Extractie, etikettering en zuivering van afstammingsspecifieke cellen uit menselijke antrale follikels
Summary
Hier presenteren we protocollen voor de identificatie en zuivering van eierstokcellen uit antrale follikels. We werken uit over methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips, terwijl we ook intacte antrale follikels oogsten die enzymatisch worden behandeld om meerdere follikel-residente celtypen vrij te maken, waaronder granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen.
Abstract
De activering, groei, ontwikkeling en rijping van eicellen is een complex proces dat niet alleen wordt gecoördineerd tussen meerdere celtypen van de eierstok, maar ook over meerdere controlepunten binnen het hypothalamus / hypofyse / ovariumcircuit. Binnen de eierstok groeien meerdere gespecialiseerde celtypen in nauwe associatie met de eicel in de ovariële follikels. De biologie van deze cellen is goed beschreven in de latere stadia, wanneer ze gemakkelijk worden hersteld als bijproducten van geassisteerde reproductieve behandelingen. De diepgaande analyse van kleine antrale follikels die rechtstreeks uit de eierstok zijn geïsoleerd, wordt echter niet vaak uitgevoerd vanwege de schaarste aan menselijk eierstokweefsel en de beperkte toegang tot de eierstok bij patiënten die geassisteerde reproductieve behandelingen ondergaan.
Deze methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips met de gelijktijdige identificatie / isolatie van eierstokcellen maken de analyse met hoge resolutie van de vroege stadia van antrale follikelontwikkeling mogelijk. We demonstreren protocollen voor het isoleren van discrete celtypen door antrale follikels enzymatisch te behandelen en de granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen te scheiden. De isolatie van cellen uit de antrale follikels in verschillende groottes en ontwikkelingsstadia maakt de uitgebreide analyse mogelijk van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de follikelgroei en ovariële fysiologie stimuleren en biedt een bron van levensvatbare cellen die in vitro kunnen worden gekweekt om de follikelmicro-omgeving samen te vatten.
Introduction
De primaire functionele elementen van de menselijke eierstok zijn de follikels, die de groei en ontwikkeling van eicellen regelen. Protocollen voor de isolatie van folliculaire cellen zijn goed vastgesteld in de context van in-vitrofertilisatie , maar deze zijn alleen geschikt voor het verzamelen van cellen uit geluteïniseerde follikels op het punt van het ophalen van eicellen1. We hebben een protocol ontwikkeld dat de isolatie van discrete celpopulaties mogelijk maakt van antrale follikels in verschillende ontwikkelingsstadia die voortkomen uit inheemse eierstokken of xenogetransplanteerd eierstokweefsel2. Hoewel er consensus is dat de bijdragen van follikel-residente cellen aan de teelt van de eicel zeer belangrijk zijn, hebben weinig studies prospectief de unieke fenotypische subtypen geïdentificeerd en geëxtraheerd die aanwezig zijn in de follikels in het antrale stadium. Een dieper begrip van de differentiatiehiërarchie en signaaltransductie tussen gespecialiseerde cellen tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia zou ons begrip van ovariële fysiologie onder homeostatische en pathologische omstandigheden kunnen verbreden. Bovendien kan de discriminatie van discrete cellulaire subtypen en hun moleculaire bijdragen aan follikelgroei / rijping een middel zijn om ex vivo surrogaten te genereren die de ovariële functie reconstrueren om de rijping van eicellen te bevorderen en / of endocriene disfunctie te behandelen.
Elk uniek celtype in de eierstok draagt bij aan de complexe functie van de follikel, die effectief functioneert als een discreet mini-orgaan om de groei en rijping van de eicel die het bevat te bevorderen. De eicel, het middelpunt van de follikel, wordt direct omhuld door een continue laag granulosacellen (GC’s), waarbij de thecacellen (TC’s) een secundaire laag cellen vormen die samen met de eicel en GC’s de folliculaire eenheid vormen. Hoewel ingedeeld in twee groepen, bevatten GC’s en TC’s tal van subtypen. GC’s worden geclassificeerd op basis van hun positie binnen de follikel; GC’s die de eicel omringen versus die welke grenzen aan het keldermembraan worden respectievelijk aangeduid als oophoreuze en muurschildering-GC’s, en deze subtypen vertonen unieke transcriptomische handtekeningen. TC’s hebben tal van subtypen die functioneren om steroïdegene, metabole en structurele ondersteuning te bieden. Endotheel-, perivasculaire en immuuncellen spelen een centrale rol bij het handhaven van een normale ovariële fysiologie. Het ovariële stroma dient niet alleen als een substraat voor follikelgroei, maar biedt waarschijnlijk ook een bron van voorlopers die aanleiding geven tot TC’s. Dit meerlagige complex van cellulaire subtypen in de eierstok is wat zijn functie als zowel een endocriene als een voortplantingsorgaan mogelijk maakt.
Dit artikel presenteert een protocol voor de identificatie en zuivering van granulosa, theca, stromale, endotheel- en hematopoietische cellen uit antrale follikels. We hebben dit protocol gebruikt om deze eierstokcellen te isoleren en te analyseren met behulp van single-cell sequencing, gevolgd door specifieke kleuring in follikels van verschillende ontwikkelingsstadia. Het protocol biedt een eenvoudige methodologie die repliceerbaar is en de analyse met hoge resolutie van zowel de fysiologie als de pathologie van de eierstok mogelijk maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een betere resolutie van de cellulaire diversiteit in de ovariële follikels is om verschillende redenen klinisch belangrijk. Bij het toepassen van het bovenstaande protocol op de isolatie van de unieke fenotypische subtypen die zich in de follikels van het antrale stadium bevinden, moeten verschillende factoren worden overwogen. Ten eerste is de gezondheid en levensvatbaarheid van het eierstokweefsel waaruit de antrale follikel is afgeleid van cruciaal belang bij het bepalen van de kwaliteit van de cellen en het succes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van de Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) en de Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G wordt ondersteund door de NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine postdoctorale opleidingsbeurs.
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
