Summary
هنا ، نقدم بروتوكولات لتحديد وتنقية خلايا المبيض من بصيلات الغار. نوضح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع حصاد البصيلات الغارية السليمة التي يتم معالجتها إنزيميا لتحرير أنواع متعددة من الخلايا المقيمة في البصيلات ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، والثيكا ، والبطانة ، المكونة للدم ، والخلايا اللحمية.
Abstract
يعد تنشيط البويضات ونموها وتطورها ونضجها عملية معقدة يتم تنسيقها ليس فقط بين أنواع متعددة من خلايا المبيض ولكن أيضا عبر نقاط تحكم متعددة داخل دائرة المهاد / الغدة النخامية / المبيض. داخل المبيض ، تنمو أنواع متعددة من الخلايا المتخصصة في ارتباط وثيق مع البويضة داخل جريبات المبيض. تم وصف بيولوجيا هذه الخلايا بشكل جيد في المراحل اللاحقة ، عندما يتم استردادها بسهولة كمنتجات ثانوية للعلاجات الإنجابية المساعدة. ومع ذلك ، فإن التحليل المتعمق للجريبات الغارية الصغيرة المعزولة مباشرة من المبيض لا يتم إجراؤه بشكل شائع بسبب ندرة أنسجة المبيض البشري ومحدودية الوصول إلى المبيض في المرضى الذين يخضعون للعلاج الإنجابي المساعد.
تتيح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع التحديد / العزل المتزامن للخلايا المقيمة في المبيض إجراء تحليل عالي الدقة للمراحل المبكرة من تطور الجريب الغاري. نوضح بروتوكولات لعزل أنواع الخلايا المنفصلة عن طريق معالجة الجريبات الغارية إنزيميا وفصل الخلايا الحبيبية والثيكا والبطانية والمكونة للدم واللحمية. يتيح عزل الخلايا عن الجريبات الغارية بأحجام ومراحل نمو مختلفة التحليل الشامل للآليات الخلوية والجزيئية التي تدفع نمو البصيلات وفسيولوجيا المبيض ويوفر مصدرا للخلايا القابلة للحياة التي يمكن زراعتها في المختبر لتلخيص البيئة المكروية للجريب.
Introduction
العناصر الوظيفية الأساسية للمبيض البشري هي البصيلات التي تحكم نمو وتطور البويضات. تم وضع بروتوكولات عزل الخلايا المسامية بشكل جيد في سياق الإخصاب في المختبر ، ولكنها مناسبة فقط لجمع الخلايا من بصيلات اللوتين عند نقطة استرجاع البويضة1. لقد طورنا بروتوكولا يتيح عزل مجموعات الخلايا المنفصلة من الجريبات الغارية في مراحل النمو المختلفة التي تنشأ من المبايض الأصلية أو أنسجة المبيض المزروعةبالأجانب 2. على الرغم من وجود إجماع على أن مساهمات الخلايا المقيمة في الجريب في زراعة البويضة مهمة للغاية ، إلا أن القليل من الدراسات قد حددت واستخرجت الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة في بصيلات المرحلة الغارية. إن الفهم الأعمق للتسلسل الهرمي للتمايز ونقل الإشارات بين الخلايا المتخصصة خلال مراحل النمو المختلفة يمكن أن يوسع فهمنا لفسيولوجيا المبيض في ظل الظروف الاستتبابية والمرضية. علاوة على ذلك ، فإن التمييز بين الأنواع الفرعية الخلوية المنفصلة ومساهماتها الجزيئية في نمو / نضج الجريب قد يوفر وسيلة لتوليد بدائل خارج الجسم الحي تعيد بناء وظيفة المبيض لتعزيز نضوج البويضة و / أو علاج ضعف الغدد الصماء.
يساهم كل نوع فريد من الخلايا داخل المبيض في الوظيفة المعقدة للجريب ، والتي تعمل بشكل فعال كعضو صغير منفصل لتعزيز نمو ونضج البويضة التي تحتوي عليها. يتم تغليف البويضة ، وهي محور الجريب ، مباشرة بطبقة مستمرة من الخلايا الحبيبية (GCs) ، حيث تشكل خلايا الثيكا (TCs) طبقة ثانوية من الخلايا التي تتحد مع البويضة و GCs لتكوين الوحدة المسامية. على الرغم من تصنيفها إلى مجموعتين ، إلا أن GCs و TCs تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية. يتم تصنيف GCs وفقا لموقعها داخل المسام ؛ يتم تعيين GCs التي تحيط بالبويضة مقابل تلك المجاورة للغشاء القاعدي على أنها GCs بيضوية وجدارية ، على التوالي ، وتعرض هذه الأنواع الفرعية توقيعات نسخية فريدة. تحتوي TCs على العديد من الأنواع الفرعية التي تعمل على توفير الدعم الستيرويدي والأيضي والهيكلي. تلعب الخلايا البطانية وحول الأوعية الدموية والخلايا المناعية دورا مركزيا في الحفاظ على فسيولوجيا المبيض الطبيعية. لا تعمل سدى المبيض كركيزة لنمو الجريب فحسب ، بل من المحتمل أيضا أن توفر مصدرا للأسلاف التي تؤدي إلى ظهور TCs. هذا المركب متعدد الطبقات من الأنواع الفرعية الخلوية داخل المبيض هو ما يمكن من وظيفته كعضو غدد صماء وعضو تناسلي.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتحديد وتنقية الخلايا الحبيبية ، الثيكا ، اللحمية ، البطانية ، والمكونة للدم من الجريبات الغارية. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل خلايا المبيض هذه وتحليلها باستخدام تسلسل الخلية الواحدة ، متبوعا بتلطيخ محدد في بصيلات مراحل النمو المختلفة. يوفر البروتوكول منهجية مباشرة قابلة للتكرار وستمكن من التحليل عالي الدقة لكل من فسيولوجيا وأمراض المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في طب وايل كورنيل. تم إجراء جميع تجارب زرع الأجانب باستخدام أنسجة المبيض وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تم عزل كلا المبيضين من متبرع عضو ميت دماغيا يبلغ من العمر 14 عاما وليس له تاريخ من العلاج الإشعاعي / الكيميائي ولا يوجد تاريخ موثق لأمراض الغدد الصماء أو الإنجاب. وافقت لجنة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابعة ل Weill Cornell Medicine على جمع الأنسجة ، وتم الحصول على موافقة من عائلة المتبرع بالأعضاء بعد الموافقة المستنيرة فيما يتعلق باستخدام الأنسجة.
1. جمع أنسجة المبيض والتعامل معها
- جمع المبايض الكاملة والأنسجة المرتبطة بها ، وشطف في محلول ملحي معقم.
- باستخدام ملاقط معقمة ، ضع المبايض في وعاء معقم. صب محلول معقم ومخزن وبارد (على سبيل المثال ، وسط Leibovitz's L-15) في الحاوية. تأكد من تغطية الأنسجة بالكامل بالسائل.
- أغلق الحاوية وقم بتكديسها مرتين باستخدام أكياس بلاستيكية معقمة. انقل الحاوية على الثلج داخل صندوق معزول (مثل الستايروفوم). نقل العينات إلى المختبر الذي سيقوم بمعالجة المبايض في أسرع وقت ممكن ، ويفضل أن يكون ذلك في وقت لا يتجاوز 5 ساعات 3,4.
2. معالجة أنسجة المبيض
ملاحظة: تأكد من تحضير جميع الكواشف والأدوات قبل وصول الأنسجة إلى المختبر لتقليل الفاصل الزمني الإقفاري قدر الإمكان. يمكن تحضير المخازن المؤقتة حتى 1 أسبوع قبل التجميد وتبريدها حتى الاستخدام.
- الاستعدادات لمعالجة المبيض والتجميد
- وضع أدوات جراحية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية استعدادا لمعالجة الأنسجة: مشرط رقم 21 ؛ مشرط واحد رقم 11 ؛ مقص منحني ناعم حاد ملقط طويل واحد (~ طول 150 مم) ؛ واثنين من ملقط متوسط (~ طول 110 مم).
- تحضير 100 مل من وسط معالجة الأنسجة (انظر جدول المواد): وسط ليبوفيتز L-15 يحتوي على محلول مضاد حيوي مضاد حيوي وفلتر باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر. حافظ على الوسط باردا.
- قم بتسمية المبردات ، وأضف 1.5 مل من محلول التجميد (انظر جدول المواد) إلى كل قارورة ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- تتوفر لوحة من 6 آبار في متناول اليد للاستخدام.
- عند وصول الأنسجة
- رش الحاوية بمحلول إيثانول بنسبة 70٪ ، وامسحها جيدا ، وضعها داخل خزانة السلامة الحيوية.
- ارتداء قفازات معقمة ، افتح الحاوية. ضع المبيض في طبق بتري معقم ، واسكب وسطا مبردا (من الخطوة 2.1.2) لترطيب الأنسجة. تأكد من أن المبيض نصف مغمور في الوسط.
- إزالة أي خيوط أو مواد أخرى وتشريح الأنسجة المحيطة المتبقية بعيدا عن المبيض.
3. عزل بصيلات الغار
- تحديد بصيلات فردية للعزل. عند اختيار بصيلات صحية ، استبعد أي بصيلات مملوءة بالدم أو داكنة أو غير متماثلة ، حيث من المحتمل أن تكون هذه الجريبات.
- عزل الجريبات الغارية المختارة من المبيض بأكمله باستخدام المشارط ، والحفاظ على الغار سليما عن طريق استئصال الأنسجة القشرية التي تشمل الجريب.
- ضع كل جريب غاري سليم تم استئصاله في بئر واحد من اللوحة المكونة من 6 آبار. إذا لزم الأمر لأغراض وصفية ، استخدم مسطرة موضوعة أسفل الطبق لتحديد قطر الجريب.
- باستخدام مشرط ، قم بتقسيم الجريب الغاري السليم للوصول إلى التجويف الغاري ، وأضف 4 مل من وسط انفصال الخلايا الأنزيمية. احتضان الطبق في حاضنة مرطبة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- كرر استخراج بصيلات غارية إضافية حسب الحاجة.
4. عزل الخلايا المقيمة للجريب
- بعد الحضانة ، أضف 4 مل من الوسط المتاح الذي يحتوي على 20٪ FBS ، واغسله عن طريق السحب المتكرر والقوي للوسط فوق البصيلات المنقسمة باستخدام P1000 micropipette.
- جمع الوسيط ، وتمريره من خلال مرشح 100 ميكرومتر.
- جهاز طرد مركزي الطافاح المصفى عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. نضح المادة الطافية ، واحتفظ بحبيبات الخلية (المخصبة ب GCs) على الثلج لوضع العلامات وفرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS).
- ضع الأنسجة المتبقية في خليط من كولاجيناز (100 وحدة / مل) و dispase (1 وحدة / مل) مخفف في محلول ملحي متوازن (على سبيل المثال ، هانكس) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية ، مما يؤدي إلى تعطيل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق التثليث والامتصاص القوي (أي 10-15 يمر عبر طرف الماصة) مرتين بعد 10 دقائق و 20 دقيقة.
- استرجع الوسائط التي تحتوي على الأنسجة ، واغسلها عن طريق السحب من خلال طرف ماصة P1000 micropipette ، وقم بالضغط من خلال مرشح 100 ميكرومتر.
- أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. نضح المادة الطافية ، وضع جانبا حبيبات الخلية (المخصب ب TCs وخلايا السدى) على الجليد لوضع العلامات و FACS.
5. فرز الخلايا المنشط بالفلورة
- أعد تعليق كريات الخلايا في محلول مانع (PBS + 0.1٪ FBS) ، واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ونضح الطاف.
- أعد تعليق كريات الخلايا في محلول مانع يحتوي على أجسام مضادة مقترنة مباشرة (انظر الجدول 1 للحصول على مجموعات الأجسام المضادة المناسبة لتحديد GCs و TCs) ، واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق.
- اغسل الخلايا وطردها مركزيا على حرارة 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، وتشغيل تعليق الخلية من خلال أداة FACS لالتقاط عدد صغير من الخلايا (500-1000) باستخدام شدة مضان الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور للبوابة.
- لتحديد المجموعات السكانية الفرعية الفريدة ، استخدم استراتيجيات البوابات التالية:
- لتنقية GCs ، ارسم بوابة حول خلايا CD45 + (الشكل 1B) ، واستبعد هذه المجموعة من السكان CD99 + (الشكل 1A والشكل 1C) ؛ بعد ذلك ، قم بتقسيم جزء CD99 + المتبقي إلى كسور PVRL +/- (الشكل 1A والشكل 1C).
- لتنقية TCs والسدى ، قم ببوابة إجمالي ENG + (الشكل 1A) أو CD55 + (الشكل 1D) لاستبعاد الجزء البطاني CD34 + (الشكل 1E) وتمييز الخلايا الستيرويدية (ANPEP +) وغير الستيرويدية (ANPEP-). كن حذرا للتعويض عن النزيف بين الفلوروفورات القريبة في أطياف الانبعاث.
- للتحقق من نقاء جزء الخلية الذي تم فرزه ، قم بتشغيل 5٪ من إجمالي الحجم الملتقط من خلال أداة FACS ، وتأكد من أن الخلايا تملأ البوابات المتوقعة وأنها موجودة بنقاوة >95٪.
6. معالجة الأنسجة القشرية المبيض
- يقسم ما تبقى من المبيض إلى شطرين، ويستأصل النخاع باستخدام مقص ومشارط دقيقة منحنية، مع الحرص على تجنب تلف قشرة المبيض.
- استمر في معالجة قشرة المبيض وترققها عن طريق الكشط اللطيف حتى يبقى الحد الأدنى من النخاع. تأكد من استخدام الحد الأدنى من القوة اللازمة.
ملاحظة: يجب أن يتراوح سمك الأنسجة القشرية بين 1 مم و 1.5 مم. - قسم الأنسجة القشرية إلى شرائح بعرض 2-3 مم على طول المبيض.
7. تجميد بطيء لأنسجة المبيض
- التحضير للتجميد
- ضع شريطا قشريا واحدا في كل قارورة مبردة مبردة تحتوي على محلول تجميد.
- رج القنينات المبردة التي تحتوي على الشرائط القشرية على طبق دوار لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تجميد بطيء لأنسجة المبيض5
- ضع المبردات التي تحتوي على أنسجة المبيض في مجمد قابل للبرمجة يبدأ عند 0 درجة مئوية.
- تبرد بمعدل 2 درجة مئوية / دقيقة حتى -7 درجة مئوية.
- الحفاظ على cryovials في درجة الحرارة هذه لمدة 10 دقائق.
- نواة تكوين بلورات الجليد عن طريق لمس كل cryovial مع طرف القطن الذي تم غمرها لفترة وجيزة في النيتروجين السائل (LN2).
- تبرد بمعدل 0.3 درجة مئوية / دقيقة حتى تصل درجة حرارة العينة إلى -40 درجة مئوية.
- قم بزيادة معدل التبريد إلى 10 درجة مئوية / دقيقة حتى تصل درجة حرارة العينة إلى -140 درجة مئوية.
- نقل cryovials للتخزين في LN2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بعزل البصيلات من سطح المبيض ومعالجتها إنزيميا لعزل GCs وكذلك خلايا theca و stroma المحيطة بالتجويف الغاري. تم جمع الخلايا ، وتم فرز كسور الخلايا من البصيلات الغارية (بأقطار تتراوح بين 0.5 مم و 4 مم) بواسطة FACS إلى نقاء >95٪ (الشكل 1).
لتسمية وتنقية الكسور الخلوية الفريدة داخل بصيلات الغار البشري ، قمنا بدمج الهضم الأنزيمي مع الفرز الخلوي للتدفق. لقد حددنا سابقا البروتينات السطحية التي تحدد على وجه التحديد الكسور المقيمة في الجريب2. لقد أظهرنا أن CD99 (الأحمر في الشكل 1A) يصنف على وجه التحديد GCs ، وأن PVRL1 (الأصفر في الشكل 1A) يتم توطينه بشكل متزايد في حجرة GC الممتلئة مع زيادة البصيلات الغارية في الحجم2. لقد أظهرنا أيضا أن الأجسام المضادة ضد endoglin (ENG ، الأخضر في الشكل 1A) أو CD55 (الشكل 1D) تحدد على وجه التحديد جميع السدى و TCs وأن ألانين أمينوببتيداز (ANPEP ، الشكل 1E) يتم التعبير عنه على وجه التحديد بواسطة TCs منشط الذكورة 2,6.
تم تمييز الخلايا بجسم مضاد موجه ضد CD99 لتحديد GCs ، وتم استخدام الأجسام المضادة ضد CD45 لاستبعاد الخلايا المكونة للدم (الشكل 1B ، C). مكنت الأجسام المضادة ضد PVRL1 من فصل سكان GC إلى مقصورات بيضوية وجدارية (الشكل 1C). بعد الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز / ديسباز ، مكنت مستحضرات الخلايا الموسومة بأجسام مضادة ضد CD55 (أو بدلا من ذلك ENG) و CD34 و ANPEP من التقاط جميع السدى / TCs (CD55 +) و / أو TCs الأندروجينية (ANPEP +) ، مع استبعاد الخلايا البطانية (CD34 +) من مجموعات TC (الشكل 1D ، E). باستخدام هذه اللوحة وبروتوكول التفكك الأنزيمي التدريجي ، قمنا بتسمية وتنقية الخلايا المكونة للدم ، والبطانة ، والحبيبية (البويضة والجدارية) ، و theca (اللحمية والأندروجينية) من الجريبات الغارية للمبيض الذي تم استئصاله حديثا.
الشكل 1: وضع العلامات على الخلايا الخاصة بالنسب وتنقيتها من الحويصلات الغارية البشرية. (أ) صورة مجهرية تمثيلية تبين مقصورات GC (CD99+ PVRL+/-) وTC (ENG+) داخل الجريبات البشرية في المرحلة الغارية؛ يتم تكبير مربعات الحدود البيضاء إلى اليمين. (ب - ه) مخططات فرز تمثيلية تحدد GCs على أنها خلايا CD45- CD99 + PVRL1 + / - (a و b) بالإضافة إلى الخلايا العامة (CD34- CD55 +) والأندروجينية (CD34- CD55 + ANPEP +) TCs (C ، D). يتم تقاسم السكان المسورة بين (B ، C) و (D ، E) ؛ يتم عرض عناصر التحكم غير الملوثة إلى اليسار في (B-E). شريط المقياس = (أ) 100 ميكرومتر. الاختصارات: GC = خلية حبيبية. TC = خلية ثيكا ؛ PVRL = نكتين ؛ ANPEP = ألانين أمينوببتيداز ؛ Nuc = النواة ؛ SSC = مبعثر جانبي ؛ PE = فيكوريثرين. APC = الوفيكوسيانين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نوع الخلية | تضمين الأجسام المضادة | استبعاد الأجسام المضادة |
| الخلايا الحبيبية | CD99 (PVRL+/-) | سي دي 45 |
| جميع خلايا ثيكا | CD55 أو المهندس | CD34 و CD45 |
| خلايا ثيكا الستيرويدية | أنبيب | CD34 و CD45 |
الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها لتحديد GCs و TCs وسدى المبيض. الاختصارات: GC = خلية حبيبية. TC = خلية ثيكا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد تحسين دقة التنوع الخلوي داخل بصيلات المبيض أمرا مهما سريريا لعدة أسباب. عند تطبيق البروتوكول أعلاه على عزل الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة داخل بصيلات المرحلة الغارية ، يجب مراعاة عدة عوامل. أولا ، تعد صحة وصلاحية أنسجة المبيض التي تستمد منها الجريب الغاري أمرا بالغ الأهمية في تحديد جودة الخلايا ونجاح التطبيقات النهائية. يمكن تحسين ذلك عن طريق تقليل الفاصل الزمني الإقفاري ، والعمل بسرعة (يفضل أن يكون ذلك في أزواج) ، وإعداد المساحات المختبرية التي سيتم استخدامها لمعالجة الأنسجة و FACS. ثانيا ، هذه البروتوكولات مناسبة تماما لبصيلات المرحلة الغارية على وجه التحديد لأنه يمكن تحديدها بسهولة واستخراجها من المبيض للوصول بكفاءة إلى التجويف الغاري. إن اتباع نهج مماثل لدراسة الجريبات في المراحل المبكرة وما قبل الغار من شأنه أن ينتج مجموعة خلايا ذات تجانس أكبر بكثير. أخيرا ، سيختلف عدد ونوعية الخلايا التي تم الحصول عليها من البصيلات بشكل كبير اعتمادا على مدى تقدم الجريب من الناحية التنموية وما إذا كانت الجريب قد دخلت في حالة رتق أم لا. في حين أن هذه القيود تجعل دراسة إعادة بناء تكوين الجريبات تحديا ، فإن العزل الفعال والقوي للخلايا المشتقة من الجريب سيمكن من مزيد من الاستجواب للآليات الكامنة وراء بيولوجيا المبيض البشري والعقم.
تم استخدام تنقية GCs من الجريبات الغارية سابقا من قبل مجموعتنا لإثبات التأثير الضار للمستويات الفسيولوجية الفائقة لهرمون مضاد مولر (AMH) على نمو الجريب6. في تلك الدراسة ، تم زرع أنسجة المبيض المحفوظة بالتبريد والمذابة من كل من مرضى الحفاظ على الخصوبة والمتبرعين بالأعضاء في الفئران التي تعاني من نقص المناعة في أذرع تجريبية مختلفة: الخلايا البطانية الضابطة أو التي تعبر عن AMH. أدى التعرض المزمن ل AMH إلى نمط ظاهري من اللوتين المتسارع الذي انعكس في زيادة حجم الجريب ، ولكن تم توضيح ذلك بوضوح فقط في التوقيع الجزيئي ل GCs المقيمة في الجريب.
عندما تخرج البويضة من السكون ، تكتسب GCs مورفولوجيا مكعبة7 ، وتبدأ في التكاثر ، وتفرز مع البويضة إشارات تجند خلايا السدى المحيطة وتعزز تمايزها نحو مصير TC8. على الرغم من أنه من المعروف أن التمايز الصحيح لخلايا السدى إلى TCs المتخصصة ضروري للخصوبة ، إلا أن الآليات التي تدفع مواصفات TC وتحكم تفاعلها مع الخلايا المقيمة في الجريب أثناء نضوج البويضة ليست محددة جيدا. في البشر ، لا يزال عدم التجانس الخلوي الموجود في TCs المحيطة بالجريب بعيد المنال بشكل خاص لأنه ، على عكس GCs ، التي يمكن الوصول إليها بسهولة في بيئة التلقيح الاصطناعي ، تتطلب عزلة وثقافة TCs خزعة مباشرة من بصيلات ما قبل التبويض. بالإضافة إلى ذلك ، اعتمدت معظم الدراسات على التفكك الميكانيكي لطبقة الثيكا من البصيلات الغاريةالمعزولة 9,10 ، مما أدى إلى مزيج غير متجانس من اللحميات ، الثيكا ، الأوعية الدموية ، والمناعة.
كشفت مناهج الخلايا المتعددة أحادية الخلية عن عدم التجانس الخلوي للعديد من الأنسجة وأنواع الخلايا المتنوعة التي تعزز نمو البويضة داخل المبيض الموجودة داخل البصيلات عبر مجموعة واسعة من الأحجام ومراحل النضج. تكمل الطرق الموضحة أعلاه البروتوكولات الحالية لعزل وتجميد أنسجة المبيض لغرض الحفاظ على الخصوبة ويمكن تنفيذها بالتوازي لشراء الخلايا المقيمة في الجريب للأغراض السريرية أو التجريبية. سيكون تطبيق هذه الطرق مهما لفك رموز الآليات الجزيئية التي تحكم تكوين الجريبات البشري وهي شرط أساسي حاسم للنهج التي تهدف إلى تعزيز تطور / نضج البويضة من البصيلات البدائية في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالدعم المقدم من جائزة كويني فيكتورينا نيري للباحثين (D.J.) وجائزة Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). يتم دعم NLG من خلال منحة تدريب ما بعد الدكتوراه للخلايا الجذعية والطب التجديدي في NYSTEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
