Summary
Здесь мы представляем протоколы идентификации и очистки клеток яичников от антральных фолликулов. Мы разрабатываем методы обработки целых яичников для криоконсервации кортикальных полосок, а также сбора интактных антральных фолликулов, которые обрабатываются ферментативно для высвобождения нескольких типов резидентных клеток фолликулов, включая гранулезные, тека, эндотелиальные, кроветворные и стромальные клетки.
Abstract
Активация, рост, развитие и созревание ооцитов является сложным процессом, который координируется не только между несколькими типами клеток яичника, но и между несколькими точками контроля в гипоталамо/гипофизе/яичниковой цепи. В яичнике несколько специализированных типов клеток растут в тесной связи с ооцитами в фолликулах яичников. Биология этих клеток была хорошо описана на более поздних стадиях, когда они легко восстанавливаются как побочные продукты вспомогательного репродуктивного лечения. Однако углубленный анализ небольших антральных фолликулов, выделенных непосредственно из яичника, обычно не проводится из-за нехватки ткани яичников человека и ограниченного доступа к яичнику у пациенток, проходящих вспомогательное репродуктивное лечение.
Эти методы обработки целых яичников для криоконсервации кортикальных полосок с одновременной идентификацией/выделением резидентных клеток яичников позволяют проводить анализ ранних стадий развития антрального фолликула с высоким разрешением. Мы демонстрируем протоколы выделения дискретных типов клеток путем ферментативной обработки антральных фолликулов и разделения гранулезных, тека-, эндотелиальных, кроветворных и стромальных клеток. Выделение клеток из антральных фолликулов различных размеров и стадий развития позволяет всесторонне анализировать клеточные и молекулярные механизмы, которые управляют ростом фолликулов и физиологией яичников, и обеспечивает источник жизнеспособных клеток, которые можно культивировать in vitro для повторения микроокружения фолликулов.
Introduction
Основными функциональными элементами яичника человека являются фолликулы, которые регулируют рост и развитие ооцитов. Протоколы выделения фолликулярных клеток хорошо зарекомендовали себя в контексте экстракорпорального оплодотворения, но они подходят только для сбора клеток из лютеинизированных фолликулов в точке извлечения ооцитов1. Мы разработали протокол, который позволяет выделять дискретные клеточные популяции из антральных фолликулов на разных стадиях развития, которые возникают из нативных яичников или ксенотрансплантированной ткани яичника2. Хотя существует консенсус в отношении того, что вклад резидентных клеток фолликулов в культивирование ооцитов очень важен, лишь немногие исследования проспективно идентифицировали и извлекли уникальные фенотипические подтипы, присутствующие в фолликулах антральной стадии. Более глубокое понимание иерархии дифференцировки и передачи сигналов между специализированными клетками на разных стадиях развития может расширить наше понимание физиологии яичников в гомеостатических и патологических условиях. Кроме того, различение дискретных клеточных подтипов и их молекулярного вклада в рост/созревание фолликулов может обеспечить средства создания суррогатов ex vivo , которые реконструируют функцию яичников для стимулирования созревания ооцитов и/или лечения эндокринной дисфункции.
Каждый уникальный тип клеток в яичнике вносит свой вклад в сложную функцию фолликула, который эффективно функционирует как отдельный мини-орган, способствующий росту и созреванию содержащегося в нем ооцита. Ооцит, центральный элемент фолликула, непосредственно окружен непрерывным слоем гранулезных клеток (ГК), при этом тека-клетки (ТК) образуют вторичный слой клеток, которые объединяются с ооцитом и ГК, образуя фолликулярную единицу. Несмотря на то, что ГХ и ТК подразделяются на две группы, они содержат множество подтипов. ГК классифицируются в соответствии с их положением в фолликуле; ГК, которые окружают ооцит, по сравнению с теми, которые примыкают к базальной мембране, обозначаются как оофорные и настенные ГК соответственно, и эти подтипы демонстрируют уникальные транскриптомные сигнатуры. ТК имеют множество подтипов, которые функционируют для обеспечения стероидогенной, метаболической и структурной поддержки. Эндотелиальные, периваскулярные и иммунные клетки играют центральную роль в поддержании нормальной физиологии яичников. Строма яичника служит не только субстратом для роста фолликулов, но и, вероятно, является источником предшественников, которые дают начало ТК. Этот многослойный комплекс клеточных подтипов в яичнике обеспечивает его функцию как эндокринного, так и репродуктивного органа.
В данной работе представлен протокол идентификации и очистки гранулезных, тека-, стромальных, эндотелиальных и кроветворных клеток из антральных фолликулов. Мы использовали этот протокол для выделения этих клеток яичников и их анализа с помощью секвенирования отдельных клеток с последующим специфическим окрашиванием фолликулов на разных стадиях развития. Протокол предоставляет простую методологию, которую можно воспроизвести и которая позволит проводить анализ с высоким разрешением как физиологии, так и патологии яичника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием мышей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Weill Cornell Medicine. Все эксперименты по ксенотрансплантации с использованием ткани яичника проводились в соответствии с соответствующими рекомендациями и правилами. Оба яичника были изолированы от 14-летнего донора органов с мертвым мозгом, у которого в анамнезе не было радио/химиотерапии и не было документально подтвержденных эндокринных или репродуктивных заболеваний. Комитет институционального наблюдательного совета (IRB) Weill Cornell Medicine одобрил сбор ткани, и одобрение семьи донора органов было получено после информированного согласия на использование ткани.
1. Сбор и обработка тканей яичников
- Соберите целые яичники и связанные с ними ткани и промойте в стерильном солевом растворе.
- С помощью стерильного пинцета поместите яичники в стерильный контейнер. Налейте в контейнер стерильный, буферизованный, холодный раствор (например, среду L-15 Лейбовица). Убедитесь, что ткань полностью покрыта жидкостью.
- Закройте контейнер и дважды упакуйте его в стерильные полиэтиленовые пакеты. Перевозите контейнер на льду в изолированной коробке (например, пенополистирол). Передайте образцы в лабораторию, которая обработает яичники, как можно скорее, желательно за время, не превышающее 5 ч 3,4.
2. Обработка ткани яичника
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты и инструменты подготовлены до того, как ткань поступит в лабораторию, чтобы максимально сократить ишемический интервал. Буферы можно приготовить за 1 неделю до замораживания и хранить в холодильнике до использования.
- Препараты для обработки и замораживания яичников
- Набор стерилизованных хирургических инструментов в шкаф биобезопасности при подготовке к тканевой обработке: один скальпель No 21; один скальпель No 11; острые тонкие изогнутые ножницы; один длинный щипец (длина ~150 мм); и два средних щипца (длина ~110 мм).
- Приготовьте 100 мл среды для обработки тканей (см. Таблицу материалов): среду L-15 Лейбовица, содержащую раствор антибиотика и антимикотика и отфильтрованную с помощью фильтра 0,2 мкм. Держите среду охлажденной.
- Маркируйте криовиалы, добавьте 1,5 мл замораживающего раствора (см. Таблицу материалов) в каждый флакон и храните его при температуре 4 ° C.
- Имейте под рукой 6-луночную пластину для использования.
- По прибытии ткани
- Опрыскайте контейнер 70% раствором этанола, тщательно протрите и поместите в шкаф биобезопасности.
- Надев стерильные перчатки, откройте контейнер. Поместите яичник в стерильную чашку Петри и залейте охлажденной средой (с шага 2.1.2) для увлажнения ткани. Следите за тем, чтобы яичник был наполовину погружен в среду.
- Удалите все швы или другой материал и рассеките остаточную окружающую ткань от яичника.
3. Выделение антральных фолликулов
- Определите отдельные фолликулы для выделения. Выбирая здоровые фолликулы, исключите любые заполненные кровью, темные или несимметричные фолликулы, так как они, вероятно, будут атретическими.
- Изолируйте выбранные антральные фолликулы от всего яичника с помощью скальпелей, сохраняя антральный отдел нетронутым, иссекая корковую ткань, охватывающую фолликул.
- Поместите каждый иссеченный интактный антральный фолликул в одну лунку 6-луночной пластины. Если это необходимо для описательных целей, используйте линейку, помещенную под чашку, чтобы определить диаметр фолликула.
- С помощью скальпеля разделите пополам неповрежденный антральный фолликул, чтобы получить доступ к антральной полости, и добавьте 4 мл ферментативной среды для отсоединения клеток. Инкубируйте пластину в увлажненном инкубаторе при 5%CO2 и 37 °C в течение 10 мин.
- При необходимости повторите экстракцию дополнительных антральных фолликулов.
4. Выделение резидентных клеток фолликула
- После инкубации добавляют 4 мл доступной среды, содержащей 20% FBS, и промывают путем повторного энергичного пипетирования среды над разделенными пополам фолликулами микропипеткой P1000.
- Соберите среду и пропустите ее через фильтр 100 мкм.
- Центрифугу фильтруют надосадочную жидкость при 300 × г и 4 °С в течение 3 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и оставьте клеточную гранулу (обогащенную ГХ) на льду для мечения и сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS).
- Поместите оставшуюся ткань в смесь коллагеназы (100 ЕД / мл) и диспазы (1 ЕД / мл), разведенную в сбалансированном физиологическом растворе (например, Хэнкса), и инкубируйте в течение 30 мин при 5% CO2 и 37 ° C, механически разрушая ткань растиранием и энергичным пипетированием (т.е. 10-15 проходов через наконечник пипетки) дважды через 10 мин и 20 мин.
- Восстановите среду, содержащую ткань, промойте с помощью пипетки через наконечник микропипетки P1,000 и процедите через фильтр 100 мкм.
- Центрифуга при 300 × г и 4 °C в течение 3 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и отложите клеточную гранулу (обогащенную TCs и клетками стромы) на лед для маркировки и FACS.
5. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией
- Ресуспендировать гранулы ячейки в блокирующем растворе (PBS + 0,1% FBS) и инкубировать в течение 10 мин при 4 °C.
- Центрифугу при 300 × г и 4 °C в течение 3 мин и аспирировать надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют клеточные гранулы в блокирующем растворе, содержащем непосредственно конъюгированные антитела (см. Таблицу 1 для соответствующих комбинаций антител для идентификации ГХ и ТК), и инкубируют на льду в течение 10 мин.
- Промойте и центрифугируйте клетки при температуре 300 × г и 4 °C в течение 3 мин. Ресуспендируют клетки в буфере FACS, содержащем 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), и пропускают клеточную суспензию через прибор FACS для захвата небольшой популяции клеток (500-1000) с использованием интенсивности флуоресценции флуорофор-конъюгированных антител для стробирования.
- Для идентификации уникальных субпопуляций используйте следующие стратегии стробирования:
- Для очистки ГК нарисуйте ворота вокруг клеток CD45+ (рис. 1B) и исключите эту популяцию из популяции CD99+ (рис. 1A и рис. 1C); затем далее разделите оставшуюся фракцию CD99+ на фракции PVRL+/- (рис. 1A и рис. 1C).
- Для очистки ТК и стромы затворите общую популяцию ENG+ (рис. 1A) или CD55+ (рис. 1D), чтобы исключить эндотелиальную фракцию CD34+ (рис. 1E) и различить стероидогенные (ANPEP+) и нестероидогенные (ANPEP-) клетки. Будьте осторожны, чтобы компенсировать утечку между флуорофорами, которые находятся близко по спектрам излучения.
- Чтобы проверить чистоту фракции отсортированных клеток, пропустите 5% от общего захваченного объема через прибор FACS и убедитесь, что ячейки заполняют ожидаемые вентили и присутствуют с чистотой >95%.
6. Обработка кортикальной ткани яичников
- Разделите оставшуюся часть яичника пополам и иссеките продолговатый мозг с помощью изогнутых тонких ножниц и скальпелей, стараясь избежать повреждения коры яичника.
- Продолжайте обрабатывать и истончать кору яичников путем осторожного соскабливания до тех пор, пока не останется минимальное мозговое вещество. Убедитесь, что вы используете минимально необходимое усилие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина кортикальной ткани должна составлять от 1 мм до 1,5 мм. - Разделите корковую ткань на полоски шириной 2-3 мм по длине яичника.
7. Медленное замораживание ткани яичника
- Подготовка к заморозке
- Поместите одну кортикальную полоску в каждый охлажденный криогенный флакон с замораживающим раствором.
- Встряхните криогенные флаконы, содержащие кортикальные полоски, на вращающейся пластине в течение 20 мин при 4 °C.
- Медленное замораживание ткани яичника5
- Поместите криовиалы, содержащие ткань яичников, в программируемую морозильную камеру, установленную на 0 ° C.
- Охладить со скоростью 2 °C/мин до −7 °C.
- Поддерживайте криовиалы при этой температуре в течение 10 минут.
- Образование кристаллов нуклеата льда путем прикосновения к каждому криовиалу ватным наконечником, который был ненадолго погружен в жидкий азот (LN2).
- Охлаждают со скоростью 0,3 °C/мин до тех пор, пока температура образца не достигнет −40°C.
- Увеличьте скорость охлаждения до 10 °C/мин до тех пор, пока температура образца не достигнет −140 °C.
- Перевести криовиалы на хранение в LN2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы выделили фолликулы с поверхности яичника и ферментативно обработали их, чтобы выделить ГК, а также тека и стромные клетки, окружающие антральную полость. Клетки были собраны, а клеточные фракции были отсортированы из антральных фолликулов (диаметр от 0,5 мм до 4 мм) с помощью FACS до чистоты >95% (рис. 1).
Для маркировки и очистки уникальных клеточных фракций в антральных фолликулах человека мы объединили ферментативное расщепление с проточной цитометрической сортировкой. Ранее мы идентифицировали поверхностные белки, которые специфически маркируют фракции, резидентныефолликулами 2. Мы показали, что CD99 (красный на рисунке 1A) специфически маркирует GCs, а PVRL1 (желтый на рисунке 1A) все больше локализуется в оофорном компартменте GC по мере увеличения антральных фолликулов в размере2. Мы также показали, что антитела против эндоглина (ENG, зеленый на рисунке 1A) или CD55 (рис. 1D) специфически разграничивают все стромы и TCs и что аланинаминопептидаза (ANPEP, рис. 1E) специфически экспрессируется андрогенными TCs 2,6.
Клетки были помечены антителом, направленным против CD99 для идентификации ГК, а антитела против CD45 были использованы для исключения гемопоэтических клеток (рис. 1B, C). Антитела против PVRL1 позволили разделить популяцию GC на оофорные и настенные компартменты (рис. 1C). После ферментативного расщепления коллагеназой/диспазой клеточные препараты, меченные антителами против CD55 (или, альтернативно, ENG), CD34 и ANPEP, позволяли захватывать все стромы/ТК (CD55+) и/или андрогенные ТК (ANPEP+), исключая эндотелиальные клетки (CD34+) из популяций ТС (рис. 1D, E). Используя эту панель и пошаговый протокол ферментативной диссоциации, мы маркировали и очищали гемопоэтические, эндотелиальные, гранулезные (оофорные и настенные) и тека (стромальные и андрогенные) клетки из антральных фолликулов только что резецированных яичников.
Рисунок 1: Маркировка и очистка клеток, специфичных для линии, из антральных фолликулов человека. (A) Репрезентативная микрофотография, показывающая компартменты GC (CD99+ PVRL+/-) и TC (ENG+) в фолликулах человека на антральной стадии; Белые обводки увеличены вправо. (Б-Е) Репрезентативные сортировочные графики, идентифицирующие GC как клетки CD45-CD99+ PVRL1+/- (a и b), а также общие (CD34-CD55+) и андрогенные (CD34-CD55+ ANPEP+) ТК (C,D). Закрытые популяции разделены между (B, C) и (D, E); неокрашенные элементы управления показаны слева в (B-E). Масштабная линейка = (A) 100 мкм. Сокращения: GC = гранулезная клетка; TC = тека-ячейка; ПВРЛ = нектин; ANPEP = аланинаминопептидаза; Nuc = ядра; SSC = боковой разброс; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Тип ячейки | Антитела к включению | Антитела к исключению |
| Гранулезные клетки | CD99 (PVRL+/-) | КД45 |
| Все тека-ячейки | CD55 или ENG | CD34 и CD45 |
| Стероидогенные тека-клетки | АНПЕП | CD34 и CD45 |
Таблица 1: Список антител, которые можно использовать для идентификации ГК, ТК и стромы яичников. Сокращения: GC = гранулезная клетка; TC = тека-ячейка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лучшее разрешение клеточного разнообразия в фолликулах яичников клинически важно по нескольким причинам. При применении приведенного выше протокола к выделению уникальных фенотипических подтипов, которые находятся в фолликулах антральной стадии, следует учитывать несколько факторов. Во-первых, здоровье и жизнеспособность ткани яичника, из которой получен антральный фолликул, имеет решающее значение для определения качества клеток и успеха последующих применений. Это можно оптимизировать, минимизировав ишемический интервал, работая быстро (предпочтительно в парах) и подготавливая лабораторные помещения, которые будут использоваться для обработки тканей и FACS. Во-вторых, эти протоколы хорошо подходят для фолликулов антральной стадии именно потому, что их можно легко идентифицировать и извлечь из яичника для эффективного доступа к антральной полости; Аналогичный подход к изучению ранних стадий и преантральных фолликулов даст клеточную популяцию с гораздо большей гетерогенностью. Наконец, количество и качество клеток, полученных из фолликулов, будет широко варьироваться в зависимости от того, насколько развит фолликул и вошел ли фолликул в состояние атрезии. Хотя эти ограничения затрудняют изучение реконструкции фолликулогенеза, эффективная и надежная изоляция клеток, полученных из фолликулов, позволит продолжить изучение механизмов, лежащих в основе биологии яичников человека и бесплодия.
Очистка ГК из антральных фолликулов ранее использовалась нашей группой, чтобы продемонстрировать пагубное влияние суперфизиологических уровней антимюллерова гормона (АМГ) на развитие фолликулов6. В этом исследовании криоконсервированная и размороженная ткань яичников как от пациентов с сохранением фертильности, так и от доноров органов была пересажена мышам с ослабленным иммунитетом в разных экспериментальных группах: контрольных или АМГ-экспрессирующих эндотелиальных клетках. Хроническое воздействие АМГ вызвало фенотип ускоренной лютеинизации, который отражался в увеличении размера фолликула, но это было четко выяснено только в молекулярной сигнатуре ГК, резидентных фолликула.
Когда ооцит выходит из состояния покоя, ГК приобретают кубовидную морфологию7, начинают размножаться и вместе с ооцитом выделяют сигналы, которые рекрутируют окружающие клетки стромы и способствуют их дифференцировке к судьбеTC 8. Хотя известно, что правильная дифференцировка клеток стромы в специализированные ТК имеет важное значение для фертильности, механизмы, которые управляют спецификацией ТС и управляют их взаимодействием с клетками-резидентами фолликулов во время созревания ооцитов, четко не определены. У людей клеточная гетерогенность, существующая в ТК, окружающих фолликул, остается особенно неуловимой, поскольку, в отличие от ГК, которые легко доступны в условиях ЭКО, выделение и культивирование ТК требуют прямой биопсии преовуляторных фолликулов. Кроме того, большинство исследований опирались на механическую диссоциацию тека-слоя из изолированных антральных фолликулов 9,10, в результате чего получалась гетерогенная смесь стромальной, тека-, сосудистой и иммунной популяций.
Одноклеточные мультиомические подходы выявили клеточную гетерогенность многочисленных тканей, а различные типы клеток, которые способствуют развитию ооцитов в яичнике, существуют в фолликулах в широком диапазоне размеров и стадий созревания. Описанные выше методы дополняют существующие протоколы выделения и замораживания ткани яичника с целью сохранения фертильности и могут быть реализованы параллельно для получения клеток-резидентов фолликулов в клинических или экспериментальных целях. Применение этих методов будет иметь важное значение для расшифровки молекулярных механизмов, которые управляют фолликулогенезом человека, и являются важной предпосылкой для подходов, направленных на стимулирование развития/созревания ооцитов из примордиальных фолликулов in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность за поддержку со стороны Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) и Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G поддерживается грантом NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine для постдокторантуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
