다. 필요한 경우 이미징 챔버 주위를 이동하여 액침 오일이 적절하게 퍼지도록 합니다.
  5. 현미경에 필요한 이미징 트랙을 설정합니다. 현미경에 따라 다음 단계가 다를 수 있습니다(표 1).
    알림: 이미징 트랙을 설정할 때 핵 염색이 마지막으로 측정되도록 트랙을 프로그래밍하십시오. 405nm 레이저는 광퇴색에 기여하여 모든 채널에서 특정 신호를 손실시킬 수 있습니다.
  6. p-RIPK3(S227) 또는 p-MLKL(S358)의 존재 여부에 대해 완전한 셀을 분석하려면 셀의 높이에 걸쳐 있는 z-스택을 측정합니다. 여기서 z-스택은 0.16μm마다 40개의 슬라이스로 만들어져 6.22μm의 범위를 만들었습니다.

추적하다 레이저 빔 스플리터 필터
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) 561 MBS -405 + BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
바이러스 유전자 : ICP0 633 MBS -405 + BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
핵: 다피 405 MBS -405 + BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

표 1: 세포 시각화를 위한 이미징 트랙.

9. 데이터 분석 및 정량화

  1. 현미경 이미지를 소프트웨어에 업로드합니다. 확장 초점을 사용하여 z 스택의 모든 정보를 2D 이미지로 시각화합니다.
  2. 다음으로, 다음 정보를 추출하기 위해 분석 프로토콜을 프로그래밍합니다 : 이미지 당 세포 수, p-RIPK3 (S227) + 또는 p-MLKL (S358) + 염색을 나타내는 복셀의 합. 복셀은 픽셀에 해당하는 3차원으로 정의되는 3차원 볼륨을 나타냅니다.
  3. 이미지 당 세포 수를 정량화하려면 핵을 분할하십시오. 분할 결과의 노이즈를 줄이려면 분할에 크기 제한(>100μm³)을 추가합니다. 분할된 핵의 수는 이미지의 세포 수를 나타냅니다.
  4. p-RIPK3(S227)+ 또는 p-MLKL(S358)+ 복셀의 양을 정량화하려면 임계값 기반 분할을 프로그래밍합니다. 1차 항체 없음(NP) 이미지에서 신호가 포착되지 않도록 임계값을 설정합니다.
  5. 처리되지 않은 모의 조건의 이미지를 사용하여 임계값을 추가로 조정합니다. 괴사증 자극으로 인한 신호 증가의 민감한 감지를 보장하려면 더 높은 임계값을 설정하여 모의 조건에서 p-RIPK3(S227)+ 또는 p-MLKL(S358)+ 복셀의 픽업을 제한합니다. 모의 상태 및 괴사증 유발 바이러스 감염의 여러 이미지에서 프로그래밍된 분석 프로토콜을 항상 확인하십시오.
  6. 모든 이미지 세트에 대해 분석을 실행합니다. 복셀 정량화 및 핵 분할을 스프레드시트 소프트웨어에서 추가 처리를 위해 .txt 파일로 내보냅니다.
  7. 이미지 이름, 핵 정량화 및 검출된 복셀의 합을 보여주는 데이터의 피벗 테이블을 만듭니다.
  8. 다음으로, 양의 복셀의 합을 이미지의 셀 수로 나눕니다. 그 결과 셀당 양의 복셀의 상대적 값이 생성됩니다. 폴드 증가를 시각화하려면 셀당 p-RIPK3(S227)+ 또는 p-MLKL(S358)+ 복셀의 상대 값을 처리되지 않은 상태(mock)의 중앙값으로 나눕니다.

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Representative Results

인간 세포에서 MLKL 인산화 및 특히 RIPK3 인산화의 면역형광 검출은 기술적으로 어렵습니다26. 여기에서는 ZBP1의 활성화시 인간 p-RIPK3 (S227) 및 p-MLKL (S358)에 대한 개선 된 염색 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 형광 신호의 검출 한계 및 감도를 개선하기 위한 TSA 단계를 포함한다. 상기 방법을 검증하기 위해, TSA 매개 면역형광과 p-RIPK3(S227) 및 p-MLKL(S358) 모두의 표준 간접 형광 염색을 나란히 비교하였다.

인간 ZBP1을 발현하는 HT-29 세포를 ICP6 RHIM 돌연변이 HSV-1 균주(HSV-1 ICP6mutRHIM)로 9시간 동안 감염시켜 ZBP1 매개 괴사 및 RIPK3 인산화를 유도했습니다. HSV-1 ICP6mutRHIM 균주는 ICP6 RHIM 내에서 VQCG에서 AAAA 돌연변이를 운반하며 ZBP114,15의 다운스트림 괴사 신호 전달을 차단할 수 없습니다. 앞서 보고된바와 같이, 표준 간접 면역형광은 컨포칼 현미경의 레이저 출력이 30%로 증가한 경우에도 현재 상용화된 항체로 RIPK3 S227 인산화를 시각화할 만큼 민감하지 않았습니다(그림 2A). 대조적으로, TSA 단계를 포함하면 HSV-1 ICP6mutRHIM에 감염된 세포의 세포질에서 p-RIPK3의 강력한 검출(S227)이 가능해졌습니다. p-RIPK3(S227) 신호는 레이저 출력이 2%로 설정되었을 때 포화 상태에 도달했습니다(그림 2A). 3차원 z-스택 이미지(단계 9 참조)의 정량화는 모의 처리된 세포에 비해 감염된 HSV-1 ICP6mutRHIM에서 p-RIPK3에 대해 양성인 복셀 수가 약 20배 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2B). 1차 항-p-RIPK3 (S227) 항체를 TSA-매개 염색 프로토콜로부터 1차 (NP) 대조군으로서 생략한 것은 검출가능한 신호를 산출하지 않았다. HSV-1 ICP6mutRHIM에 감염된 세포를 시각화하기 위해 샘플을 즉각적인 초기 바이러스 단백질 ICP0에 대한 1차 항체로 공동 염색했습니다(그림 2A). 낮지만 검출가능한 p-RIPK3(S227) 신호가 모의-처리된 세포에 존재하였고, 이는 이 부위5에서 인간 RIPK3의 구성적 자가인산화를 나타낼 수 있다(논의 참조). 이전 보고서28에 따르면, ICP6의 RHIM은 야생형 HSV-1 (HSV-1WT; 그림 2A, B). p-RIPK3 (S227) 신호의 특이성을 추가로 검증하기 위해, 세포를 감염 전에 RIPK3 키나제 억제제 GSK'840으로 처리하였다. GSK'840은 RIPK3의 키나아제 도메인에 결합하여 그의 활성을 방지하고 그의 자가인산화를 억제한다29. GSK'840은 ZBP1 활성화 시 S227에서 RIPK3 인산화를 방지하여(그림 2A,B), TSA 매개 p-RIPK3(S227) 검출 방법의 특이성을 확인하였다.

괴사증의 말기 마커인 MLKL 인산화를 추적하기 위해 ZBP1 발현 HT-29 세포를 HSV-1 ICP6mutRHIM으로 8시간 및 10시간 동안 감염시켰습니다. 세포를 TSA를 사용하여 S358 인산화된 MLKL (p-MLKL [S358])에 대한 항체로 염색하였다. 모의 처리 된 세포는 p-MLKL의 낮고 다소 점이있는 세포질 염색을 보인 반면(S358), 세포질, 핵에서 강한 p-MLKL 염색이 검출되었습니다. 및 HSV-1 ICP6mutRHIM에 감염된 세포의 원형질막에서 (그림 3A). 또한, 클러스터에서 p-MLKL(S358) 신호가 관찰되었다. 이는 세포막에서 활성화된 인산화된 MLKL 올리고머의 기공 형성 기능 및 인플루엔자 A 감염시 최근에 보고된 핵 전좌 1,2,6,30과 일치합니다. 양성 p-MLKL(S358) 염색 대조군으로서 TNF, SMAC 모방체 BV6 및 범-카스파제 억제제 zVAD-fmk의 조합으로 ZBP1 발현 HT-29 세포를 자극하여 TNFR1 매개 괴사를 유도했습니다(그림 3A). 1차 대조군이 없는 TSA-매개 염색 프로토콜로부터 1차 항-p-MLKL (S358) 항체를 생략한 것은 검출가능한 신호를 산출하지 않았다.

다음으로, TSA가 있는 경우와 없는 p-MLKL(S358) 면역형광염색을 나란히 비교하였다. ZBP1-발현 HT-29 세포를 HSV-1 ICP6mutRHIM으로 9시간 동안 감염시켰다. 표준 간접 면역 형광법을 사용하여 감염된 세포에서 특정 p-MLKL (S358) 신호를 검출하려면 40 %의 레이저 출력이 필요했지만 TSA 처리 된 샘플은 모의 처리 된 샘플의 배경 염색을 증가시키지 않고 이미 6 %의 레이저 출력으로 포화 신호에 도달했습니다 (그림 3B). 또한, 3차원 z-스택 이미지의 정량화는 표준 간접 면역형광법에 비해 TSA를 사용할 때 p-MLKL(S358)에 대해 양성인 복셀 수가 10배 이상 증가한 것으로 나타났습니다. 이는 TSA가 p-MLKL에 대한 검출 임계값과 감도를 모두 향상시킨다는 것을 보여준다(S358; 그림 3C).

마지막으로, 다른 ZBP1-의존성 괴사증 바이러스 자극에 대한 TSA-매개 면역형광 프로토콜을 검증하기 위해, 우리는 ZBP1-발현 HT-29 세포를 인플루엔자 A 바이러스(IAV) PR8 균주로 9시간 동안 감염시켰다. IAV는 인간 세포에서 ZBP1-매개 세포자멸사 및 괴사증 모두를 유도한다(30). 실제로 TSA는 p-RIPK3 (S227) 및 p-MLKL (S358)의 강력한 검출을 허용했으며, 이는 괴사증을 겪고있는 이들 세포를 나타냅니다 (그림 4A-D).

Figure 1
그림 1: TSA 프로토콜의 개략적 표현. 세포는 고급 현미경과 호환되는 웰 플레이트에 파종되고 자극됩니다. 그 후, 샘플을 4 % PFA에 고정시키고, 투과화 및 차단하여 1 차 항체의 비특이적 결합을 방지합니다. 인산화된 RIPK3(p-RIPK3[S227]) 및 MLKL(p-MLKL[S358])을 시각화하기 위해 이러한 주요 인산화 부위를 인식하는 특정 항체를 이미징 챔버에서 밤새 배양합니다. 다음으로, 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP)에 결합 된 2 차 항체가 첨가된다. 이 HRP 그룹은 H 2 O2의 존재하에 비오틴 화 티라 미드의 활성화를 가능하게합니다. 이어서, 활성 비오틴-티라마이드는 HRP-표지된 2차 항체에 근접하여 티로신 잔기에 공유 결합한다. 여기에는 관심있는 단백질 (이 경우 p-RIPK3 또는 p-MLKL)의 티로신과 인접한 단백질의 티로신 및 1 차 및 2 차 항체 자체 (표시되지 않음)가 포함됩니다. 이러한 티라미드 신호 증폭 단계는 염색 프로토콜의 민감도를 크게 증가시킨다. 마지막 단계에서, 형광기에 결합된 스트렙타비딘을 첨가하여 비오티닐화된 분자를 시각화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: HSV-1 ICP6mutRHIM은 S227에서 인간 RIPK3의 ZBP1 의존적 인산화를 유도합니다. (A) TSA 염색을 p-RIPK3에 대한 표준 간접(TSA 없음) 면역형광 염색 프로토콜과 비교한 인간 ZBP1 발현 HT-29 세포의 대표적인 공초점 이미지(S227). 모의 및 바이러스에 감염된 샘플 (HSV-1WT 또는 HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5])을 9 시간 동안 배양 하였다. 음성 대조군으로서, RIPK3 키나제 억제제 GSK'840 (1 μM)이 포함되었다. 9시간 동안 HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI=5)으로 감염된 세포의 1차 (NP) 염색 대조군에는 1차 항-p-RIPK3 (S227) 및 ICP0 항체가 모두 생략되었다. 특정 p-RIPK3(S227) 신호를 검출하는 데 필요한 레이저 출력이 화상에 표시됩니다. ICP0은 바이러스에 감염된 세포를 염색하는 데 사용되었고 DAPI는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다. 스케일 바는 10 μm입니다. (B) TSA 염색 프로토콜을 사용한 p-RIPK3 (S227) + 복셀의 상대적 정량화. 모든 점은 이미지를 나타내고 빨간색 막대는 중앙값을 나타냅니다. 복셀 카운트 값은 모의 조건에서 이미지의 복셀 카운트의 중앙값을 기준으로 표시됩니다. 통계는 Tukey 보정을 사용하여 다중 비교와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 수행되었습니다. p > 0.05 (n.s.), p≤ 0.05 (*), p≤ 0.01 (**). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: HSV-1 ICP6mutRHIM은 S358에서 인간 MLKL의 ZBP1-의존적 인산화를 유도합니다. (A) 인간 ZBP1-발현 HT-29 세포의 대표적인 공초점 이미지. 세포를 모의 처리하거나 HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5)으로 8 시간 및 10 시간 동안 감염시켰다. TSA를 사용하여 p-MLKL을 검출하였다(S358). ICP0은 바이러스에 감염된 세포를 염색하는 데 사용되었고 DAPI는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다. HSV-1로 10시간 동안 감염시킨 세포의 무1차 (NP) 염색 대조군에서 1차 항-p-MLKL(S358)을 생략한mutRHIM(MOI=5)을 나타내었다. 양성 대조군으로서, 세포를 TNFR1을 통해 괴사를 유도하는 30 ng/mL TNF, 5 μM BV6 및 20 μM ZVAD-fmk로 4시간 동안 자극하였다. 스케일 바는 10 μm입니다. (B) TSA 염색을 p-MLKL에 대한 표준 간접(TSA 없음) 면역형광 염색 프로토콜과 비교한 인간 ZBP1 발현 HT-29 세포의 대표적인 공초점 이미지(S358). 세포를 모의 처리하거나 HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5)으로 9 시간 동안 감염시켰다. 1차 항-p-MLKL(S358) 및 ICP0 항체가 생략된 9시간 동안 HSV-1 ICP6mutRHIM(MOI=5)으로 감염된 세포의 NP 염색 대조군이 포함된다. 특정 p-MLKL(S358) 신호를 검출하는데 필요한 레이저 출력이 영상에 표시된다. (C) 표준(TSA 없음) 및 TSA 염색 프로토콜을 사용한 p-MLKL(S358)+ 복셀의 상대적 정량화. 모든 점은 이미지를 나타내고 빨간색 막대는 중앙값을 나타냅니다. 복셀 카운트 값은 모의 조건에서 이미지의 복셀 카운트의 중앙값을 기준으로 표시됩니다. 통계는 Tukey 보정을 사용하여 다중 비교와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 수행되었습니다. p > 0.05 (n.s.), p ≤ 0.0001 (****). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 인플루엔자 A 바이러스는 인간 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존적 인산화를 유도합니다. (A,C) 인간 ZBP1 발현 HT-29 세포의 대표적인 컨포칼 이미지. 세포를 모의 처리 또는 인플루엔자 A 바이러스 (IAV), PR8 균주 (MOI = 4)로 9 시간 동안 감염시키고 p-RIPK3에 대해 염색 (S227; A) 또는 p-MLKL(S358; C) TSA 프로토콜을 사용합니다. 스케일 바는 10 μm입니다. (B, D) p-RIPK3 (S227) + (B) 또는 p-MLKL (S358; D) 복셀. (B,D)의 모든 점은 이미지를 나타내고 빨간색 막대는 중앙값을 나타냅니다. 복셀 카운트 값은 모의 조건에서 이미지의 복셀 카운트의 중앙값을 기준으로 표시됩니다. 통계는 Mann-Whitney 검정을 사용하여 수행되었습니다. p≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 면역형광 염색 프로토콜은 RIPK3 및 MLKL26의 인산화를 포함하여 검출하기 어려운 인간 괴사 신호 전달 경로의 신호 이벤트에 대한 민감도를 증가시키기 위해 티라마이드 신호 증폭(TSA)의 사용을 설명합니다. TSA 단계를 포함하면 p-RIPK3(S227) 및 p-MLKL(S358)의 검출 임계값이 크게 향상되고 p-MLKL(S358) 변형의 감도가 증가합니다. TSA는 모의 처리된 샘플에 이미 존재하는 p-RIPK3(S227) 신호를 밝혔습니다. 인간 세포에서, S227에서의 RIPK3의 자가인산화는 MLKL과의 안정적인 상호작용을 가능하게 함으로써 괴사증 활성화를 위한 전제 조건이다. 이 과정은 이미 기저 수준에서 발생하며 괴사 유도 2,5,31 이전에 안정적인 비활성 p-RIPK3 (S227) / MLKL 이량 체를 형성합니다. 유사하게, 본 연구에 사용된 항-p-RIPK3 항체는 또한 웨스턴 블롯팅26에 의해 처리되지 않은 세포에서 p-RIPK3을 검출한다(S227).

T357 및 S358에서 활성화 루프 내에서 RIPK3에 의한 MLKL의 인산화는 비활성 p-RIPK3 (S227) / MLKL 복합체의 해리를 초래하고 MLKL이 N- 말단 4 개의 나선 번들 도메인을 노출시키는 구조적 변화를 유도합니다. 그런 다음 활성화된 p-MLKL은 올리고머화되어 세포막으로 이동하여 4개의 나선 다발을 지질 이중층에 삽입하여 세포 용해 1,2,6을 생성합니다. 이 TSA 면역 형광 프로토콜을 사용하여 ZBP358 유발 괴사 동안 S1 MLKL 인산화의 강력한 증가를 감지했습니다. p-MLKL (S358)은 세포질 내 및 원형질막에 군집되어 있으며 ZBP1 활성화시 핵 내에서도 발견되었습니다. 실제로, ZBP1은 IAV 감염 8,30의 맥락에서 핵막의 MLKL 매개 섭동을 자극하는 것으로보고되었다. 그러나 TSA는 관심 항원과 1 차 / 2 차 항체뿐만 아니라 인접한 단백질에도 비오틴-티라 미드를 침착한다는 점에 유의해야합니다. 따라서 TSA는 검출된 단백질의 정확한 세포하 국소화에 대한 정보를 추론하는 데 이상적이지 않으며 공동 국소화 연구에 TSA를 권장하지 않습니다.

반복되는 동결-해동 주기는 비오티닐화된 티라미드의 안정성에 영향을 미칩니다. 신호 감도의 감소를 방지하려면 티라마이드를 부분 추출하고 각 실험에 대해 새로운 부분 표본을 사용하는 것이 좋습니다. 비오틴-티라마이드 스톡의 배치 간 차이에 주의를 기울여야 합니다. 비오틴-티라마이드의 최종 농도가 너무 높으면 TSA 증폭의 비특이적 배경이 특정 신호를 가립니다. 이를 제어하기 위해 모든 새로운 비오틴-티라마이드 배치를 적정하고 1차 항체가 생략된 1차 염색 없는 대조군을 포함하는 것이 좋습니다.

제시된 프로토콜에서 TSA는 하나의 대상으로 제한되었습니다. 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 검출은 동일한 염색에서 결합되지 않았는데, 이는 두 1차 항체가 동일한 종에서 제기되었기 때문이다. 프로토콜은 다중 면역형광 TSA32,33을 사용하여 동일한 샘플 내에서 다중 TSA-증폭 신호(예를 들어, p-RIPK3[S227] 및 p-MLKL[S358])를 검출하도록 조정될 수 있다. 마지막으로, 면역형광 현미경을 위한 TSA 매개 증폭은 보고된 신호 대 잡음비가 좋지 않은 다른 신호 경로의 바이오마커를 인식하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

VIB Bioimaging Core의 교육, 지원 및 장비 파크 이용에 감사드립니다. J.N.은 플랑드르 연구 재단 (FWO)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. JM 그룹의 연구는 Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Research Foundation Flanders (FWO)의 주니어 연구 보조금 (G031022N), CRIG 젊은 연구자 개념 증명 보조금 및 겐트 대학의 지원을 받았습니다. P.V. 그룹의 연구는 EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO 선임 연구 보조금 (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation Against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG 및 GIGG 컨소시엄, VIB의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

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References

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면역학 및 감염 188호
인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭
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Nemegeer, J., Lemeire, K.,… More

Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

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