Summary
Her presenterer vi protokoller for identifisering og rensing av eggstokkceller fra antralfollikler. Vi utdyper metoder for behandling av hele eggstokker for kryopreservering av kortikale strimler samtidig som vi høster intakte antralfollikler som behandles enzymatisk for å frigjøre flere follikkelboende celletyper, inkludert granulosa, theca, endotel, hematopoietiske og stromale celler.
Abstract
Aktivering, vekst, utvikling og modning av oocytter er en kompleks prosess som koordineres ikke bare mellom flere celletyper av eggstokken, men også over flere kontrollpunkter innenfor hypothalamus / hypofysen / eggstokkkretsen. Innenfor eggstokken vokser flere spesialiserte celletyper i nær tilknytning til oocytten i eggstokkfolliklene. Biologien til disse cellene har blitt godt beskrevet i senere stadier, når de lett gjenvinnes som biprodukter av assistert reproduktiv behandling. Imidlertid utføres den grundige analysen av små antralfollikler isolert direkte fra eggstokken ikke vanligvis på grunn av mangel på humant eggstokkvev og begrenset tilgang til eggstokken hos pasienter som gjennomgår assistert reproduktiv behandling.
Disse metodene for behandling av hele eggstokkene for kryopreservering av kortikale strimler med samtidig identifisering / isolering av ovariebosatte celler muliggjør høyoppløselig analyse av de tidlige stadiene av antralfollikelutvikling. Vi demonstrerer protokoller for å isolere diskrete celletyper ved å behandle antralfollikler enzymatisk og separere granulosa-, theca-, endotel-, hematopoietiske og stromale celler. Isoleringen av celler fra antralfolliklene i forskjellige størrelser og utviklingsstadier muliggjør omfattende analyse av de cellulære og molekylære mekanismene som driver follikelvekst og ovariefysiologi og gir en kilde til levedyktige celler som kan dyrkes in vitro for å rekapitulere follikelmikromiljøet.
Introduction
De primære funksjonelle elementene i den menneskelige eggstokken er folliklene, som styrer veksten og utviklingen av oocytter. Protokoller for isolering av follikulære celler er godt etablert i sammenheng med in vitro-fertilisering , men disse er bare egnet for innsamling av celler fra luteiniserte follikler ved punktet for uthenting av oocytt1. Vi har utviklet en protokoll som muliggjør isolering av diskrete cellepopulasjoner fra antralfollikler i forskjellige utviklingsstadier som oppstår fra innfødte eggstokker eller xenotransplantert eggstokkvev2. Selv om det er enighet om at bidragene fra follikkelbosatte celler til dyrking av oocytten er svært viktige, har få studier prospektivt identifisert og ekstrahert de unike fenotypiske subtypene som er tilstede i antralstadiumfollikler. En dypere forståelse av differensieringshierarkiet og signaltransduksjon mellom spesialiserte celler under de forskjellige utviklingsstadiene kan utvide vår forståelse av ovariefysiologi under homeostatiske og patologiske forhold. Videre kan diskriminering av diskrete cellulære subtyper og deres molekylære bidrag til follikelvekst / modning gi et middel til å generere ex vivo surrogater som rekonstruerer ovariefunksjonen for å fremme oocytmodning og / eller behandle endokrin dysfunksjon.
Hver unik celletype i eggstokken bidrar til follikkelens komplekse funksjon, som effektivt fungerer som et diskret miniorgan for å fremme veksten og modningen av oocytten den inneholder. Oocytten, midtpunktet i follikkelen, er direkte innhyllet av et kontinuerlig lag av granulosa-celler (GC), med theca-cellene (TC) som danner et sekundært lag av celler som kombinerer med oocytten og GCene for å komponere follikulærenheten. Selv om de er klassifisert i to grupper, inneholder GC og TC mange undertyper. GC er klassifisert i henhold til deres posisjon i follikkelen; GCer som omgir oocytten versus de som ligger ved siden av kjellermembranen, er betegnet som henholdsvis oophorous og mural GCs, og disse undertypene viser unike transkriptomiske signaturer. TCs har mange subtyper som fungerer for å gi steroidogen, metabolsk og strukturell støtte. Endotel-, perivaskulære og immunceller spiller en sentral rolle i å opprettholde normal ovariefysiologi. Ovarial stroma tjener ikke bare som et substrat for follikelvekst, men gir også sannsynligvis en kilde til forfedre som gir opphav til TCS. Dette flerlagskomplekset av cellulære subtyper i eggstokken er det som gjør det mulig å fungere som både et endokrint og et reproduktivt organ.
Dette papiret presenterer en protokoll for identifisering og rensing av granulosa, theca, stromale, endoteliske og hematopoietiske celler fra antralfollikler. Vi har brukt denne protokollen til å isolere disse eggstokkcellene og analysere dem ved hjelp av enkeltcellesekvensering, etterfulgt av spesifikk farging i follikler av forskjellige utviklingsstadier. Protokollen gir en enkel metodikk som er replikerbar og vil muliggjøre høyoppløselig analyse av både fysiologi og patologi av eggstokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer mus ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Weill Cornell Medicine. Alle xenotransplantasjonsforsøk med ovarievev ble utført i henhold til gjeldende retningslinjer og forskrifter. Begge eggstokkene ble isolert fra en 14 år gammel hjernedød organdonor uten tidligere radio/kjemoterapi og ingen dokumentert historie med endokrine eller reproduktive tilstander. IRB-komiteen (Institutional Review Board) i Weill Cornell Medicine godkjente innsamling av vev, og godkjenning fra familien til organdonoren ble innhentet etter informert samtykke om bruk av vev.
1. Oppsamling og håndtering av eggstokkvev
- Samle hele eggstokkene og tilhørende vev, og skyll i steril saltoppløsning.
- Bruk steril pinsett til å plassere eggstokkene i en steril beholder. Hell steril, bufret, kald oppløsning (f.eks. Leibovitz' L-15 medium) i beholderen. Sørg for at vevet er helt dekket med væsken.
- Lukk beholderen og dobbeltpose den med sterile plastposer. Transporter beholderen på is i en isolert boks (f.eks. isopor). Overfør prøvene til laboratoriet som skal behandle eggstokkene så snart som mulig, helst på en tid som ikke overstiger 5 t 3,4.
2. Behandling av eggstokkvev
MERK: Sørg for at alle reagenser og verktøy er forberedt før vevet kommer inn i laboratoriet for å redusere det iskemiske intervallet så mye som mulig. Bufferne kan tilberedes inntil 1 uke før frysing og oppbevares i kjøleskap til bruk.
- Forberedelser for eggstokkbehandling og frysing
- Sett steriliserte kirurgiske verktøy i biosikkerhetsskapet som forberedelse til vevsbehandling: ett nummer 21 skalpell; ett nummer 11 skalpell; skarpe fine buede saks; en lang tang (~ 150 mm lengde); og to mellomstore tanger (~110 mm lengde).
- Klargjør 100 ml vevsbehandlingsmedium (se materialtabellen): Leibovitz' L-15-medium inneholdende antibiotikum-antimykotisk løsning og filtrert med et 0,2 μm filter. Hold mediet avkjølt.
- Merk kryovialene, tilsett 1,5 ml fryseoppløsning (se materialfortegnelsen) i hvert hetteglass, og oppbevar det ved 4 °C.
- Ha tilgjengelig en 6-brønns plate for hånden for bruk.
- Ved ankomst av vevet
- Spray beholderen med 70% etanoloppløsning, tørk grundig og plasser den i biosikkerhetsskapet.
- Åpne beholderen med sterile hansker. Legg eggstokken i en steril petriskål, og hell kjølt medium (fra trinn 2.1.2) for å hydrere vevet. Sørg for at eggstokken er halvt nedsenket i mediet.
- Fjern eventuelle suturer eller annet materiale og dissekere de resterende omkringliggende vev vekk fra eggstokken.
3. Isolering av antralfollikler
- Identifiser individuelle follikler for isolasjon. Ved valg av sunne follikler, utelukk blodfylte, mørke eller ikke-symmetriske follikler, da de sannsynligvis vil være atretisk.
- Isoler de valgte antralfolliklene fra hele eggstokken ved hjelp av skalpeller, og hold antrummet intakt ved å ekskludere det kortikale vevet som omfatter follikkelen.
- Plasser hver utskåret intakt antralfollikkel i en brønn på 6-brønnsplaten. Hvis det er nødvendig for beskrivende formål, bruk en linjal plassert under parabolen for å bestemme follikeldiameteren.
- Bruk en skalpell, kryss den intakte antralfollikkelen for å få tilgang til antralhulen, og tilsett 4 ml enzymatisk celleavløsningsmedium. Inkuber platen i en fuktet inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C i 10 minutter.
- Gjenta ekstraksjonen av ytterligere antralfollikler etter behov.
4. Isolering av follikkel bosatt celler
- Etter inkubering, tilsett 4 ml tilgjengelig medium inneholdende 20% FBS, og skyll ved gjentatt, kraftig pipettering av mediet over de bisected follicles med en P1,000 mikropipette.
- Samle mediet, og pass det gjennom et 100 μm filter.
- Sentrifuger den filtrerte supernatanten ved 300 × g og 4 °C i 3 minutter. Aspirer supernatanten, og reserver cellepelleten (beriket med GC) på is for merking og fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
- Plasser det gjenværende vevet i en blanding av kollagenase (100 E/ml) og dispase (1 E/ml) fortynnet i en balansert saltoppløsning (f.eks. Hanks), og inkuber i 30 minutter ved 5 % CO2 og 37 °C, og forstyrr vevet mekanisk ved triturering og kraftig pipettering (dvs. 10-15 passerer gjennom pipetspissen) to ganger etter 10 minutter og 20 minutter.
- Gjenopprett medier som inneholder vevet, skyll via pipettering gjennom en P1000 mikropipettespiss, og sil gjennom et 100 mikropipettefilter.
- Sentrifuge ved 300 × g og 4 °C i 3 minutter. Aspirer supernatanten, og legg til side cellepelleten (beriket med TC og stromaceller) på is for merking og FACS.
5. Fluorescensaktivert cellesortering
- Resuspender cellepellets i blokkerende oppløsning (PBS + 0,1% FBS), og inkuber i 10 minutter ved 4 °C.
- Sentrifuge ved 300 × g og 4 °C i 3 minutter, og aspirer supernatanten.
- Resuspender cellepellets i blokkeringsoppløsning som inneholder direkte konjugerte antistoffer (se tabell 1 for passende antistoffkombinasjoner for å identifisere GC og TC), og inkuber på is i 10 minutter.
- Vask og sentrifuger cellene ved 300 × g og 4 °C i 3 minutter. Resuspendere cellene i FACS-buffer som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og kjør cellesuspensjonen gjennom et FACS-instrument for å fange en liten populasjon av cellene (500-1000) ved hjelp av fluorescensintensiteten av fluoroforkonjugerte antistoffer for gating.
- For identifisering av unike underpopulasjoner, bruk følgende gating-strategier:
- For rensing av GC, tegn en port rundt CD45+-cellene (figur 1B), og ekskluder denne populasjonen fra CD99+-populasjonen (figur 1A og figur 1C); Deretter deler du den gjenværende CD99+-fraksjonen videre inn i PVRL+/- fraksjoner (figur 1A og figur 1C).
- For rensing av TC og stroma, bestill den totale ENG+ (figur 1A) eller CD55+ (figur 1D) populasjonen for å ekskludere CD34+ endotelfraksjonen (figur 1E) og skille mellom steroidogene (ANPEP+) og ikke-steroidogene (ANPEP-) celler. Vær nøye med å kompensere for gjennomblødning mellom fluoroforer som ligger tett i emisjonsspekteret.
- For å validere renheten til den sorterte cellefraksjonen, kjør 5% av det totale fangede volumet gjennom FACS-instrumentet, og sørg for at cellene fyller de forventede portene og er tilstede ved >95% renhet.
6. Behandling av ovariekortikalt vev
- Bisect resten av eggstokken, og excise medulla ved hjelp av buede fine saks og skalpeller, vær forsiktig for å unngå skade på eggstokkene.
- Fortsett å behandle og tynne eggstokkbarken ved forsiktig skraping til minimal medulla forblir. Sørg for å bruke den minste kraften som trengs.
MERK: Den kortikale vevstykkelsen skal være mellom 1 mm og 1,5 mm. - Del det kortikale vevet i 2-3 mm brede strimler langs eggstokkens lengde.
7. Eggstokkvev langsom frysing
- Forberedelse for frysing
- Plasser en kortikal strimmel i hvert kjølte kryogene hetteglass med fryseoppløsning.
- Rist de kryogene hetteglassene med kortikale strimler på en roterende plate i 20 minutter ved 4 °C.
- Langsom frysing av eggstokkvevet5
- Plasser kryoviene som inneholder eggstokkvev i en programmerbar fryser som starter ved 0 °C.
- Avkjøl med en hastighet på 2 °C/min til -7 °C.
- Oppretthold kryovialene ved denne temperaturen i 10 minutter.
- Nukleat iskrystalldannelse ved å berøre hver kryovial med en bomullsspiss som har blitt kort nedsenket i flytende nitrogen (LN2).
- Avkjøl med en hastighet på 0,3 °C/min til prøvetemperaturen når -40 °C.
- Øk kjølehastigheten til 10 °C/min til prøvetemperaturen når -140 °C.
- Overfør kryovialene for lagring i LN2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi isolerte follikler fra overflaten av eggstokken og behandlet dem enzymatisk for å isolere GC-ene samt theca- og stromacellene som omgir antralhulen. Cellene ble samlet inn, og cellefraksjonene ble sortert fra antralfolliklene (diametere mellom 0,5 mm og 4 mm) med FACS til >95 % renhet (figur 1).
For å merke og rense unike cellulære fraksjoner i de humane antralfolliklene, kombinerte vi enzymatisk fordøyelse med flowcytometrisk sortering. Vi har tidligere identifisert overflateproteiner som spesifikt markerer follikkelboende fraksjoner2. Vi har vist at CD99 (rød i figur 1A) spesifikt merker GC, og PVRL1 (gul i figur 1A) er i økende grad lokalisert til det oophorøse GC-rommet ettersom antralfolliklene øker i størrelse2. Vi har også vist at antistoffer mot endoglin (ENG, grønn i figur 1A) eller CD55 (figur 1D) spesifikt avgrenser alle stroma og TC, og at alaninaminopeptidase (ANPEP, figur 1E) uttrykkes spesifikt ved androgene TCs 2,6.
Cellene ble merket med et antistoff rettet mot CD99 for å identifisere GC, og antistoffer mot CD45 ble brukt for å utelukke hematopoietiske celler (figur 1B,C). Antistoffer mot PVRL1 muliggjorde separasjon av GC-populasjonen i oophorøse og veggmaleriske rom (figur 1C). Etter enzymatisk fordøyelse med kollagenase/dispase gjorde cellepreparatene merket med antistoffer mot CD55 (alternativt ENG), CD34 og ANPEP det mulig å fange opp alle stroma/TCs (CD55+) og/eller androgene TCs (ANPEP+), med utelukkelse av endotelceller (CD34+) fra TC-populasjonene (figur 1D,E). Ved hjelp av dette panelet og en trinnvis enzymatisk dissosiasjonsprotokoll, merket og renset vi hematopoietiske, endoteliske, granulosa (oophorous og veggmaleri) og theca (stromale og androgene) celler fra antralfolliklene av nyresekterte eggstokkene.
Figur 1: Merking og rensing av avstamningsspesifikke celler fra humane antralfollikler. (A) Representativ mikrografi som viser GC (CD99+ PVRL+/-) og TC (ENG+) avdelinger i humane follikler på antralstadiet; Hvite strekbokser er forstørret til høyre. (VG Nett) Representative sorteringsplott som identifiserer GC-er som CD45-, CD99+-, PVRL1+/-celler (a og b) samt generiske (CD34-CD55+) og androgene (CD34-CD55+, ANPEP+) TC-er (C,D). Inngjerdede populasjoner deles mellom (B,C) og (D,E); Ufargede kontroller vises til venstre i (B-E). Skala bar = (A) 100 μm. Forkortelser: GC = granulosa celle; TC = theca celle; PVRL = nektin; ANPEP = alaninaminopeptidase; Nuc = kjerner; SSC = side spredning; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Celletype | Inkludering antistoffer | Eksklusjon antistoffer |
| Granulosa celler | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| Alle Theca celler | CD55 eller ENG | CD34 og CD45 |
| Steroidogene Theca celler | ANPEP | CD34 og CD45 |
Tabell 1: Liste over antistoffer som kan brukes til å identifisere GC, TC og ovariestroma. Forkortelser: GC = granulosa celle; TC = theca celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedre oppløsning av det cellulære mangfoldet i eggstokkfolliklene er klinisk viktig av flere grunner. Ved anvendelse av ovennevnte protokoll på isolering av de unike fenotypiske subtypene som ligger i antralstadiefollikler, bør flere faktorer vurderes. For det første er helsen og levedyktigheten til eggstokkvevet hvorfra antralfollikkelen er avledet, avgjørende for å bestemme kvaliteten på cellene og suksessen til nedstrøms applikasjoner. Dette kan optimaliseres ved å minimere det iskemiske intervallet, arbeide raskt (helst parvis) og forberede laboratorierommene som skal brukes til vevsbehandling og FACS. For det andre er disse protokollene godt egnet til antralstadifollikler nettopp fordi de lett kan identifiseres og ekstraheres fra eggstokken for effektivt å få tilgang til antralhulen; En lignende tilnærming for studier av tidlig stadium og pre-antrale follikler ville gi en cellepopulasjon med mye større heterogenitet. Endelig vil antallet og kvaliteten på celler oppnådd fra folliklene variere mye avhengig av hvor utviklingsmessig avansert en follikkel er og hvorvidt follikkelen har gått inn i en tilstand av atresi. Selv om disse begrensningene gjør studiet av rekonstruksjon av follikulogenese til en utfordring, vil effektiv og robust isolering av follikkelavledede celler muliggjøre ytterligere undersøkelse av mekanismene som ligger til grunn for human ovariebiologi og infertilitet.
Rensingen av GC fra antralfolliklene har tidligere blitt brukt av vår gruppe for å demonstrere den skadelige innflytelsen av superfysiologiske nivåer av anti-Mullerian hormon (AMH) på follikelutvikling6. I den studien ble kryopreservert og tint eggstokkvev fra både fertilitetsbevarende pasienter og organdonorer transplantert til immunkompromitterte mus i forskjellige eksperimentelle armer: kontroll eller AMH-uttrykkende endotelceller. Kronisk eksponering for AMH førte til en fenotype av akselerert luteinisering som ble reflektert i økt follikkelstørrelse, men dette ble bare tydelig belyst i den molekylære signaturen til follikkelbosatte GC.
Når oocytten går ut av dvalen, får GCer en kuboidal morfologi7, begynner å spre seg, og sammen med oocytten utskiller signaler som rekrutterer de omkringliggende stromaceller og fremmer deres differensiering mot en TC-skjebne8. Selv om riktig differensiering av stromaceller i spesialiserte TCs er kjent for å være avgjørende for fruktbarhet, er mekanismene som driver TC-spesifikasjon og styrer deres interaksjon med follikel-residente celler under oocytmodning ikke veldefinerte. Hos mennesker forblir den cellulære heterogeniteten som eksisterer i TCene som omgir follikkelen spesielt unnvikende fordi, i motsetning til GC, som er lett tilgjengelige i en IVF-setting, krever isolasjonen og kulturen av TCs en direkte biopsi av preovulatoriske follikler. I tillegg har de fleste studier stått på mekanisk dissosiasjon av thecalaget fra isolerte antralfollikler 9,10, noe som gir en heterogen blanding av stromale, theca, vaskulære og immunpopulasjoner.
Enkeltcellede multi-omics-tilnærminger har avslørt den cellulære heterogeniteten til mange vev, og de forskjellige celletyper som fremmer oocytutvikling i eggstokken, finnes i follikler over et bredt spekter av størrelser og modningsstadier. Metodene beskrevet ovenfor utfyller eksisterende protokoller for isolering og frysing av eggstokkvev med henblikk på fertilitetsbevaring og kan implementeres parallelt for anskaffelse av follikkel-residente celler til kliniske eller eksperimentelle formål. Anvendelsen av disse metodene vil være viktig for å dechiffrere de molekylære mekanismene som styrer human follikulogenese og er en kritisk forutsetning for tilnærminger som tar sikte på å fremme oocyttutvikling/modning fra primordiale follikler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner støtte fra Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (DJ) og Hung-Ching Liu Research Scholar Award (LM). N.L.G støttes av NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine postdoctoral training grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
