Summary
यहां, हम एंट्रल रोम से डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की पहचान और शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम कॉर्टिकल स्ट्रिप्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए पूरे अंडाशय को संसाधित करने के तरीकों पर विस्तार से बताते हैं, जबकि बरकरार एंट्रल फॉलिकल्स की कटाई भी करते हैं जिन्हें ग्रैनुलोसा, थेका, एंडोथेलियल, हेमटोपोइएटिक और स्ट्रोमल कोशिकाओं सहित कई कूप निवासी कोशिका प्रकारों को मुक्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से इलाज किया जाता है।
Abstract
अंडाणुओं की सक्रियता, वृद्धि, विकास और परिपक्वता एक जटिल प्रक्रिया है जो न केवल अंडाशय के कई सेल प्रकारों के बीच समन्वित होती है, बल्कि हाइपोथैलेमिक / पिट्यूटरी / डिम्बग्रंथि सर्किट के भीतर नियंत्रण के कई बिंदुओं पर भी होती है। अंडाशय के भीतर, डिम्बग्रंथि के रोम के भीतर अंडाणु के साथ घनिष्ठ संबंध में कई विशेष कोशिका प्रकार बढ़ते हैं। इन कोशिकाओं के जीव विज्ञान को बाद के चरणों में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, जब वे आसानी से सहायक प्रजनन उपचार के उपोत्पाद के रूप में पुनर्प्राप्त किए जाते हैं। हालांकि, अंडाशय से सीधे अलग किए गए छोटे एंट्रल रोम का गहन विश्लेषण आमतौर पर मानव डिम्बग्रंथि के ऊतकों की कमी और सहायक प्रजनन उपचार से गुजरने वाले रोगियों में अंडाशय तक सीमित पहुंच के कारण नहीं किया जाता है।
अंडाशय निवासी कोशिकाओं की समवर्ती पहचान / अलगाव के साथ कॉर्टिकल स्ट्रिप्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए पूरे अंडाशय को संसाधित करने के ये तरीके एंट्रल कूप विकास के शुरुआती चरणों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण को सक्षम करते हैं। हम एंट्रल फॉलिकल्स को एंजाइमेटिक रूप से इलाज करके और ग्रैनुलोसा, थेका, एंडोथेलियल, हेमटोपोइएटिक और स्ट्रोमल कोशिकाओं को अलग करके असतत सेल प्रकारों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। विभिन्न आकारों और विकास के चरणों में एंट्रल फॉलिकल्स से कोशिकाओं का अलगाव सेलुलर और आणविक तंत्र के व्यापक विश्लेषण को सक्षम बनाता है जो कूप विकास और डिम्बग्रंथि शरीर विज्ञान को चलाता है और व्यवहार्य कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करता है जिसे कूप माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करने के लिए विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है।
Introduction
मानव अंडाशय के प्राथमिक कार्यात्मक तत्व रोम हैं, जो अंडाणुओं के विकास और विकास को नियंत्रित करते हैं। इन विट्रो निषेचन के संदर्भ में कूपिक कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित किए गए हैं, लेकिन ये केवल अंडाणु पुनर्प्राप्ति1 के बिंदु पर ल्यूटिनाइज्ड रोम से कोशिकाओं के संग्रह के लिए उपयुक्त हैं। हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो विभिन्न विकास चरणों में एंट्रल रोम से असतत कोशिका आबादी के अलगाव को सक्षम बनाता है जो देशी अंडाशय या क्सीनट्रांसप्लांट्ड डिम्बग्रंथि ऊतक2 से उत्पन्न होते हैं। यद्यपि इस बात पर आम सहमति है कि अंडाणु की खेती में कूप निवासी कोशिकाओं का योगदान अत्यधिक महत्वपूर्ण है, कुछ अध्ययनों ने एंट्रल-स्टेज फॉलिकल्स में मौजूद अद्वितीय फेनोटाइपिक उपप्रकारों को भावी प्रभाव से पहचाना और निकाला है। विभिन्न विकास चरणों के दौरान विशेष कोशिकाओं के बीच भेदभाव पदानुक्रम और सिग्नल ट्रांसडक्शन की गहरी समझ होमियोस्टैटिक और पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत डिम्बग्रंथि शरीर विज्ञान की हमारी समझ को व्यापक बना सकती है। इसके अलावा, असतत सेलुलर उपप्रकारों का भेदभाव और कूप विकास / परिपक्वता में उनके आणविक योगदान एक्स विवो सरोगेट्स उत्पन्न करने का एक साधन प्रदान कर सकते हैं जो अंडाणु परिपक्वता को बढ़ावा देने और / या अंतःस्रावी शिथिलता का इलाज करने के लिए डिम्बग्रंथि समारोह का पुनर्निर्माण करते हैं।
अंडाशय के भीतर प्रत्येक अद्वितीय कोशिका प्रकार कूप के जटिल कार्य में योगदान देता है, जो प्रभावी रूप से अंडाणु के विकास और परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए एक असतत मिनी-अंग के रूप में कार्य करता है। कूप का केंद्र बिंदु, अंडाणु सीधे ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (जीसी) की एक निरंतर परत से घिरा होता है, जिसमें थेका कोशिकाएं (टीसी) कोशिकाओं की एक द्वितीयक परत बनाती हैं जो कूपिक इकाई की रचना करने के लिए अंडाणु और जीसी के साथ गठबंधन करती हैं। हालांकि दो समूहों में वर्गीकृत, जीसी और टीसी में कई उपप्रकार होते हैं। जीसी को कूप के भीतर उनकी स्थिति के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है; जीसी जो अंडाणु को घेरते हैं बनाम जो तहखाने की झिल्ली से सटे होते हैं, उन्हें क्रमशः ओफोरस और भित्ति जीसी के रूप में नामित किया जाता है, और ये उपप्रकार अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर प्रदर्शित करते हैं। टीसी में कई उपप्रकार हैं जो स्टेरॉयडजेनिक, चयापचय और संरचनात्मक सहायता प्रदान करने के लिए कार्य करते हैं। एंडोथेलियल, पेरिवास्कुलर और प्रतिरक्षा कोशिकाएं सामान्य डिम्बग्रंथि शरीर विज्ञान को बनाए रखने में एक केंद्रीय भूमिका निभाती हैं। डिम्बग्रंथि स्ट्रोमा न केवल कूप विकास के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है, बल्कि संभवतः पूर्वजों का एक स्रोत भी प्रदान करता है जो टीसी को जन्म देते हैं। अंडाशय के भीतर सेलुलर उपप्रकारों का यह बहुस्तरीय परिसर है जो अंतःस्रावी और प्रजनन अंग दोनों के रूप में इसके कार्य को सक्षम बनाता है।
यह पेपर एंट्रल रोम से ग्रैनुलोसा, थेका, स्ट्रोमल, एंडोथेलियल और हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की पहचान और शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग इन डिम्बग्रंथि कोशिकाओं को अलग करने और एकल-कोशिका अनुक्रमण का उपयोग करके उनका विश्लेषण करने के लिए किया है, इसके बाद विभिन्न विकास चरणों के रोम में विशिष्ट धुंधलापन है। प्रोटोकॉल एक सरल पद्धति प्रदान करता है जो प्रतिकृति है और अंडाशय के शरीर विज्ञान और विकृति दोनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण को सक्षम करेगा।
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Protocol
चूहों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को वेइल कॉर्नेल मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। डिम्बग्रंथि ऊतक का उपयोग करके सभी क्सीनट्रांसप्लांटेशन प्रयोग प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किए गए थे। दोनों अंडाशय को 14 वर्षीय मस्तिष्क-मृत अंग दाता से अलग किया गया था, जिसमें रेडियो / कीमोथेरेपी का कोई इतिहास नहीं था और अंतःस्रावी या प्रजनन स्थितियों का कोई प्रलेखित इतिहास नहीं था। वेइल कॉर्नेल मेडिसिन की संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) समिति ने ऊतक के संग्रह को मंजूरी दे दी, और ऊतक के उपयोग के बारे में सूचित सहमति के बाद अंग दाता के परिवार से अनुमोदन प्राप्त किया गया।
1. डिम्बग्रंथि ऊतक संग्रह और हैंडलिंग
- पूरे अंडाशय और संबंधित ऊतक को इकट्ठा करें, और बाँझ नमकीन घोल में कुल्ला करें।
- बाँझ चिमटी का उपयोग करके, अंडाशय को बाँझ कंटेनर में रखें। कंटेनर में बाँझ, बफर, ठंडा समाधान (जैसे, लीबोविट्ज़ का एल -15 माध्यम) डालें। सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से तरल के साथ कवर किया गया है।
- कंटेनर को बंद करें और बाँझ प्लास्टिक बैग का उपयोग करके इसे डबल-बैग करें। कंटेनर को एक पृथक बॉक्स (जैसे, स्टायरोफोम) के भीतर बर्फ पर परिवहन करें। नमूनों को प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें जो अंडाशय को जल्द से जल्द संसाधित करेगा, अधिमानतः 5 घंटे 3,4 से अधिक समय में।
2. डिम्बग्रंथि ऊतक को संसाधित करना
नोट: सुनिश्चित करें कि इस्केमिक अंतराल को यथासंभव कम करने के लिए ऊतक के प्रयोगशाला में आने से पहले सभी अभिकर्मकों और उपकरणों को तैयार किया जाता है। बफर को ठंड से 1 सप्ताह पहले तक तैयार किया जा सकता है और उपयोग तक प्रशीतित किया जा सकता है।
- डिम्बग्रंथि प्रसंस्करण और ठंड के लिए तैयारी
- ऊतक प्रसंस्करण की तैयारी में जैव सुरक्षा कैबिनेट में निष्फल सर्जिकल उपकरण सेट करें: एक संख्या 21 स्केलपेल; एक नंबर 11 स्केलपेल; तेज महीन घुमावदार कैंची; एक लंबा बल (~ 150 मिमी लंबाई); और दो मध्यम बल (~ 110 मिमी लंबाई)।
- ऊतक प्रसंस्करण माध्यम के 100 एमएल तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें): लेबोविट्ज़ के एल -15 माध्यम में एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान होता है और 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया जाता है। मध्यम को ठंडा रखें।
- क्रायोवियल को लेबल करें, प्रत्येक शीशी में 1.5 एमएल फ्रीजिंग समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- उपयोग के लिए हाथ पर एक 6-वेल प्लेट उपलब्ध है।
- ऊतक के आगमन पर
- 70% इथेनॉल समाधान के साथ कंटेनर स्प्रे करें, अच्छी तरह से पोंछ ें, और इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर रखें।
- बाँझ दस्ताने पहनकर, कंटेनर खोलें। अंडाशय को एक बाँझ पेट्री डिश में रखें, और ऊतक को हाइड्रेट करने के लिए ठंडा माध्यम (चरण 2.1.2 से) डालें। सुनिश्चित करें कि अंडाशय माध्यम में आधा डूबा हुआ है।
- किसी भी सीवन या अन्य सामग्री को हटा दें और अंडाशय से दूर अवशिष्ट आसपास के ऊतक को विच्छेदित करें।
3. एंट्रल रोम का अलगाव
- अलगाव के लिए अलग-अलग रोम की पहचान करें। स्वस्थ रोम चुनने में, किसी भी रक्त से भरे, अंधेरे, या गैर-सममित रोम को बाहर रखें, क्योंकि वे एट्रेटिक होने की संभावना रखते हैं।
- स्केलपेल्स का उपयोग करके पूरे अंडाशय से चुने हुए एंट्रल रोम को अलग करें, कूप को शामिल करने वाले कॉर्टिकल ऊतक को बाहर निकालकर एंट्रम को बरकरार रखें।
- 6-वेल प्लेट के एक कुएं में प्रत्येक उत्पादित बरकरार एंट्रल फॉलिकल रखें। यदि वर्णनात्मक उद्देश्यों के लिए आवश्यक हो, तो कूप व्यास निर्धारित करने के लिए पकवान के नीचे रखे एक शासक का उपयोग करें।
- एक स्केलपेल का उपयोग करके, एंट्रल गुहा तक पहुंच प्राप्त करने के लिए बरकरार एंट्रल फॉलिकल को विभाजित करें, और 4 एमएल एंजाइमेटिक सेल डिटेचमेंट माध्यम जोड़ें। प्लेट को 10 मिनट के लिए 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
- आवश्यकतानुसार अतिरिक्त एंट्रल रोम के निष्कर्षण को दोहराएं।
4. कूप निवासी कोशिकाओं का अलगाव
- इनक्यूबेशन बाद, 20% एफबीएस युक्त उपलब्ध माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें, और पी 1,000 माइक्रोपिपेट के साथ विभाजित रोम पर माध्यम के बार-बार, जोरदार पाइपिंग द्वारा फ्लश करें।
- माध्यम एकत्र करें, और इसे 100 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित करें।
- फ़िल्टर किए गए सुपरनैटेंट को 300 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और लेबलिंग और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के लिए बर्फ पर सेल गोली (जीसी से समृद्ध) को आरक्षित करें।
- शेष ऊतक को कोलेजनेस (100 U/mL) और डिस्पेस (1 U/mL) के मिश्रण में एक संतुलित लवणीय घोल (जैसे, हैंक्स) में पतला करें, और 30 मिनट के लिए 5%CO2 और 37 °C पर इनक्यूबेट करें, यांत्रिक रूप से 10 मिनट और 20 मिनट के बाद दो बार ट्राइट्यूरेशन और जोरदार पाइपिंग (यानी, 10-15 पिपेट टिप से गुजरता है) द्वारा ऊतक को बाधित करें।
- ऊतक युक्त मीडिया को पुनर्प्राप्त करें, पी 1,000 माइक्रोपिपेट टिप के माध्यम से पाइपिंग के माध्यम से फ्लश करें, और 100 μm फ़िल्टर के माध्यम से तनाव लें।
- 3मिनट के लिए 300 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और लेबलिंग और एफएसीएस के लिए बर्फ पर सेल गोली (टीसी और स्ट्रोमा कोशिकाओं से समृद्ध) को अलग रखें।
5. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग
- ब्लॉकिंग समाधान (पीबीएस + 0.1% एफबीएस) में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
- सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी युक्त समाधान को अवरुद्ध करने में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें (जीसी और टीसी की पहचान करने के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी संयोजनों के लिए तालिका 1 देखें), और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को धोएं और सेंट्रीफ्यूज करें। 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) युक्त एफएसीएस बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और गेटिंग के लिए फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी की प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करके कोशिकाओं की एक छोटी आबादी (500-1,000) को पकड़ने के लिए एफएसीएस उपकरण के माध्यम से सेल निलंबन चलाएं।
- अद्वितीय उप-आबादी की पहचान के लिए, निम्नलिखित गेटिंग रणनीतियों का उपयोग करें:
- जीसी के शुद्धिकरण के लिए, सीडी 45+ कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) के चारों ओर एक गेट खींचें, और इस आबादी को सीडी 99 + आबादी (चित्रा 1 ए और चित्रा 1 सी) से बाहर करें; फिर, शेष CD99+ अंश को PVRL+/- अंशों में विभाजित करें (चित्र 1A और चित्र 1C)।
- टीसी और स्ट्रोमा के शुद्धिकरण के लिए, सीडी 34 + एंडोथेलियल अंश (चित्रा 1 ई) को बाहर करने और स्टेरॉयडोजेनिक (एएनपीईपी +) और गैर-स्टेरॉयडोजेनिक (एएनपीईपी -) कोशिकाओं को अलग करने के लिए कुल ईएनजी + (चित्रा 1 ए) या सीडी 55 + (चित्रा 1 डी) आबादी को गेट करें। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में करीब आने वाले फ्लोरोफोरे के बीच रक्तस्राव की भरपाई करने के लिए सावधान रहें।
- क्रमबद्ध सेल अंश की शुद्धता को मान्य करने के लिए, एफएसीएस उपकरण के माध्यम से कुल कैप्चर की गई मात्रा का 5% चलाएं, और यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं अपेक्षित द्वार ों को आबाद करती हैं और >95% शुद्धता पर मौजूद हैं।
6. डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल ऊतक का प्रसंस्करण
- अंडाशय के शेष भाग को विभाजित करें, और डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को नुकसान से बचने के लिए सावधान रहते हुए, घुमावदार महीन कैंची और स्केलपेल का उपयोग करके मज्जा का उत्पादन करें।
- न्यूनतम मज्जा रहने तक कोमल स्क्रैपिंग द्वारा डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को संसाधित और पतला करना जारी रखें। आवश्यक न्यूनतम बल का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
नोट: कॉर्टिकल ऊतक मोटाई 1 मिमी और 1.5 मिमी के बीच होनी चाहिए। - अंडाशय की लंबाई के साथ कॉर्टिकल ऊतक को 2-3 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स में विभाजित करें।
7. डिम्बग्रंथि ऊतक धीमी ठंड
- ठंड के लिए तैयारी
- ठंड समाधान युक्त प्रत्येक ठंडा क्रायोजेनिक शीशी में एक कॉर्टिकल स्ट्रिप रखें।
- कॉर्टिकल स्ट्रिप्स युक्त क्रायोजेनिक शीशियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए घूर्णन प्लेट पर हिलाएं।
- डिम्बग्रंथिके ऊतकों की धीमी गति से ठंड
- डिम्बग्रंथि के ऊतकों वाले क्रायोवियल को 0 डिग्री सेल्सियस पर शुरू करने के लिए प्रोग्राम करने योग्य फ्रीजर सेट में रखें।
- -7 डिग्री सेल्सियस तक 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से ठंडा करें।
- क्रायोवियल को 10 मिनट के लिए इस तापमान पर बनाए रखें।
- प्रत्येक क्रायोवियल को एक कपास की नोक के साथ स्पर्श करके न्यूक्लियेट बर्फ क्रिस्टल का गठन जो तरल नाइट्रोजन (एलएन2) में संक्षेप में डूब गया है।
- 0.3 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से ठंडा करें जब तक कि नमूना तापमान -40 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए।
- ठंडा होने की दर को 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक बढ़ाएं जब तक कि नमूना तापमान -140 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए।
- एलएन2 में भंडारण के लिए क्रायोवियल को स्थानांतरित करें।
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Representative Results
हमने अंडाशय की सतह से रोम को अलग किया और जीसी के साथ-साथ एंट्रल गुहा के आसपास थेका और स्ट्रोमा कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से उनका इलाज किया। कोशिकाओं को एकत्र किया गया था, और सेल अंशों को एफएसीएस द्वारा एंट्रल फॉलिकल्स (0.5 मिमी और 4 मिमी के बीच व्यास) से >95% शुद्धता तक क्रमबद्ध किया गया था (चित्रा 1)।
मानव एंट्रल फॉलिकल्स के भीतर अद्वितीय सेलुलर अंशों को लेबल और शुद्ध करने के लिए, हमने प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग के साथ एंजाइमेटिक पाचन को जोड़ा। हमने पहले सतह प्रोटीन की पहचान की थी जो विशेष रूप से कूप-निवासीअंशों को चिह्नित करते हैं। हमने दिखाया है कि सीडी 99 (चित्रा 1 ए में लाल) विशेष रूप से जीसी लेबल करता है, और पीवीआरएल 1 (चित्रा 1 ए में पीला) तेजी से ओफोरस जीसी डिब्बे में स्थानीयकृत होता है क्योंकि एंट्रल रोम आकार2 में बढ़ते हैं। हमने यह भी दिखाया है कि एंडोग्लिन (ईएनजी, चित्रा 1 ए में हरा) या सीडी 55 (चित्रा 1 डी) के खिलाफ एंटीबॉडी विशेष रूप से सभी स्ट्रोमा और टीसी का सीमांकन करते हैं और एलानिन एमिनोपेप्टिडेस (एएनपीईपी, चित्रा 1 ई) विशेष रूप से एंड्रोजेनिक टीसी 2,6 द्वारा व्यक्त किया जाता है।
कोशिकाओं को जीसी की पहचान करने के लिए सीडी 9 9 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था, और सीडी 45 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं (चित्रा 1 बी, सी) को बाहर करने के लिए किया गया था। पीवीआरएल 1 के खिलाफ एंटीबॉडी ने जीसी आबादी को ओफोरस और भित्ति डिब्बों में अलग करने में सक्षम बनाया (चित्रा 1 सी)। कोलेजनेज /डिस्पैक के साथ एंजाइमेटिक पाचन के बाद, सीडी 55 (या वैकल्पिक रूप से ईएनजी), सीडी 34, और एएनपीईपी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए सेल की तैयारी ने टीसी आबादी से एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीडी 34+) के बहिष्करण के साथ सभी स्ट्रोमा / टीसी (सीडी 55 +) और / या एंड्रोजेनिक टीसी (एएनपीईपी +) को पकड़ने में सक्षम बनाया (चित्रा 1 डी, ई). इस पैनल और एक चरणबद्ध एंजाइमेटिक पृथक्करण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने ताजा कटे हुए अंडाशय के सूक्ष्म रोम से हेमटोपोइएटिक, एंडोथेलियल, ग्रैनुलोसा (ओफोरस और भित्ति), और थेका (स्ट्रोमल और एंड्रोजेनिक) कोशिकाओं को लेबल और शुद्ध किया।
चित्रा 1: मानव सूक्ष्म रोम से वंश-विशिष्ट कोशिकाओं का लेबलिंग और शुद्धिकरण। (ए) सूक्ष्म अवस्था में मानव रोम के भीतर जीसी (सीडी 99 + पीवीआरएल + / -) और टीसी (ईएनजी +) डिब्बों को दिखाने वाला प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ; सफेद स्ट्रोक बॉक्स दाईं ओर आवर्धित होते हैं। (B-E) जीसी की पहचान सीडी 45- सीडी 99 + पीवीआरएल 1 + / - कोशिकाओं (ए और बी) के साथ-साथ जेनेरिक (सीडी 34- सीडी 55 +) और एंड्रोजेनिक (सीडी 34- सीडी 55 + एएनपीईपी +) टीसी (सी, डी) के रूप में करने वाले प्रतिनिधि सॉर्ट प्लॉट। गेटेड आबादी (बी, सी) और (डी, ई) के बीच साझा की जाती है; बिना दाग वाले नियंत्रण (बी-ई) में बाईं ओर दिखाए जाते हैं। स्केल बार = (ए) 100 μm। संक्षेप: जीसी = ग्रैनुलोसा सेल; टीसी = थेका सेल; पीवीआरएल = नेक्टिन; एएनपीईपी = एलानिन एमिनोपेप्टिडेस; न्यूक = नाभिक; एसएससी = साइड स्कैटर; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफिकोसायनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| सेल का प्रकार | समावेश एंटीबॉडी | बहिष्करण एंटीबॉडी। |
| ग्रैनुलोसा कोशिकाएं। | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| सभी थेका कोशिकाएं | CD55 या ENG | CD34 & CD45 |
| स्टेरॉयडोजेनिक थेका कोशिकाएं | ANPEP | CD34 & CD45 |
तालिका 1: एंटीबॉडी की सूची जिसका उपयोग जीसी, टीसी और डिम्बग्रंथि स्ट्रोमा की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप: जीसी = ग्रैनुलोसा सेल; टीसी = थेका सेल।
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Discussion
डिम्बग्रंथि के रोम के भीतर सेलुलर विविधता का बेहतर समाधान कई कारणों से चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण है। उपरोक्त प्रोटोकॉल को अद्वितीय फेनोटाइपिक उपप्रकारों के अलगाव के लिए लागू करने में जो एंट्रल स्टेज फॉलिकल्स के भीतर रहते हैं, कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, डिम्बग्रंथि के ऊतकों का स्वास्थ्य और व्यवहार्यता जिसमें से एंट्रल कूप प्राप्त होता है, कोशिकाओं की गुणवत्ता और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सफलता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है। यह इस्केमिक अंतराल को कम करके, जल्दी से काम करके (अधिमानतः जोड़े में), और प्रयोगशाला रिक्त स्थान तैयार करके अनुकूलित किया जा सकता है जिसका उपयोग ऊतक प्रसंस्करण और एफएसीएस के लिए किया जाएगा। दूसरा, ये प्रोटोकॉल एंट्रल-स्टेज फॉलिकल्स के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं क्योंकि उन्हें एंट्रल कैविटी तक कुशलतापूर्वक पहुंचने के लिए अंडाशय से आसानी से पहचाना और निकाला जा सकता है; प्रारंभिक चरण और पूर्व-एंट्रल रोम के अध्ययन के लिए एक समान दृष्टिकोण बहुत अधिक विषमता के साथ एक सेल आबादी पैदा करेगा। अंत में, रोम से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या और गुणवत्ता व्यापक रूप से भिन्न होगी, जो इस बात पर निर्भर करती है कि एक कूप कितना विकसित रूप से उन्नत है और कूप ने एट्रेसिया की स्थिति में प्रवेश किया है या नहीं। हालांकि ये सीमाएं फॉलिकुलोजेनेसिस के पुनर्निर्माण के अध्ययन को एक चुनौती बनाती हैं, कूप-व्युत्पन्न कोशिकाओं का कुशल और मजबूत अलगाव मानव डिम्बग्रंथि जीव विज्ञान और बांझपन के अंतर्निहित तंत्र की आगे की पूछताछ को सक्षम करेगा।
एंट्रल फॉलिकल्स से जीसी के शुद्धिकरण का उपयोग पहले हमारे समूह द्वारा कूपविकास पर एंटी-मुलेरियन हार्मोन (एएमएच) के सुपर फिजियोलॉजिकल स्तरों के हानिकारक प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है। उस अध्ययन में, प्रजनन संरक्षण रोगियों और अंग दाताओं दोनों से क्रायोसंरक्षित और पिघला हुआ डिम्बग्रंथि ऊतक विभिन्न प्रयोगात्मक बाहों में इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था: नियंत्रण या एएमएच-व्यक्त एंडोथेलियल कोशिकाएं। एएमएच के पुराने संपर्क ने त्वरित ल्यूटिनाइजेशन के फेनोटाइप को प्रेरित किया जो बढ़े हुए कूप आकार में परिलक्षित हुआ था, लेकिन यह केवल कूप-निवासी जीसी के आणविक हस्ताक्षर में स्पष्ट रूप से स्पष्ट था।
जैसे ही अंडाणु डॉर्मेंसी से बाहर निकलता है, जीसी एक घनाकार आकृति विज्ञान7 प्राप्त करते हैं, प्रसार शुरू करते हैं, और अंडाणु के साथ मिलकर, संकेतों का स्राव करते हैं जो आसपास के स्ट्रोमा कोशिकाओं को भर्ती करते हैं और टीसी भाग्य8 की ओर उनके भेदभाव को बढ़ावा देते हैं। यद्यपि विशेष टीसी में स्ट्रोमा कोशिकाओं का उचित भेदभाव प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक माना जाता है, लेकिन तंत्र जो टीसी विनिर्देश को चलाते हैं और अंडाणु परिपक्वता के दौरान कूप-निवासी कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत को नियंत्रित करते हैं, अच्छी तरह से परिभाषित नहीं हैं। मनुष्यों में, कूप के आसपास के टीसी में मौजूद सेलुलर विषमता विशेष रूप से मायावी बनी हुई है, क्योंकि जीसी के विपरीत, जो आईवीएफ सेटिंग में आसानी से सुलभ हैं, टीसी के अलगाव और संस्कृति को प्रीओवुलेटरी रोम की प्रत्यक्ष बायोप्सी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अधिकांश अध्ययनों ने पृथक एंट्रल रोम 9,10 से थेका परत के यांत्रिक पृथक्करण पर भरोसा किया है, जिससे स्ट्रोमल, थेका, संवहनी और प्रतिरक्षा आबादी का विषम मिश्रण उत्पन्न होता है।
सिंगल-सेल मल्टी-ओमिक्स दृष्टिकोण ने कई ऊतकों की सेलुलर विषमता का खुलासा किया है और अंडाशय के भीतर अंडाणु विकास को बढ़ावा देने वाले विविध सेल प्रकार आकार और परिपक्वता चरणों की एक विस्तृत श्रृंखला में रोम के भीतर मौजूद हैं। ऊपर वर्णित विधियां प्रजनन संरक्षण के उद्देश्य से डिम्बग्रंथि के ऊतकों के अलगाव और ठंड के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल के पूरक हैं और नैदानिक या प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए कूप-निवासी कोशिकाओं की खरीद के लिए समानांतर में लागू की जा सकती हैं। इन विधियों का अनुप्रयोग आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण होगा जो मानव कूपियोजेनेसिस को नियंत्रित करता है और विट्रो में आदिम रोम से अंडाणु विकास / परिपक्वता को बढ़ावा देने के उद्देश्य से दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है।
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Disclosures
सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।
Acknowledgments
लेखक क्वीनी विक्टोरिया नेरी रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (डीजे) और हंग-चिंग लियू रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (एलएम) से समर्थन स्वीकार करते हैं। एनएलजी को एनवाईएसटीईएम स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा पोस्टडॉक्टरल प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
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