Summary
Aqui, apresentamos protocolos para a identificação e purificação de células ovarianas de folículos antrais. Elaboramos métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais e também colhemos de folículos antrais intactos que são tratados enzimaticamente para liberar vários tipos de células residentes de folículos, incluindo células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoiéticas e estromais.
Abstract
A ativação, crescimento, desenvolvimento e maturação dos ovócitos é um processo complexo que é coordenado não apenas entre vários tipos celulares do ovário, mas também através de múltiplos pontos de controle dentro do circuito hipotálamo/hipófise/ovariano. Dentro do ovário, vários tipos de células especializadas crescem em estreita associação com o ovócito dentro dos folículos ovarianos. A biologia dessas células tem sido bem descrita nos estágios mais avançados, quando são facilmente recuperadas como subprodutos de tratamentos de reprodução assistida. No entanto, a análise aprofundada de pequenos folículos antrais isolados diretamente do ovário não é comumente realizada devido à escassez de tecido ovariano humano e ao acesso limitado ao ovário em pacientes submetidas a tratamentos de reprodução assistida.
Estes métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais com a identificação/isolamento concomitante de células residentes nos ovários permitem a análise de alta resolução dos estágios iniciais do desenvolvimento dos folículos antrais. Demonstramos protocolos para isolar tipos celulares discretos através do tratamento enzimaticamente dos folículos antrais e separação das células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoéticas e estromais. O isolamento de células dos folículos antrais em vários tamanhos e estágios de desenvolvimento permite a análise abrangente dos mecanismos celulares e moleculares que conduzem o crescimento dos folículos e a fisiologia ovariana e fornece uma fonte de células viáveis que podem ser cultivadas in vitro para recapitular o microambiente folicular.
Introduction
Os principais elementos funcionais do ovário humano são os folículos, que governam o crescimento e desenvolvimento dos ovócitos. Protocolos para o isolamento de células foliculares estão bem estabelecidos no contexto da fertilização in vitro , mas são apropriados apenas para a coleta de células de folículos luteinizados no ponto de recuperação oocitária1. Desenvolvemos um protocolo que permite o isolamento de populações celulares discretas de folículos antrais em diferentes estágios de desenvolvimento que surgem de ovários nativos ou tecido ovariano xenotransplantado2. Embora haja consenso de que as contribuições das células residentes nos folículos para o cultivo do ovócito são de grande importância, poucos estudos identificaram e extraíram prospectivamente os subtipos fenotípicos únicos presentes nos folículos em estágio antral. Uma compreensão mais profunda da hierarquia de diferenciação e transdução de sinal entre células especializadas durante os diferentes estágios de desenvolvimento poderia ampliar nossa compreensão da fisiologia ovariana sob condições homeostáticas e patológicas. Além disso, a discriminação de subtipos celulares discretos e suas contribuições moleculares para o crescimento/maturação dos folículos podem fornecer um meio de gerar substitutos ex vivo que reconstroem a função ovariana para promover a maturação oocitária e/ou tratar a disfunção endócrina.
Cada tipo de célula única dentro do ovário contribui para a função complexa do folículo, que funciona efetivamente como um mini-órgão discreto para promover o crescimento e a maturação do ovócito que contém. O ovócito, peça central do folículo, é diretamente envolvido por uma camada contínua de células da granulosa (GCs), com as células da teca (CTs) formando uma camada secundária de células que se combinam com o ovócito e os GCs para compor a unidade folicular. Embora classificados em dois grupos, os GCs e CTs contêm vários subtipos. Os GCs são classificados de acordo com sua posição dentro do folículo; Os GCs que circundam o ovócito versus aqueles adjacentes à membrana basal são designados como GCs oóforos e murais, respectivamente, e esses subtipos exibem assinaturas transcriptômicas únicas. Os CTs têm vários subtipos que funcionam para fornecer suporte esteroidogênico, metabólico e estrutural. Células endoteliais, perivasculares e imunes desempenham um papel central na manutenção da fisiologia ovariana normal. O estroma ovariano serve não apenas como substrato para o crescimento dos folículos, mas também provavelmente fornece uma fonte de progenitores que dão origem aos CTs. Este complexo multicamadas de subtipos celulares dentro do ovário é o que permite sua função como um órgão endócrino e reprodutivo.
Este trabalho apresenta um protocolo para identificação e purificação de células granulosas, tecais, estromais, endoteliais e hematopoéticas de folículos antrais. Utilizamos este protocolo para isolar essas células ovarianas e analisá-las usando sequenciamento unicelular, seguido de coloração específica em folículos de diferentes estágios de desenvolvimento. O protocolo fornece uma metodologia simples que é replicável e permitirá a análise de alta resolução da fisiologia e patologia do ovário.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Weill Cornell Medicine. Todos os experimentos de xenotransplante utilizando tecido ovariano foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Ambos os ovários foram isolados de um doador de órgãos com morte encefálica de 14 anos, sem história de radio/quimioterapia e sem história documentada de condições endócrinas ou reprodutivas. O Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Weill Cornell Medicine aprovou a coleta de tecidos, e a aprovação da família do doador de órgãos foi obtida após consentimento informado quanto ao uso de tecidos.
1. Coleta e manuseio do tecido ovariano
- Coletar ovários inteiros e o tecido associado e enxaguar em solução salina estéril.
- Usando pinças estéreis, coloque os ovários em um recipiente estéril. Deite solução estéril, tamponada e fria (por exemplo, meio L-15 de Leibovitz) no recipiente. Certifique-se de que o tecido está completamente coberto com o líquido.
- Feche o recipiente e faça o saco duplo usando sacos plásticos estéreis. Transporte o recipiente no gelo dentro de uma caixa isolada (por exemplo, isopor). Transfira os espécimes para o laboratório que processará os ovários o mais rápido possível, de preferência em um tempo não superior a 5 h 3,4.
2. Processamento do tecido ovariano
NOTA: Certifique-se de que todos os reagentes e ferramentas estejam preparados antes que o tecido chegue ao laboratório para reduzir ao máximo o intervalo isquêmico. Os tampões podem ser preparados até 1 semana antes do congelamento e refrigerados até o uso.
- Preparações para o processamento e congelamento ovariano
- Colocar ferramentas cirúrgicas esterilizadas no gabinete de biossegurança em preparação para o processamento de tecidos: um bisturi número 21; um bisturi número 11; tesoura curva fina afiada; uma pinça longa (~150 mm de comprimento); e duas pinças médias (~110 mm de comprimento).
- Preparar 100 mL de meio de processamento de tecido (ver Tabela de Materiais): meio L-15 de Leibovitz contendo solução antibiótico-antimicótica e filtrado usando um filtro de 0,2 μm. Mantenha o meio refrigerado.
- Rotular os frascos para injetáveis, adicionar 1,5 ml de solução de congelação (ver Tabela de Materiais) a cada frasco para injetáveis e armazená-lo a 4 °C.
- Tenha disponível uma placa de 6 poços à mão para uso.
- Na chegada do tecido
- Borrife o recipiente com solução de etanol a 70%, limpe bem e coloque-o dentro do armário de biossegurança.
- Usando luvas estéreis, abra o recipiente. Colocar o ovário numa placa de Petri estéril e deitar meio refrigerado (do passo 2.1.2) para hidratar o tecido. Certifique-se de que o ovário está semi-submerso no meio.
- Remova quaisquer suturas ou outro material e disseque o tecido residual circundante longe do ovário.
3. Isolamento dos folículos antrais
- Identificar folículos individuais para isolamento. Ao escolher folículos saudáveis, exclua quaisquer folículos cheios de sangue, escuros ou não simétricos, pois eles provavelmente são atréticos.
- Isolar os folículos antrais escolhidos de todo o ovário com bisturis, mantendo o antro intacto através da excisão do tecido cortical que engloba o folículo.
- Coloque cada folículo antral intacto excisado em um poço da placa de 6 poços. Se necessário para fins descritivos, use uma régua colocada abaixo da placa para determinar o diâmetro do folículo.
- Com bisturi, bissetriz o folículo antral intacto para obter acesso à cavidade antral e adicionar 4 mL de meio de descolamento enzimático de células. Incubar a placa em estufa umidificada a 5% CO2 e 37 °C por 10 min.
- Repita a extração de folículos antrais adicionais conforme necessário.
4. Isolamento de células residentes no folículo
- Após a incubação, adicionar 4 mL de meio disponível contendo 20% de SFB e lavar por pipetagem vigorosa e repetida do meio sobre os folículos bissectados com uma micropipeta P1.000.
- Recolha o meio e passe-o através de um filtro de 100 μm.
- Centrifugar o sobrenadante filtrado a 300 × g e 4 °C durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e reservar o pellet de células (enriquecido com GCs) no gelo para marcação e classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
- Coloque o tecido restante em uma mistura de colagenase (100 U/mL) e dispase (1 U/mL) diluída em uma solução salina balanceada (por exemplo, Hanks) e incube por 30 min a 5% de CO2 e 37 °C, interrompendo mecanicamente o tecido por trituração e pipetagem vigorosa (ou seja, 10-15 passagens através da ponta da pipeta) duas vezes após 10 min e 20 min.
- Recupere o meio contendo o tecido, lave por pipetagem através de uma ponta de micropipeta P1.000 e coe através de um filtro de 100 μm.
- Centrifugar a 300 × g e 4 °C durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e colocar de lado o pellet celular (enriquecido com TCs e células do estroma) no gelo para marcação e FACS.
5. Classificação de células ativadas por fluorescência
- Ressuspender os pellets de células em solução de bloqueio (PBS + FBS a 0,1%) e incubar por 10 min a 4 °C.
- Centrifugar a 300 × g e 4 °C durante 3 min e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender os pellets celulares em solução de bloqueio contendo anticorpos diretamente conjugados (ver Tabela 1 para combinações apropriadas de anticorpos para identificar GCs e TCs) e incubar no gelo por 10 min.
- Lavar e centrifugar as células a 300 × g e 4 °C durante 3 min. Ressuspender as células em tampão FACS contendo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e executar a suspensão celular através de um instrumento FACS para capturar uma pequena população de células (500-1.000) usando a intensidade de fluorescência de anticorpos conjugados a fluoróforos para gating.
- Para a identificação de subpopulações únicas, utilize as seguintes estratégias de limitação:
- Para a purificação dos GCs, desenhar uma porta ao redor das células CD45+ (Figura 1B) e excluir essa população da população CD99+ (Figura 1A e Figura 1C); em seguida, subdivida a fração CD99+ restante em frações PVRL+/- (Figura 1A e Figura 1C).
- Para a purificação dos CTs e estroma, basta a população total de ENG+ (Figura 1A) ou CD55+ (Figura 1D) para excluir a fração endotelial CD34+ (Figura 1E) e distinguir as células esteroidogênicas (ANPEP+) e não esteroidogênicas (ANPEP-). Tenha cuidado para compensar o sangramento entre os fluoróforos que estão próximos nos espectros de emissão.
- Para validar a pureza da fração de células classificadas, execute 5% do volume total capturado através do instrumento FACS e garanta que as células preencham as portas esperadas e estejam presentes em >95% de pureza.
6. Processamento do tecido cortical ovariano
- Bissetriz o restante do ovário e excise a medula usando tesouras finas curvas e bisturis, tomando cuidado para evitar danos ao córtex ovariano.
- Continue processando e afinando o córtex ovariano raspando suavemente até que a medula mínima permaneça. Certifique-se de usar a força mínima necessária.
NOTA: A espessura do tecido cortical deve estar entre 1 mm e 1,5 mm. - Divida o tecido cortical em tiras de 2-3 mm de largura ao longo do comprimento do ovário.
7. Congelamento lento do tecido ovariano
- Preparação para congelamento
- Coloque uma tira cortical em cada frasco para injetáveis criogénicos refrigerado contendo solução de congelação.
- Agitar os frascos para injetáveis criogénicos que contêm as tiras corticais numa placa giratória durante 20 minutos a 4 °C.
- Congelamento lento do tecido ovariano5
- Coloque os crióscos contendo tecido ovariano num congelador programável regulado para começar a 0 °C.
- Arrefecer a uma taxa de 2 °C/min até -7 °C.
- Manter os crióvios a esta temperatura durante 10 minutos.
- Nuclear a formação de cristais de gelo ao tocar cada criovial com uma ponta de algodão que foi brevemente imersa em nitrogênio líquido (LN2).
- Arrefecer a uma taxa de 0,3 °C/min até que a temperatura da amostra atinja -40°C.
- Aumente a taxa de resfriamento para 10 °C/min até que a temperatura da amostra atinja -140 °C.
- Transfira os criósculos para armazenamento em LN2.
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Representative Results
Isolamos os folículos da superfície do ovário e os tratamos enzimaticamente para isolar os GCs, bem como as células do teca e do estroma ao redor da cavidade antral. As células foram coletadas, e as frações celulares foram separadas dos folículos antrais (diâmetros variando entre 0,5 mm e 4 mm) por FACS para >95% de pureza (Figura 1).
Para marcar e purificar frações celulares únicas dentro dos folículos antrais humanos, combinamos digestão enzimática com classificação por citometria de fluxo. Identificamos previamente proteínas de superfície que marcamespecificamente as frações 2 residentes nos folículos. Mostramos que CD99 (vermelho na Figura 1A) rotula especificamente os GCs, e o PVRL1 (amarelo na Figura 1A) está cada vez mais localizado no compartimento oophorous GC à medida que os folículos antrais aumentam de tamanho2. Demonstramos também que anticorpos contra endoglina (ENG, verde na Figura 1A) ou CD55 (Figura 1D) demarcam especificamente todos os estromas e CTs e que a alanina aminopeptidase (ANPEP, Figura 1E) é expressa especificamente pelos CTs androgênicos 2,6.
As células foram marcadas com um anticorpo direcionado contra CD99 para identificar GCs, e anticorpos contra CD45 foram usados para excluir células hematopoéticas (Figura 1B,C). Os anticorpos contra PVRL1 permitiram a separação da população de GC em compartimentos oóforos e murais (Figura 1C). Após digestão enzimática com colagenase/dispase, as preparações celulares marcadas com anticorpos contra CD55 (ou, alternativamente, ENG), CD34 e ANPEP permitiram a captura de todos os CTs estroma/CT (CD55+) e/ou CTs androgênicos (ANPEP+), com a exclusão das células endoteliais (CD34+) das populações de CT (Figura 1D,E). Usando este painel e um protocolo de dissociação enzimática stepwise, marcamos e purificamos células hematopoéticas, endoteliais, granulosas (ovóforas e murais) e tecais (estromais e androgênicas) dos folículos antrais de ovários recém-ressecados.
Figura 1: Marcação e purificação de células específicas de linhagem de folículos antrais humanos. (A) Micrografia representativa mostrando os compartimentos GC (CD99+ PVRL+/-) e TC (ENG+) dentro dos folículos humanos na fase antral; As caixas de traçado branco são ampliadas para a direita. (B-E) Gráficos de classificação representativos identificando GCs como células CD45- CD99+ PVRL1+/- (a e b), bem como CTs genéricos (CD34- CD55+) e androgênicos (CD34- CD55+ ANPEP+) (C,D). Os condomínios fechados são compartilhados entre (B,C) e (D,E); os controles sem manchas são mostrados à esquerda em (B-E). Barra de escala = (A) 100 μm. Abreviações: GC = célula da granulosa; CT = célula teca; PVRL = nectina; ANPEP = alanina aminopeptidase; Nuc = núcleos; CSC = dispersão lateral; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo de célula | Anticorpos de Inclusão | Anticorpos de exclusão |
| Células da granulosa | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| Todas as células Theca | CD55 ou ENG | CD34 & CD45 |
| Células Theca Esteroidogênicas | ANPEP | CD34 & CD45 |
Tabela 1: Lista de anticorpos que podem ser usados para identificar GCs, CTs e estroma ovariano. Abreviações: GC = célula da granulosa; TC = célula teca.
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Discussion
A melhor resolução da diversidade celular dentro dos folículos ovarianos é clinicamente importante por várias razões. Na aplicação do protocolo acima para o isolamento dos subtipos fenotípicos únicos que residem nos folículos em estágio antral, vários fatores devem ser considerados. Em primeiro lugar, a saúde e a viabilidade do tecido ovariano do qual o folículo antral é derivado é fundamental para determinar a qualidade das células e o sucesso das aplicações a jusante. Isso pode ser otimizado minimizando o intervalo isquêmico, trabalhando rapidamente (preferencialmente em pares) e preparando os espaços laboratoriais que serão utilizados para o processamento tecidual e FACS. Em segundo lugar, esses protocolos são bem adequados para folículos em estágio antral precisamente porque eles podem ser facilmente identificados e extraídos do ovário para acessar eficientemente a cavidade antral; Uma abordagem semelhante para o estudo de folículos em estágio inicial e pré-antrais produziria uma população celular com heterogeneidade muito maior. Finalmente, o número e a qualidade das células obtidas dos folículos variam muito dependendo de quão avançado é o desenvolvimento de um folículo e se o folículo entrou ou não em um estado de atresia. Embora essas limitações tornem o estudo da reconstrução da foliculogênese um desafio, o isolamento eficiente e robusto de células derivadas de folículos permitirá interrogar mais detalhadamente os mecanismos subjacentes à biologia ovariana humana e à infertilidade.
A purificação dos CGs dos folículos antrais foi utilizada anteriormente por nosso grupo para demonstrar a influência deletéria dos níveis superfisiológicos do hormônio anti-Mülleriano (AMH) sobre o desenvolvimento folicular6. Nesse estudo, o tecido ovariano criopreservado e descongelado de pacientes com preservação da fertilidade e doadores de órgãos foi transplantado em camundongos imunocomprometidos em diferentes braços experimentais: controle ou células endoteliais que expressam AMH. A exposição crônica ao AMH levou a um fenótipo de luteinização acelerada que se refletiu no aumento do tamanho do folículo, mas isso só foi claramente elucidado na assinatura molecular dos GCs residentes no folículo.
À medida que o ovócito sai da dormência, os GCs adquirem uma morfologia cuboidal7, começam a proliferar e, juntamente com o ovócito, secretam sinais que recrutam as células do estroma circundante e promovem sua diferenciação em direção a um destino CT8. Embora a diferenciação adequada de células do estroma em CTs especializadas seja conhecida por ser essencial para a fertilidade, os mecanismos que conduzem a especificação dos CT e governam sua interação com as células residentes nos folículos durante a maturação dos oócitos não estão bem definidos. Em humanos, a heterogeneidade celular que existe nos CTs ao redor do folículo permanece particularmente elusiva porque, ao contrário dos GCs, que são facilmente acessíveis em um ambiente de FIV, o isolamento e a cultura de CTs requerem uma biópsia direta dos folículos pré-ovulatórios. Além disso, a maioria dos estudos tem se baseado na dissociação mecânica da camada tecal de folículos antrais isolados 9,10, produzindo uma mistura heterogênea de populações estromais, tecais, vasculares e imunes.
Abordagens multi-ômicas de célula única revelaram a heterogeneidade celular de numerosos tecidos e os diversos tipos celulares que promovem o desenvolvimento de ovócitos dentro do ovário existem dentro dos folículos em uma ampla gama de tamanhos e estágios de maturação. Os métodos descritos acima complementam os protocolos existentes para o isolamento e congelamento do tecido ovariano com a finalidade de preservação da fertilidade e podem ser implementados em paralelo para a obtenção de células residentes no folículo para fins clínicos ou experimentais. A aplicação destes métodos será importante para decifrar os mecanismos moleculares que governam a foliculogênese humana e são um pré-requisito crítico para abordagens que visem promover o desenvolvimento/maturação oocitária a partir de folículos primordiais in vitro.
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Disclosures
Todos os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio do Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) e do Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). O N.L.G é apoiado pela bolsa de treinamento de pós-doutorado em Células-Tronco e Medicina Regenerativa da NYSTEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
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