Summary
Her præsenterer vi protokoller til identifikation og oprensning af ovarieceller fra antrale follikler. Vi uddyber metoder til behandling af hele æggestokke til kryopræservering af kortikale strimler, samtidig med at vi høster intakte antrale follikler, der behandles enzymatisk for at frigøre flere follikelresidente celletyper, herunder granulosa, theca, endotel-, hæmatopoietiske og stromale celler.
Abstract
Aktivering, vækst, udvikling og modning af oocytter er en kompleks proces, der koordineres ikke kun mellem flere celletyper i æggestokken, men også på tværs af flere kontrolpunkter inden for hypothalamus/hypofyse/ovariekredsløbet. Inden for æggestokken vokser flere specialiserede celletyper i tæt forbindelse med oocytten i æggestokkene. Disse cellers biologi er blevet godt beskrevet i de senere stadier, når de let genvindes som biprodukter af assisteret reproduktionsbehandling. Imidlertid udføres den dybdegående analyse af små antrale follikler, der er isoleret direkte fra æggestokken, ikke almindeligt på grund af manglen på humant ovarievæv og den begrænsede adgang til æggestokken hos patienter, der gennemgår assisteret reproduktionsbehandling.
Disse metoder til behandling af hele æggestokke til kryopræservering af kortikale strimler med samtidig identifikation/isolering af ovarieresidente celler muliggør højopløsningsanalyse af de tidlige stadier af antral follikeludvikling. Vi demonstrerer protokoller til isolering af diskrete celletyper ved enzymatisk behandling af antrale follikler og adskillelse af granulosa-, theca-, endotel-, hæmatopoietiske og stromale celler. Isolering af celler fra de antrale follikler i forskellige størrelser og udviklingsstadier muliggør omfattende analyse af de cellulære og molekylære mekanismer, der driver follikelvækst og ovariefysiologi og giver en kilde til levedygtige celler, der kan dyrkes in vitro for at rekapitulere follikelmikromiljøet.
Introduction
De primære funktionelle elementer i den menneskelige æggestok er folliklerne, som styrer væksten og udviklingen af oocytter. Protokoller til isolering af follikulære celler er veletablerede i forbindelse med in vitro-befrugtning , men disse er kun egnede til indsamling af celler fra luteiniserede follikler ved tidspunktet for oocytudtagning1. Vi har udviklet en protokol, der muliggør isolering af diskrete cellepopulationer fra antrale follikler på forskellige udviklingsstadier, der opstår fra indfødte æggestokke eller xenotransplanteret ovarievæv2. Selv om der er enighed om, at follikelresidente cellers bidrag til dyrkning af oocyten er meget vigtige, har få undersøgelser prospektivt identificeret og ekstraheret de unikke fænotypiske undertyper, der findes i antralstadiet follikler. En dybere forståelse af differentieringshierarkiet og signaltransduktion mellem specialiserede celler i de forskellige udviklingsstadier kunne udvide vores forståelse af ovariefysiologi under homeostatiske og patologiske tilstande. Desuden kan diskrimination af diskrete cellulære undertyper og deres molekylære bidrag til follikelvækst/modning være et middel til at generere ex vivo-surrogater, der rekonstruerer ovariefunktionen for at fremme oocytmodning og/eller behandle endokrin dysfunktion.
Hver unik celletype i æggestokken bidrager til follikelens komplekse funktion, som effektivt fungerer som et diskret miniorgan for at fremme væksten og modningen af den oocyt, den indeholder. Oocytten, follikelens midtpunkt, er direkte omsluttet af et kontinuerligt lag af granulosaceller (GC'er), hvor thecacellerne (TC'er) danner et sekundært lag af celler, der kombineres med oocyten og GC'erne for at komponere follikelenheden. Selvom GC'er og TC'er er klassificeret i to grupper, indeholder GC'er og TC'er adskillige undertyper. GC'er klassificeres efter deres position inden for folliklen; GC'er, der omgiver oocytten versus dem, der støder op til kældermembranen, betegnes som henholdsvis oophorous og vægmaleri GC'er, og disse undertyper viser unikke transkriptomiske signaturer. TC'er har adskillige undertyper, der fungerer til at tilvejebringe steroidogen, metabolisk og strukturel støtte. Endotel-, perivaskulære og immunceller spiller en central rolle i opretholdelsen af normal ovariefysiologi. Ovariestroma tjener ikke kun som et substrat for follikelvækst, men giver sandsynligvis også en kilde til forfædre, der giver anledning til TC'er. Dette flerlagede kompleks af cellulære undertyper i æggestokken er det, der muliggør dets funktion som både et endokrin og et reproduktivt organ.
Dette papir præsenterer en protokol til identifikation og oprensning af granulosa, theca, stromale, endotel- og hæmatopoietiske celler fra antrale follikler. Vi har brugt denne protokol til at isolere disse ovarieceller og analysere dem ved hjælp af enkeltcellesekventering efterfulgt af specifik farvning i follikler i forskellige udviklingsstadier. Protokollen giver en ligetil metode, der kan replikeres og muliggør analyse i høj opløsning af både æggestokkens fysiologi og patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverede mus, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hos Weill Cornell Medicine. Alle xenotransplantationsforsøg med ovarievæv blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler. Begge æggestokke blev isoleret fra en 14-årig hjernedød organdonor uden tidligere radio/kemoterapi og uden dokumenteret historie med endokrine eller reproduktive tilstande. Weill Cornell Medicine's institutional review board (IRB) Committee godkendte indsamling af væv, og godkendelse fra organdonorens familie blev opnået efter informeret samtykke vedrørende brugen af væv.
1. Opsamling og håndtering af ovarievæv
- Saml hele æggestokke og det tilhørende væv, og skyl i steril saltopløsning.
- Brug sterile pincet til at placere æggestokkene i en steril beholder. Hæld steril, bufret, kold opløsning (f.eks. Leibovitzs L-15-medium) i beholderen. Sørg for, at vævet er helt dækket af væsken.
- Luk beholderen og dobbeltpose den ved hjælp af sterile plastposer. Transporter beholderen på is i en isoleret kasse (f.eks. Styrofoam). Overfør prøverne til laboratoriet, der behandler æggestokkene så hurtigt som muligt, helst inden for en tid på højst 5 timer 3,4.
2. Behandling af æggestokkene
BEMÆRK: Sørg for, at alle reagenser og værktøjer er forberedt, før vævet ankommer til laboratoriet for at reducere det iskæmiske interval så meget som muligt. Bufferne kan fremstilles op til 1 uge før frysning og nedkøles indtil brug.
- Forberedelser til ovariebehandling og frysning
- Indstil steriliserede kirurgiske værktøjer i biosikkerhedsskabet som forberedelse til vævsbehandling: et nummer 21 skalpel; et nummer 11 skalpel; skarp fin buet saks; en lang tang (~ 150 mm længde); og to mellemstore tang (~ 110 mm længde).
- Forbered 100 ml vævsbehandlingsmedium (se materialetabellen): Leibovitzs L-15-medium indeholdende antibiotika-antimykotisk opløsning og filtreret ved hjælp af et 0,2 μm filter. Hold mediet kølet.
- Mærk kryoialerne, tilsæt 1,5 ml fryseopløsning (se materialetabellen) til hvert hætteglas, og opbevar det ved 4 °C.
- Hav en 6-brønds plade ved hånden til brug.
- Ved ankomsten af vævet
- Sprøjt beholderen med 70% ethanolopløsning, tør grundigt af, og læg den i biosikkerhedsskabet.
- Brug sterile handsker, åbn beholderen. Æggestokken anbringes i en steril petriskål, og afkøles (fra trin 2.1.2) for at hydrere vævet. Sørg for, at æggestokken er halvt nedsænket i mediet.
- Fjern eventuelle suturer eller andet materiale og dissekere det resterende omgivende væv væk fra æggestokken.
3. Isolering af antrale follikler
- Identificer individuelle follikler til isolering. Når du vælger sunde follikler, skal du udelukke blodfyldte, mørke eller ikke-symmetriske follikler, da de sandsynligvis vil være atretiske.
- Isoler de valgte antrale follikler fra hele æggestokken ved hjælp af skalpeller, og hold antrummet intakt ved at udskære det kortikale væv, der omfatter folliklen.
- Anbring hver udskåret intakt antral follikel i en brønd på 6-brøndpladen. Hvis det er nødvendigt til beskrivende formål, skal du bruge en lineal placeret under skålen til at bestemme follikeldiameteren.
- Brug en skalpel til at skære den intakte antrale follikel for at få adgang til antralhulen, og tilsæt 4 ml enzymatisk celleløsrivelsesmedium. Pladen inkuberes i en befugtet inkubator ved 5% CO2 og 37 °C i 10 minutter.
- Gentag ekstraktionen af yderligere antrale follikler efter behov.
4. Isolering af follikelresidente celler
- Efter inkubation tilsættes 4 ml tilgængeligt substrat indeholdende 20 % FBS, og der skylles ved gentagen, kraftig pipettering af substratet over de afskårne follikler med en P1.000 mikropipette.
- Opsaml mediet, og før det gennem et 100 μm filter.
- Den filtrerede supernatant centrifugeres ved 300 × g og 4 °C i 3 min. Opsug supernatanten, og reserver cellepelleten (beriget med GC'er) på is til mærkning og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
- Det resterende væv anbringes i en blanding af kollagenase (100 E/ml) og dispase (1 E/ml) fortyndet i en afbalanceret saltopløsning (f.eks. Hanks), og der inkuberes i 30 minutter ved 5 % CO2 og 37 °C, hvorved vævet forstyrres mekanisk ved trituration og kraftig pipettering (dvs. 10-15 passerer gennem pipetspidsen) to gange efter 10 minutter og 20 minutter.
- Genvind medier, der indeholder vævet, skyl via pipettering gennem en P1.000 mikropipettespids, og sil gennem et 100 μm filter.
- Der centrifugeres ved 300 × g og 4 °C i 3 min. Opsug supernatanten, og læg cellepillen (beriget med TC'er og stromaceller) til side på is til mærkning og FACS.
5. Fluorescensaktiveret cellesortering
- Cellepillerne resuspenderes i blokerende opløsning (PBS + 0,1% FBS), og inkuberes i 10 minutter ved 4 °C.
- Der centrifugeres ved 300 × g og 4 °C i 3 minutter, og supernatanten suges op.
- Resuspender cellepillerne i blokerende opløsning indeholdende direkte konjugerede antistoffer (se tabel 1 for passende antistofkombinationer til identifikation af GC'er og TC'er), og inkuber på is i 10 minutter.
- Cellerne vaskes og centrifugeres ved 300 × g og 4 °C i 3 minutter. Resuspender cellerne i FACS-buffer indeholdende 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og kør cellesuspensionen gennem et FACS-instrument for at fange en lille population af cellerne (500-1,000) ved hjælp af fluorescensintensiteten af fluoroforkonjugerede antistoffer til gating.
- Til identifikation af unikke subpopulationer skal du bruge følgende gating-strategier:
- Til rensning af GC'er skal du tegne en port omkring CD45+-cellerne (figur 1B) og udelukke denne population fra CD99+-populationen (figur 1A og figur 1C); derefter opdeles den resterende CD99+ fraktion yderligere i PVRL+/- fraktioner (figur 1A og figur 1C).
- Til oprensning af TC'er og stroma, gate den samlede ENG+ (figur 1A) eller CD55+ (figur 1D) population for at udelukke CD34+ endotelfraktionen (figur 1E) og skelne mellem de steroidogene (ANPEP+) og ikke-steroidogene (ANPEP-) celler. Vær omhyggelig med at kompensere for gennemblødning mellem fluoroforer, der er tæt på emissionsspektrene.
- For at validere renheden af den sorterede cellefraktion skal du køre 5% af det samlede optagne volumen gennem FACS-instrumentet og sikre, at celler udfylder de forventede porte og er til stede med >95% renhed.
6. Behandling af æggestokkens kortikale væv
- Skær resten af æggestokken, og punktafgifter medulla ved hjælp af buet fin saks og skalpeller, idet du er omhyggelig med at undgå skade på æggestokkens cortex.
- Fortsæt behandlingen og udtynding af æggestokkens cortex ved forsigtig skrabning, indtil minimal medulla forbliver. Sørg for at bruge den nødvendige minimumskraft.
BEMÆRK: Den kortikale vævstykkelse skal være mellem 1 mm og 1,5 mm. - Opdel det kortikale væv i 2-3 mm brede strimler langs æggestokkens længde.
7. Langsom frysning af ovarievæv
- Forberedelse til frysning
- Anbring en kortikal strimmel i hvert afkølet kryogent hætteglas, der indeholder fryseopløsning.
- De kryogene hætteglas med kortikale strimler rystes på en roterende plade i 20 minutter ved 4 °C.
- Langsom frysning af æggestokkene5
- Kryoialerne indeholdende ovarievæv anbringes i en programmerbar fryser, der er indstillet til at starte ved 0 °C.
- Afkøles med en hastighed på 2 °C/min indtil -7 °C.
- Oprethold kryoialerne ved denne temperatur i 10 minutter.
- Nukleat iskrystaldannelse ved at berøre hver kryovial med en bomuldsspids, der kortvarigt er nedsænket i flydende nitrogen (LN2).
- Afkøles med en hastighed på 0,3 °C/min, indtil prøvetemperaturen når -40 °C.
- Forøg afkølingshastigheden til 10 °C/min, indtil prøvetemperaturen når -140 °C.
- Kryoialerne overføres til opbevaring i LN2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi isolerede follikler fra overfladen af æggestokken og behandlede dem enzymatisk for at isolere GC'erne samt theca- og stromacellerne, der omgiver antralhulen. Cellerne blev indsamlet, og cellefraktionerne blev sorteret fra de antrale follikler (diametre mellem 0,5 mm og 4 mm) af FACS til >95% renhed (figur 1).
For at mærke og rense unikke cellulære fraktioner i de humane antrale follikler kombinerede vi enzymatisk fordøjelse med flowcytometrisk sortering. Vi har tidligere identificeret overfladeproteiner, der specifikt markerer follikelresidente fraktioner2. Vi har vist, at CD99 (rød i figur 1A) specifikt mærker GC'er, og PVRL1 (gul i figur 1A) er i stigende grad lokaliseret til det oophorøse GC-rum, efterhånden som de antrale follikler stiger i størrelse2. Vi har også vist, at antistoffer mod endoglin (ENG, grøn i figur 1A) eller CD55 (figur 1D) specifikt afgrænser alle stroma og TC'er, og at alaninaminopeptidase (ANPEP, figur 1E) specifikt udtrykkes af androgene TC'er 2,6.
Cellerne blev mærket med et antistof rettet mod CD99 for at identificere GC'er, og antistoffer mod CD45 blev brugt til at udelukke hæmatopoietiske celler (figur 1B, C). Antistoffer mod PVRL1 muliggjorde adskillelse af GC-populationen i oophorous og vægmaleri rum (figur 1C). Efter enzymatisk fordøjelse med collagenase/dispase muliggjorde cellepræparaterne mærket med antistoffer mod CD55 (eller alternativt ENG), CD34 og ANPEP indfangning af alle stroma/TC'er (CD55+) og/eller androgene TC'er (ANPEP+) med udelukkelse af endotelceller (CD34+) fra TC-populationerne (figur 1D,E). Ved hjælp af dette panel og en trinvis enzymatisk dissociationsprotokol mærkede og rensede vi hæmatopoietiske celler, endotelceller, granulosa (ooforous og vægmaleri) og theca (stromale og androgene) celler fra de antrale follikler af friskresekterede æggestokke.
Figur 1: Mærkning og oprensning af afstamningsspecifikke celler fra humane antrale follikler. (A) Repræsentativ mikrografi, der viser GC (CD99+ PVRL+/-) og TC (ENG+) rum i humane follikler på antralstadiet; Hvide stregfelter forstørres til højre. (B-E) Repræsentative sorteringsplot, der identificerer GC'er som CD45-, CD99+, PVRL1+/- celler (a og b) samt generiske (CD34-, CD55+) og androgene (CD34-, CD55+, ANPEP+) TC'er (C, D). Gated populationer deles mellem (B, C) og (D, E); ubejdsede betjeningselementer vises til venstre i (B-E). Skalabjælke = (A) 100 μm. Forkortelser: GC = granulosa celle; TC = theca celle; PVRL = nektin; ANPEP = alaninaminopeptidase; Nuc = kerner; SSC = sidespredning; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Celle Type | Inklusion Antistoffer | Udelukkelse Antistoffer |
| Granulosa celler | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| Alle Theca-celler | CD55 eller ENG | CD34 & CD45 |
| Steroidogene Theca-celler | ANPEP | CD34 & CD45 |
Tabel 1: Liste over antistoffer, der kan bruges til at identificere GC'er, TC'er og ovariestroma. Forkortelser: GC = granulosa celle; TC = theca celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedre opløsning af den cellulære mangfoldighed i æggestokkene er klinisk vigtigt af flere grunde. Ved anvendelse af ovennævnte protokol til isolering af de unikke fænotypiske undertyper, der befinder sig inden for antralstadiet follikler, bør flere faktorer overvejes. For det første er sundheden og levedygtigheden af ovarievævet, hvorfra den antrale follikel er afledt, afgørende for at bestemme cellernes kvalitet og succesen med downstream-applikationer. Dette kan optimeres ved at minimere det iskæmiske interval, arbejde hurtigt (helst parvis) og forberede de laboratorierum, der skal bruges til vævsbehandling og FACS. For det andet er disse protokoller velegnede til follikler i antralstadiet, netop fordi de let kan identificeres og ekstraheres fra æggestokken for effektivt at få adgang til antralhulen; En lignende tilgang til undersøgelse af tidlige stadier og præantrale follikler ville give en cellepopulation med meget større heterogenitet. Endelig vil antallet og kvaliteten af celler opnået fra folliklerne variere meget afhængigt af, hvor udviklingsmæssigt avanceret en follikel er, og om folliklen er kommet ind i en tilstand af atresi eller ej. Mens disse begrænsninger gør undersøgelsen af rekonstruktionen af follikulogenese til en udfordring, vil effektiv og robust isolering af follikelafledte celler muliggøre yderligere undersøgelse af mekanismerne bag human ovariebiologi og infertilitet.
Oprensningen af GC'er fra de antrale follikler er tidligere blevet brugt af vores gruppe til at demonstrere den skadelige indflydelse af superfysiologiske niveauer af anti-Mullerian hormon (AMH) på follikeludvikling6. I denne undersøgelse blev kryopræserveret og optøet ovarievæv fra både fertilitetsbevarende patienter og organdonorer transplanteret til immunkompromitterede mus i forskellige eksperimentelle arme: kontrol- eller AMH-ekspressive endotelceller. Kronisk eksponering for AMH udløste en fænotype af accelereret luteinisering, der blev afspejlet i øget follikelstørrelse, men dette blev kun tydeligt belyst i den molekylære signatur af follikelresidente GC'er.
Når oocytten forlader dvale, erhverver GC'er en kuboid morfologi7, begynder at sprede sig og udskiller sammen med oocytten signaler, der rekrutterer de omgivende stromaceller og fremmer deres differentiering mod en TC-skæbne8. Selvom den korrekte differentiering af stromaceller i specialiserede TC'er vides at være afgørende for fertiliteten, er de mekanismer, der driver TC-specifikation og styrer deres interaktion med follikelresidente celler under oocytmodning, ikke veldefinerede. Hos mennesker forbliver den cellulære heterogenitet, der findes i TC'erne omkring folliklen, særligt undvigende, fordi isolering og kultur af TC'er i modsætning til GC'er, som er let tilgængelige i en IVF-indstilling, kræver en direkte biopsi af præovulatoriske follikler. Derudover har de fleste undersøgelser været afhængige af mekanisk dissociation af theca-laget fra isolerede antrale follikler 9,10, hvilket giver en heterogen blanding af stromale, theca, vaskulære og immunpopulationer.
Enkeltcelle multi-omics tilgange har afsløret den cellulære heterogenitet af talrige væv, og de forskellige celletyper, der fremmer oocytudvikling i æggestokken, findes inden for follikler på tværs af en lang række størrelser og modningsstadier. De ovenfor beskrevne metoder supplerer eksisterende protokoller til isolering og frysning af ovarievæv med henblik på fertilitetsbevarelse og kan implementeres parallelt til udtagning af follikelresidente celler til kliniske eller eksperimentelle formål. Anvendelsen af disse metoder vil være vigtig for at dechifrere de molekylære mekanismer, der styrer human follikulogenese, og er en kritisk forudsætning for tilgange, der sigter mod at fremme oocytudvikling/modning fra primordiale follikler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtte fra Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) og Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G støttes af NYSTEM Stem Stem Cell and Regenerative Medicine postdoc training grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
