Summary

استخراج وتوسيم وتنقية الخلايا الخاصة بالنسب من الجريبات الغارية البشرية

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات لتحديد وتنقية خلايا المبيض من بصيلات الغار. نوضح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع حصاد البصيلات الغارية السليمة التي يتم معالجتها إنزيميا لتحرير أنواع متعددة من الخلايا المقيمة في البصيلات ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، والثيكا ، والبطانة ، المكونة للدم ، والخلايا اللحمية.

Abstract

يعد تنشيط البويضات ونموها وتطورها ونضجها عملية معقدة يتم تنسيقها ليس فقط بين أنواع متعددة من خلايا المبيض ولكن أيضا عبر نقاط تحكم متعددة داخل دائرة المهاد / الغدة النخامية / المبيض. داخل المبيض ، تنمو أنواع متعددة من الخلايا المتخصصة في ارتباط وثيق مع البويضة داخل جريبات المبيض. تم وصف بيولوجيا هذه الخلايا بشكل جيد في المراحل اللاحقة ، عندما يتم استردادها بسهولة كمنتجات ثانوية للعلاجات الإنجابية المساعدة. ومع ذلك ، فإن التحليل المتعمق للجريبات الغارية الصغيرة المعزولة مباشرة من المبيض لا يتم إجراؤه بشكل شائع بسبب ندرة أنسجة المبيض البشري ومحدودية الوصول إلى المبيض في المرضى الذين يخضعون للعلاج الإنجابي المساعد.

تتيح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع التحديد / العزل المتزامن للخلايا المقيمة في المبيض إجراء تحليل عالي الدقة للمراحل المبكرة من تطور الجريب الغاري. نوضح بروتوكولات لعزل أنواع الخلايا المنفصلة عن طريق معالجة الجريبات الغارية إنزيميا وفصل الخلايا الحبيبية والثيكا والبطانية والمكونة للدم واللحمية. يتيح عزل الخلايا عن الجريبات الغارية بأحجام ومراحل نمو مختلفة التحليل الشامل للآليات الخلوية والجزيئية التي تدفع نمو البصيلات وفسيولوجيا المبيض ويوفر مصدرا للخلايا القابلة للحياة التي يمكن زراعتها في المختبر لتلخيص البيئة المكروية للجريب.

Introduction

العناصر الوظيفية الأساسية للمبيض البشري هي البصيلات التي تحكم نمو وتطور البويضات. تم وضع بروتوكولات عزل الخلايا المسامية بشكل جيد في سياق الإخصاب في المختبر ، ولكنها مناسبة فقط لجمع الخلايا من بصيلات اللوتين عند نقطة استرجاع البويضة1. لقد طورنا بروتوكولا يتيح عزل مجموعات الخلايا المنفصلة من الجريبات الغارية في مراحل النمو المختلفة التي تنشأ من المبايض الأصلية أو أنسجة المبيض المزروعةبالأجانب 2. على الرغم من وجود إجماع على أن مساهمات الخلايا المقيمة في الجريب في زراعة البويضة مهمة للغاية ، إلا أن القليل من الدراسات قد حددت واستخرجت الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة في بصيلات المرحلة الغارية. إن الفهم الأعمق للتسلسل الهرمي للتمايز ونقل الإشارات بين الخلايا المتخصصة خلال مراحل النمو المختلفة يمكن أن يوسع فهمنا لفسيولوجيا المبيض في ظل الظروف الاستتبابية والمرضية. علاوة على ذلك ، فإن التمييز بين الأنواع الفرعية الخلوية المنفصلة ومساهماتها الجزيئية في نمو / نضج الجريب قد يوفر وسيلة لتوليد بدائل خارج الجسم الحي تعيد بناء وظيفة المبيض لتعزيز نضوج البويضة و / أو علاج ضعف الغدد الصماء.

يساهم كل نوع فريد من الخلايا داخل المبيض في الوظيفة المعقدة للجريب ، والتي تعمل بشكل فعال كعضو صغير منفصل لتعزيز نمو ونضج البويضة التي تحتوي عليها. يتم تغليف البويضة ، وهي محور الجريب ، مباشرة بطبقة مستمرة من الخلايا الحبيبية (GCs) ، حيث تشكل خلايا الثيكا (TCs) طبقة ثانوية من الخلايا التي تتحد مع البويضة و GCs لتكوين الوحدة المسامية. على الرغم من تصنيفها إلى مجموعتين ، إلا أن GCs و TCs تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية. يتم تصنيف GCs وفقا لموقعها داخل المسام ؛ يتم تعيين GCs التي تحيط بالبويضة مقابل تلك المجاورة للغشاء القاعدي على أنها GCs بيضوية وجدارية ، على التوالي ، وتعرض هذه الأنواع الفرعية توقيعات نسخية فريدة. تحتوي TCs على العديد من الأنواع الفرعية التي تعمل على توفير الدعم الستيرويدي والأيضي والهيكلي. تلعب الخلايا البطانية وحول الأوعية الدموية والخلايا المناعية دورا مركزيا في الحفاظ على فسيولوجيا المبيض الطبيعية. لا تعمل سدى المبيض كركيزة لنمو الجريب فحسب ، بل من المحتمل أيضا أن توفر مصدرا للأسلاف التي تؤدي إلى ظهور TCs. هذا المركب متعدد الطبقات من الأنواع الفرعية الخلوية داخل المبيض هو ما يمكن من وظيفته كعضو غدد صماء وعضو تناسلي.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتحديد وتنقية الخلايا الحبيبية ، الثيكا ، اللحمية ، البطانية ، والمكونة للدم من الجريبات الغارية. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل خلايا المبيض هذه وتحليلها باستخدام تسلسل الخلية الواحدة ، متبوعا بتلطيخ محدد في بصيلات مراحل النمو المختلفة. يوفر البروتوكول منهجية مباشرة قابلة للتكرار وستمكن من التحليل عالي الدقة لكل من فسيولوجيا وأمراض المبيض.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في طب وايل كورنيل. تم إجراء جميع تجارب زرع الأجانب باستخدام أنسجة المبيض وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تم عزل كلا المبيضين من متبرع عضو ميت دماغيا يبلغ من العمر 14 عاما و?…

Representative Results

قمنا بعزل البصيلات من سطح المبيض ومعالجتها إنزيميا لعزل GCs وكذلك خلايا theca و stroma المحيطة بالتجويف الغاري. تم جمع الخلايا ، وتم فرز كسور الخلايا من البصيلات الغارية (بأقطار تتراوح بين 0.5 مم و 4 مم) بواسطة FACS إلى نقاء >95٪ (الشكل 1). لتسمية وتنقية الكسور الخلوية الفر…

Discussion

يعد تحسين دقة التنوع الخلوي داخل بصيلات المبيض أمرا مهما سريريا لعدة أسباب. عند تطبيق البروتوكول أعلاه على عزل الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة داخل بصيلات المرحلة الغارية ، يجب مراعاة عدة عوامل. أولا ، تعد صحة وصلاحية أنسجة المبيض التي تستمد منها الجريب الغاري أمرا بالغ الأهمي?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالدعم المقدم من جائزة كويني فيكتورينا نيري للباحثين (D.J.) وجائزة Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). يتم دعم NLG من خلال منحة تدريب ما بعد الدكتوراه للخلايا الجذعية والطب التجديدي في NYSTEM.

Materials

Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher Scientific 15240062 Anti-Anti
Antifade Mountant solution Thermo Fisher Scientific  P36930 ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum Millipore Sigma C 2674
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Dispase II, powder Thermo Fisher Scientific 17105041
DMSO Millipore Sigma D 2650 Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190144
Enzyme Cell Detachment Medium  Thermo Fisher Scientific 00-4555-56 Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated Thermo Fisher Scientific 10438026
Hanks′ Balanced Salt solution Thermo Fisher Scientific 14175079 no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium  Thermo Fisher Scientific 11415064
Normal Saline Quality Biological 114-055-101
Sucrose Millipore Sigma S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
– 69.64 mL of Leibovitz's L-15
– 17.66 mL of fetal bovine serum
– 3.42 g of sucrose
– 10.65 mL of DMSO
– 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated  Corning 351146 Falcon
Cell Strainer 100 µm Fisher scientific 352360 Corning, Falcon
Cryovials Thermo Fisher Scientific 377267 CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm  Millipore Sigma CLS430599 60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL Fisher scientific 352235 Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm Corning 431154
Antibodies
ANPEP BioLegend 301703
CD34 R&D Systems FAB7227A
CD45 BioLegend 304019
CD55 BioLegend 311306
CD 99 BioLegend 371308
PVRL BioLegend 340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length) Fisherbrand 12-000-128 Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length) Fisherbrand 12-000-157 Fisher Scientific
number 21 scalpel Andwin Scientific  EF7281H Fisher Scientific
number 11 scalpel Andwin Scientific  FH/CX7281A Fisher Scientific
sharp fine curved scissors Roboz Surgical RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter BD
LSM 710 META Confocal microscope Zeiss

References

  1. Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
  2. Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
  3. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  4. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  5. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  6. Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
  7. Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
  8. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
  9. Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
  10. Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).

Play Video

Cite This Article
Man, L., Lustgarten Guahmich, N., Kallinos, E., Arazi, L., Rosenwaks, Z., James, D. Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles. J. Vis. Exp. (189), e64402, doi:10.3791/64402 (2022).

View Video