Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקולים לזיהוי וטיהור תאי שחלה מזקיקים אנטראליים. אנו מרחיבים שיטות לעיבוד שחלות שלמות לשימור בהקפאה של רצועות קליפת המוח תוך קצירת זקיקים אנטראליים שלמים המטופלים באופן אנזימטי כדי לשחרר סוגים רבים של תאים שוכנים זקיקים, כולל גרנולוסה, תיקה, אנדותל, המטופויטים ותאי סטרומה.
Abstract
ההפעלה, הצמיחה, ההתפתחות וההבשלה של הביציות הוא תהליך מורכב המתואם לא רק בין סוגי תאים מרובים של השחלה, אלא גם על פני נקודות בקרה מרובות בתוך מעגל ההיפותלמוס/יותרת המוח/השחלות. בתוך השחלה, מספר סוגי תאים מיוחדים גדלים בקשר הדוק עם הביצית בתוך זקיקי השחלות. הביולוגיה של תאים אלה תוארה היטב בשלבים מאוחרים יותר, כאשר הם מתאוששים בקלות כתוצרי לוואי של טיפולי פוריות בסיוע. עם זאת, ניתוח מעמיק של זקיקים אנטראליים קטנים שבודדו ישירות מהשחלה אינו מתבצע בדרך כלל בשל המחסור ברקמת שחלה אנושית והגישה המוגבלת לשחלה בחולות העוברות טיפולי פוריות בסיוע.
שיטות אלה לעיבוד שחלות שלמות להקפאה של רצועות קליפת המוח עם זיהוי/בידוד מקביל של תאים שוכנים בשחלות מאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של השלבים המוקדמים של התפתחות זקיק אנטראלי. אנו מדגימים פרוטוקולים לבידוד סוגי תאים בדידים על ידי טיפול בזקיקים אנטראליים באופן אנזימטי והפרדת תאי גרנולוסה, תקה, אנדותל, המטופויטים וסטרומה. בידוד התאים מהזקיקים האנטרליים בגדלים שונים ובשלבי התפתחות שונים מאפשר ניתוח מקיף של המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים את צמיחת הזקיקים ואת הפיזיולוגיה השחלתית ומספק מקור לתאים בני קיימא שניתן לגדל בתרבית במבחנה כדי לשחזר את מיקרו-סביבת הזקיק.
Introduction
המרכיבים הפונקציונליים העיקריים של השחלה האנושית הם הזקיקים, השולטים בצמיחה ופיתוח של ביציות. פרוטוקולים לבידוד תאים פוליקולריים נקבעו היטב בהקשר של הפריה חוץ גופית , אך אלה מתאימים רק לאיסוף תאים מזקיקים לוטאין בנקודת שאיבת הביציות1. פיתחנו פרוטוקול המאפשר בידוד אוכלוסיות תאים בדידות מזקיקים אנטראליים בשלבי התפתחות שונים הנובעים משחלות טבעיות או מרקמת שחלה מושתלת2. למרות שקיים קונצנזוס כי תרומתם של תאים שושבי זקיקים לטיפוח הביצית חשובה ביותר, מחקרים מעטים זיהו וחילצו באופן פרוספקטיבי את תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים הקיימים בזקיקים בשלב האנטראלי. הבנה מעמיקה יותר של היררכיית ההתמיינות והעברת האותות בין תאים מתמחים בשלבי ההתפתחות השונים עשויה להרחיב את הבנתנו את הפיזיולוגיה של השחלות בתנאים הומיאוסטטיים ופתולוגיים. יתר על כן, ההבחנה בין תת-סוגים תאיים בדידים ותרומתם המולקולרית לגדילה/הבשלה של זקיקים עשויה לספק אמצעי ליצירת פונדקאיות ex vivo המשחזרות את תפקוד השחלות כדי לעודד הבשלת ביציות ו / או לטפל בתפקוד אנדוקריני.
כל סוג תא ייחודי בתוך השחלה תורם לתפקוד המורכב של הזקיק, המתפקד למעשה כמיני-איבר נפרד לטיפוח הצמיחה וההבשלה של הביצית שהוא מכיל. הביצית, החלק המרכזי של הזקיק, עטופה ישירות בשכבה רציפה של תאי גרנולוזה (GCs), כאשר תאי התקה (TC) יוצרים שכבה משנית של תאים המשתלבים עם הביצית וה-GCs כדי להרכיב את היחידה הפוליקולרית. למרות שהם מסווגים לשתי קבוצות, GCs ו- TCs מכילים תת-סוגים רבים. GCs מסווגים לפי מיקומם בתוך הזקיק; GCs המקיפים את הביצית לעומת אלה הסמוכים לקרום המרתף מוגדרים כ- GCs oophorous ו- mural בהתאמה, ותתי סוגים אלה מציגים חתימות שעתוק ייחודיות. ל-TCs יש תת-סוגים רבים שתפקידם לספק תמיכה סטרואידוגנית, מטבולית ומבנית. תאי אנדותל, כלי דם ומערכת החיסון ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של השחלות. סטרומה השחלתית משמשת לא רק כמצע לצמיחת זקיקים, אלא גם ככל הנראה מספקת מקור לאבות המולידים TC. קומפלקס רב-שכבתי זה של תת-סוגים תאיים בתוך השחלה הוא המאפשר את תפקודה הן כאיבר אנדוקריני והן כאיבר רבייה.
מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי וטיהור של גרנולוסה, תיקה, סטרומה, אנדותל ותאים המטופויטיים מזקיקים אנטראליים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד את תאי השחלות הללו ולנתח אותם באמצעות ריצוף של תא בודד, ולאחר מכן צביעה ספציפית בזקיקים בשלבי התפתחות שונים. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה פשוטה הניתנת לשכפול ותאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה הן של הפיזיולוגיה והן של הפתולוגיה של השחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המערבים עכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית החולים וייל קורנל. כל ניסויי השתלת הקסנו באמצעות רקמת שחלה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. שתי השחלות בודדו מתורם איברים בן 14 שמת מוות מוחי, ללא היסטוריה של רדיו/כימותרפיה וללא היסטוריה מתועדת של בעיות אנדוקריניות או פוריות. ועדת ועדת הביקורת המוסדית (IRB) של Weill Cornell Medicine אישרה את איסוף הרקמות, ואישור ממשפחת תורם האיברים התקבל לאחר הסכמה מדעת לגבי השימוש ברקמות.
1. איסוף רקמות שחלות וטיפול בהן
- לאסוף את כל השחלות ואת הרקמה הקשורה, ולשטוף בתמיסת מלח סטרילית.
- בעזרת פינצטה סטרילית, מניחים את השחלות במיכל סטרילי. יוצקים תמיסה סטרילית, חוצצת וקרה (למשל, מדיום L-15 של לייבוביץ') לתוך המיכל. ודא כי הרקמה מכוסה לחלוטין עם הנוזל.
- סוגרים את המיכל ומכניסים אותו לשקית כפולה באמצעות שקיות ניילון סטריליות. העבירו את המיכל על קרח בתוך קופסה מבודדת (למשל, קלקר). להעביר את הדגימות למעבדה שתעבד את השחלות בהקדם האפשרי, רצוי בזמן שלא יעלה על 5 שעות 3,4.
2. עיבוד רקמת השחלה
הערה: ודא שכל הריאגנטים והכלים מוכנים לפני שהרקמה מגיעה למעבדה כדי להפחית את המרווח האיסכמי ככל האפשר. ניתן להכין את המאגרים עד שבוע לפני ההקפאה ולשמור בקירור עד לשימוש.
- הכנות לעיבוד השחלות והקפאה
- הגדר כלים כירורגיים מעוקרים בארון הבטיחות הביולוגית כהכנה לעיבוד רקמות: אזמל מספר 21; אזמל מספר 11; מספריים מעוקלים עדינים וחדים; מלקחיים ארוכים (~ 150 מ"מ אורך); ושני מלקחיים בינוניים (~ 110 מ"מ אורך).
- הכינו 100 מ"ל של מדיום עיבוד רקמות (ראו טבלת חומרים): מדיום L-15 של לייבוביץ המכיל תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית ומסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. שמור את המדיום מקורר.
- תייגו את ההקפאה, הוסיפו 1.5 מ"ל של תמיסת הקפאה (ראו טבלת חומרים) לכל בקבוקון, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
- יש זמין צלחת 6 בארות בהישג יד לשימוש.
- עם הגעת הרקמה
- רססו את המיכל בתמיסת אתנול 70%, נגבו היטב והכניסו אותו לארון הבטיחות הביולוגית.
- לובשים כפפות סטריליות, פותחים את המיכל. מניחים את השחלה בצלחת פטרי סטרילית, ויוצקים מדיום צונן (משלב 2.1.2) כדי ללחלח את הרקמה. ודא כי השחלה שקועה למחצה בתווך.
- הסר את התפרים או חומר אחר ונתח את שאריות הרקמה שמסביב הרחק מהשחלה.
3. בידוד זקיקים אנטראליים
- זהה זקיקים בודדים לבידוד. בבחירת זקיקים בריאים, אל תכלול זקיקים מלאים בדם, כהים או לא סימטריים, שכן אלה עשויים להיות אטרטיים.
- בודד את הזקיקים האנטראליים שנבחרו מהשחלה כולה באמצעות אזמלים, תוך שמירה על האנטרום שלם על ידי כריתת רקמת קליפת המוח המקיפה את הזקיק.
- מניחים כל זקיק אנטראלי שלם שנכרת בבאר אחת של צלחת 6 הקידוחים. במידת הצורך למטרות תיאוריות, השתמש בסרגל הממוקם מתחת לצלחת כדי לקבוע את קוטר הזקיק.
- באמצעות אזמל, לחתוך את זקיק antral שלם כדי לקבל גישה לחלל antral, ולהוסיף 4 מ"ל של תווך ניתוק תאים אנזימטי. דגרו על הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 5%CO2 ו-37°C למשך 10 דקות.
- חזור על מיצוי זקיקים אנטראליים נוספים לפי הצורך.
4. בידוד תאים שושבי זקיק
- לאחר הדגירה, יש להוסיף 4 מ"ל של תווך זמין המכיל 20% FBS, ולשטוף על ידי פיפטציה חוזרת ונמרצת של התווך מעל הזקיקים המפוצלים עם מיקרופיפטה P1,000.
- אספו את המדיום, והעבירו אותו דרך מסנן של 100 מיקרומטר.
- צנטריפוגה את supernatant מסונן ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנטנט, ושמרו את גלולת התא (מועשרת ב-GCs) על קרח לצורך תיוג ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
- מניחים את הרקמה הנותרת בתערובת של collagenase (100 U / mL) ו dispase (1 U / mL) מדולל בתמיסת מלח מאוזנת (למשל, Hanks), ולדגור במשך 30 דקות ב 5% CO2 ו 37 ° C, משבש מכנית את הרקמה על ידי trituration ו pipetting נמרץ (כלומר, 10-15 עובר דרך קצה הפיפט) פעמיים לאחר 10 דקות ו 20 דקות.
- יש לשחזר מדיה המכילה את הרקמה, לשטוף באמצעות פיפט דרך קצה מיקרופיפטה P1,000, ולסנן דרך מסנן של 100 מיקרומטר.
- צנטריפוגה ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנטנט, והניחו בצד את גלולת התא (המועשרת בתאי TC וסטרומה) על קרח לצורך תיוג ו-FACS.
5. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות
- להשהות מחדש את כדורי התא בתמיסת חסימה (PBS + 0.1% FBS), ולדגור במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- צנטריפוגה ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות, ולשאוף את supernatant.
- השהה מחדש את כדורי התא בתמיסת חסימה המכילה נוגדנים מצומדים ישירות (ראה טבלה 1 עבור שילובי נוגדנים מתאימים לזיהוי GCs ו- TC), ודגור על קרח במשך 10 דקות.
- לשטוף ולצנוח את התאים ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות. השהה מחדש את התאים במאגר FACS המכיל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), והפעל את תרחיף התא באמצעות מכשיר FACS כדי ללכוד אוכלוסייה קטנה של התאים (500-1,000) באמצעות עוצמת הפלואורסצנטיות של נוגדנים מצומדים פלואורופורים לגטינג.
- לזיהוי תת-אוכלוסיות ייחודיות, השתמש באסטרטגיות ה-gating הבאות:
- לטיהור GCs, ציירו שער סביב תאי CD45+ (איור 1B), והוציאו את האוכלוסייה הזו מאוכלוסיית CD99+ (איור 1A ואיור 1C); לאחר מכן, חלקו עוד יותר את החלק הנותר של CD99+ לשברים PVRL+/- (איור 1A ואיור 1C).
- לטיהור TCs וסטרומה, שער את כלל אוכלוסיית ENG+ (איור 1A) או CD55+ (איור 1D) כך שלא תכלול את מקטע האנדותל CD34+ (איור 1E) ותבדיל בין התאים הסטרואידוגניים (ANPEP+) והלא סטרואידוגניים (ANPEP-). היזהר לפצות על דימום בין פלואורופורים קרובים בספקטרום הפליטה.
- כדי לאמת את טוהר מקטע התא המיון, הפעל 5% מהנפח הכולל שנלכד באמצעות מכשיר FACS, וודא שהתאים מאכלסים את השערים הצפויים ונמצאים בטוהר של >95%.
6. עיבוד רקמת קליפת המוח השחלתית
- חותכים את שארית השחלה, ומוציאים את המדולה באמצעות מספריים ואזמלים עדינים מעוקלים, תוך זהירות כדי למנוע נזק לקליפת השחלות.
- המשך עיבוד ודילול קליפת השחלות על ידי גירוד עדין עד שתישאר מדולה מינימלית. הקפד להשתמש בכוח המינימלי הדרוש.
הערה: עובי רקמת קליפת המוח צריך להיות בין 1 מ"מ ל -1.5 מ"מ. - מחלקים את רקמת קליפת המוח לרצועות ברוחב 2-3 מ"מ לאורך השחלה.
7. רקמת השחלות הקפאה איטית
- הכנה להקפאה
- הכניסו רצועה אחת מקליפת המוח לכל בקבוקון קריוגני צונן המכיל תמיסת הקפאה.
- נערו את הבקבוקונים הקריוגניים המכילים את רצועות קליפת המוח על צלחת מסתובבת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C.
- הקפאה איטית של רקמת השחלה5
- הכניסו את הקריביאלים המכילים רקמת שחלה למקפיא הניתן לתכנות כך שיתחיל ב-0 מעלות צלזיוס.
- מצננים בקצב של 2°C/min עד 7°C-.
- שמור על cryovials בטמפרטורה זו במשך 10 דקות.
- היווצרות גבישי קרח גרעיניים על ידי נגיעה בכל קריוביאל עם קצה כותנה שהיה שקוע לזמן קצר בחנקן נוזלי (LN2).
- מצננים בקצב של 0.3°C/min עד שטמפרטורת הדגימה מגיעה ל-40°C.
- הגדל את קצב הקירור ל -10 ° C / min עד שטמפרטורת הדגימה מגיעה ל -140 ° C.
- העבר את cryovials לאחסון LN2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בודדנו זקיקים מפני השטח של השחלה וטיפלנו בהם באופן אנזימטי כדי לבודד את תאי GCs כמו גם תאי תקה וסטרומה המקיפים את החלל האנטרלי. התאים נאספו, ושברי התאים מוינו מהזקיקים האנטראליים (קטרים הנעים בין 0.5 מ"מ ל-4 מ"מ) לפי FACS לטוהר של >95% (איור 1).
כדי לתייג ולטהר שברים תאיים ייחודיים בתוך זקיקי האנטראלים האנושיים, שילבנו עיכול אנזימטי עם מיון ציטומטרי של זרימה. זיהינו בעבר חלבוני פני שטח המסמנים באופן ספציפי שברים שוכני זקיק2. הראינו ש-CD99 (אדום באיור 1A) מסמן באופן ספציפי GCs, ו-PVRL1 (צהוב באיור 1A) הופך יותר ויותר מקומי לתא GC ככל שהזקיקים האנטראליים גדלים בגודל2. הראינו גם שנוגדנים נגד אנדוגלין (ENG, ירוק באיור 1A) או CD55 (איור 1D) תוחמים באופן ספציפי את כל הסטרומה וה-TC, ושאלנין אמינופפטידאז (ANPEP, איור 1E) מבוטא באופן ספציפי על-ידי TCs אנדרוגניים 2,6.
התאים סומנו בנוגדן המכוון נגד CD99 כדי לזהות GCs, ונוגדנים נגד CD45 שימשו כדי להוציא תאים המטופויטיים (איור 1B,C). נוגדנים נגד PVRL1 אפשרו הפרדה של אוכלוסיית ה-GC לתאים אוראליים וציורי קיר (איור 1C). לאחר עיכול אנזימטי עם collagenase/dispase, תכשירי התאים שסומנו עם נוגדנים נגד CD55 (או לחלופין ENG), CD34 ו-ANPEP אפשרו לכידה של כל הסטרומה/TC (CD55+) ו/או TCs אנדרוגניים (ANPEP+), עם הרחקת תאי אנדותל (CD34+) מאוכלוסיות TC (איור 1D,E). באמצעות פאנל זה ופרוטוקול דיסוציאציה אנזימטית הדרגתית, תייגנו וטיהרנו תאים המטופויטיים, אנדותליים, גרנולוזה (oophorous ו-mural) ותקה (סטרומה ואנדרוגניים) מזקיקים אנטראליים של שחלות שזה עתה נכרתו.
איור 1: תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מהזקיקים האנטראליים האנושיים. (A) מיקרוגרף מייצג המציג תאי GC (CD99+ PVRL+/-) ו-TC (ENG+) בתוך זקיקים אנושיים בשלב האנטרלי; תיבות קו לבן מוגדלות ימינה. (ב-ה) חלקות מיון מייצגות המזהות GCs כתאי CD45- CD99+ PVRL1+/- (a ו- b) וכן גנריים (CD34- CD55+) ואנדרוגניים (CD34- CD55+ ANPEP+) TC (C,D). אוכלוסיות מגודרות משותפות בין (B,C) ו-(D,E); פקדים לא מוכתמים מוצגים משמאל ב- (B-E). סרגל קנה מידה = (A) 100 מיקרומטר. קיצורים: GC = תא גרנולוסה; TC = תא theca; PVRL = נטין; ANPEP = אלנין aminopeptidase; Nuc = גרעינים; SSC = פיזור צד; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| סוג תא | נוגדני הכלה | נוגדנים להרחקה |
| תאי גרנולוזה | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| כל תאי Theca | CD55 או ENG | CD34 ו-CD45 |
| תאי תקה סטרואידוגניים | אנפפ | CD34 ו-CD45 |
טבלה 1: רשימת נוגדנים שניתן להשתמש בהם לזיהוי GCs, TC וסטרומה שחלתית. קיצורים: GC = תא גרנולוסה; TC = תא theca.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פתרון טוב יותר של המגוון התאי בתוך זקיקי השחלות חשוב מבחינה קלינית מכמה סיבות. ביישום הפרוטוקול הנ"ל על בידוד תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים השוכנים בתוך זקיקי השלב האנטראלי יש לקחת בחשבון מספר גורמים. ראשית, בריאותה וכדאיותה של רקמת השחלה שממנה נגזר הזקיק האנטרלי היא קריטית לקביעת איכות התאים ולהצלחת היישומים במורד הזרם. זה יכול להיות אופטימלי על ידי מזעור מרווח איסכמי, עבודה מהירה (רצוי בזוגות), והכנת חללי המעבדה שישמשו לעיבוד רקמות FACS. שנית, פרוטוקולים אלה מתאימים היטב לזקיקים בשלב האנטראלי בדיוק משום שניתן לזהות ולשאוב אותם בקלות מהשחלה כדי לגשת ביעילות לחלל האנטרלי; גישה דומה לחקר זקיקים בשלב מוקדם ופרה-אנטראלי תניב אוכלוסיית תאים עם הטרוגניות גדולה בהרבה. לבסוף, מספר ואיכות התאים המתקבלים מהזקיקים ישתנו במידה רבה בהתאם למידת ההתקדמות ההתפתחותית של הזקיק והאם הזקיק נכנס למצב של אטרזיה או לא. בעוד מגבלות אלה הופכות את המחקר של שחזור של folliculogenesis אתגר, בידוד יעיל וחזק של תאים שמקורם זקיק יאפשר חקירה נוספת של המנגנונים העומדים בבסיס הביולוגיה השחלתית האנושית ועקרות.
טיהור GCs מהזקיקים האנטראליים נוצל בעבר על ידי הקבוצה שלנו כדי להדגים את ההשפעה המזיקה של רמות סופר פיזיולוגיות של הורמון אנטי-מולרי (AMH) על התפתחות זקיקים6. במחקר זה, רקמת שחלה שמורה ומופשרת בהקפאה הן ממטופלות לשימור פוריות והן מתורמי איברים הושתלה בעכברים מדוכאי חיסון בזרועות ניסוי שונות: תאי אנדותל המבטאים AMH. חשיפה כרונית ל-AMH גרמה לפנוטיפ של לוטיניזציה מואצת שהתבטאה בגודל זקיק מוגבר, אך הדבר הובהר בבירור רק בחתימה המולקולרית של GCs שוכני זקיקים.
כאשר הביצית יוצאת מתרדמה, GCs רוכשים מורפולוגיה קובואידית7, מתחילים להתרבות, ויחד עם הביצית מפרישים אותות המגייסים את תאי הסטרומה שמסביב ומקדמים את התמוינותם לקראת גורל TC8. למרות שההתמיינות הנכונה של תאי סטרומה לתאי TC מיוחדים ידועה כחיונית לפוריות, המנגנונים המניעים את מפרט TC ושולטים באינטראקציה שלהם עם תאים שושבי זקיקים במהלך הבשלת הביציות אינם מוגדרים היטב. בבני אדם, ההטרוגניות התאית הקיימת ב-TCs הסובבים את הזקיק נותרת חמקמקה במיוחד מכיוון שבניגוד ל-GCs, אשר נגישים בקלות במסגרת הפריה חוץ גופית, הבידוד והתרבית של TCs דורשים ביופסיה ישירה של זקיקים טרום ביוץ. בנוסף, רוב המחקרים הסתמכו על דיסוציאציה מכנית של שכבת התקה מזקיקים אנטראליים מבודדים 9,10, מה שהניב תערובת הטרוגנית של אוכלוסיות סטרומה, טקה, כלי דם ומערכת החיסון.
גישות מולטי-אומיות חד-תאיות חשפו את ההטרוגניות התאית של רקמות רבות ואת סוגי התאים המגוונים המטפחים התפתחות ביציות בתוך השחלה הקיימים בתוך זקיקים במגוון רחב של גדלים ושלבי הבשלה. השיטות המתוארות לעיל משלימות את הפרוטוקולים הקיימים לבידוד והקפאה של רקמת שחלה לצורך שימור פוריות וניתנות ליישום במקביל לרכישת תאים שומרי זקיקים למטרות קליניות או ניסיוניות. היישום של שיטות אלה יהיה חשוב לפענוח המנגנונים המולקולריים השולטים בפוליקולוגנזה האנושית והם תנאי מוקדם קריטי לגישות שמטרתן לטפח התפתחות/הבשלה של ביציות מזקיקים קדמוניים במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים על תמיכתם של Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) ופרס Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M). N.L.G נתמכת על ידי מענק ההשתלמות לפוסט-דוקטורט של NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
