Summary
在这里，我们提出了从窦卵泡中鉴定和纯化卵巢细胞的方案。我们详细说明了处理整个卵巢以冷冻保存皮质条的方法，同时还收获完整的窦卵泡，这些卵泡经过酶处理以释放多种卵泡常驻细胞类型，包括颗粒细胞、膜细胞、内皮细胞、造血细胞和基质细胞。
Abstract
卵母细胞的活化、生长、发育和成熟是一个复杂的过程，不仅在卵巢的多种细胞类型之间协调，而且在下丘脑/垂体/卵巢回路内的多个控制点之间协调。在卵巢内，多种特化的细胞类型与卵巢卵泡内的卵母细胞密切相关。这些细胞的生物学在后期阶段得到了很好的描述，当它们很容易作为辅助生殖治疗的副产品回收时。然而，由于人类卵巢组织的稀缺和接受辅助生殖治疗的患者对卵巢的访问有限，对直接从卵巢分离的小窦卵泡的深入分析并不常见。
这些用于处理整个卵巢以冷冻保存皮质条的方法，同时鉴定/分离卵巢驻留细胞，能够对窦卵泡发育的早期阶段进行高分辨率分析。我们展示了通过酶促处理窦卵泡并分离颗粒、膜细胞、内皮细胞、造血细胞和基质细胞来分离离散细胞类型的方案。从各种大小和发育阶段的窦卵泡中分离细胞，可以全面分析驱动卵泡生长和卵巢生理学的细胞和分子机制，并提供可以在 体外 培养的活细胞来源，以概括卵泡微环境。
Introduction
人类卵巢的主要功能元素是卵泡，卵泡控制着卵母细胞的生长和发育。在体外受精的背景下，已经建立了分离滤泡细胞的方案，但这些方案仅适用于在卵母细胞提取时从黄 体 化卵泡中收集细胞1。我们开发了一种方案，可以在天然卵巢或异种移植卵巢组织产生的不同发育阶段从窦卵泡中分离离散细胞群2。尽管人们一致认为卵泡驻留细胞对卵母细胞培养的贡献非常重要，但很少有研究前瞻性地鉴定和提取窦期卵泡中存在的独特表型亚型。更深入地了解不同发育阶段特化细胞之间的分化层次结构和信号转导可以拓宽我们对稳态和病理条件下卵巢生理学的理解。此外，对离散细胞亚型的区分及其对卵泡生长/成熟的分子贡献可能提供一种产生离 体 替代物的方法，这些替代物重建卵巢功能以促进卵母细胞成熟和/或治疗内分泌功能障碍。
卵巢内的每种独特细胞类型都有助于卵泡的复杂功能，卵泡有效地充当离散的微型器官，以促进其所含卵母细胞的生长和成熟。卵母细胞是卵泡的核心，直接被连续的颗粒细胞（GC）层包裹，膜细胞（TC）形成第二层细胞，与卵母细胞和GC结合以构成卵泡单位。虽然分为两组，但GC和TC包含许多亚型。GC根据其在卵泡中的位置进行分类;围绕卵母细胞的GC和邻近基底膜的GC分别被指定为卵泡和壁壁GC，这些亚型显示出独特的转录组特征。TC 具有许多亚型，可提供类固醇生成、代谢和结构支持。内皮细胞、血管周围细胞和免疫细胞在维持正常的卵巢生理学中起着核心作用。卵巢基质不仅可以作为卵泡生长的基质，还可以提供产生TC的祖细胞的来源。卵巢内这种多层细胞亚型复合体使其既是内分泌器官又是生殖器官的功能。
本文提出了一种鉴定和纯化窦卵泡中颗粒细胞、膜细胞、基质细胞、内皮细胞和造血细胞的方案。我们利用该协议分离这些卵巢细胞并使用单细胞测序对其进行分析，然后在不同发育阶段的卵泡中进行特异性染色。该协议提供了一种可复制的简单方法，并且能够对卵巢的生理和病理进行高分辨率分析。
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Protocol
所有涉及小鼠的程序均由威尔康奈尔医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有使用卵巢组织的异种移植实验均按照相关指南和规定进行。两个卵巢都是从一名14岁的脑死亡器官捐献者中分离出来的，该捐献者没有放疗/化疗史，也没有内分泌或生殖疾病记录。威尔康奈尔医学院的机构审查委员会（IRB）委员会批准了组织的采集，并在知情同意使用组织后获得了器官捐献者家属的批准。
1. 卵巢组织的采集和处理
- 收集整个卵巢和相关组织，并在无菌盐水溶液中冲洗。
- 使用无菌镊子，将卵巢放入无菌容器中。将无菌、缓冲、冷的溶液（例如，莱博维茨的 L-15 培养基）倒入容器中。确保组织完全被液体覆盖。
- 关闭容器并使用无菌塑料袋将其装袋。将容器放在隔离箱内的冰上运输（例如，聚苯乙烯泡沫塑料）。将标本转移到实验室，该实验室将尽快处理卵巢，最好在不超过5小时3，4的时间内。
2. 卵巢组织处理
注意：确保在组织到达实验室之前准备好所有试剂和工具，以尽可能减少缺血间隔。缓冲液可以在冷冻前1周制备，并在使用前冷藏。
- 卵巢处理和冷冻的准备
- 在生物安全柜中设置灭菌的手术工具，以准备组织处理：一把21号手术刀;一把11号手术刀;锋利的细弧剪刀;一个长镊子（~150毫米长）;和两个中等大小的镊子（~110毫米长）。
- 制备100mL组织处理培养基（参见 材料表）：含有抗生素 - 抗真菌溶液的Leibovitz的L-15培养基，并使用0.2μm过滤器过滤。保持培养基冷却。
- 标记冷冻管，向每个小瓶中加入1.5mL冷冻溶液（参见 材料表），并将其储存在4°C。
- 手头有一个 6 孔板可供使用。
- 组织到达后
- 用70%乙醇溶液喷洒容器，彻底擦拭，然后将其放入生物安全柜内。
- 戴上无菌手套，打开容器。将卵巢放入无菌培养皿中，倒入冷却培养基（从步骤2.1.2开始）以水合组织。确保卵巢半浸没在培养基中。
- 移除任何缝合线或其他材料，并从卵巢上解剖残留的周围组织。
3.窦卵泡的分离
- 确定单个卵泡进行分离。在选择健康的卵泡时，排除任何充满血液、深色或不对称的卵泡，因为这些卵泡可能是闭锁的。
- 使用手术刀从整个卵巢中分离选定的窦卵泡，通过切除包围卵泡的皮质组织来保持胃窦完整。
- 将每个切除的完整窦卵泡放入 6 孔板的一个孔中。如果需要用于描述目的，请使用放置在培养皿下方的尺子来确定卵泡直径。
- 使用手术刀将完整的窦卵泡一分为二以进入窦腔，并加入 4 mL 酶细胞分离培养基。将板在5%CO2 和37°C的加湿培养箱中孵育10分钟。
- 根据需要重复提取额外的窦卵泡。
4. 卵泡驻留细胞的分离
- 孵育后，加入 4 mL 含有 20% FBS 的可用培养基，并用 P1，000 微量移液器将培养基重复剧烈移液到平分卵泡上冲洗。
- 收集培养基，并将其通过100μm过滤器。
- 将过滤后的上清液在300× g 和4°C下离心3分钟。吸出上清液，并将细胞沉淀（富含GCs）保留在冰上以进行标记和荧光激活细胞分选（FACS）。
- 将剩余的组织置于在平衡盐溶液（例如Hanks）中稀释的胶原酶（100U / mL）和分散酶（1U / mL）的混合物中，并在5%CO2 和37°C下孵育30分钟，在10分钟和20分钟后两次通过研磨和剧烈移液（即，10-15次通过移液管尖端）机械地破坏组织。
- 回收含有组织的培养基， 通过 P1，000 微量移液器吸头移液冲洗，并通过 100 μm 过滤器过滤。
- 在300× g 和4°C下离心3分钟。吸出上清液，并将细胞沉淀（富含TC和基质细胞）放在冰上进行标记和FACS。
5. 荧光激活细胞分选
- 将细胞沉淀重悬于封闭溶液（PBS + 0.1%FBS）中，并在4°C下孵育10分钟。
- 在300× g 和4°C下离心3分钟，并吸出上清液。
- 将细胞沉淀重悬于含有直接偶联抗体的封闭溶液中（参见 表1 了解用于鉴定GC和TC的适当抗体组合），并在冰上孵育10分钟。
- 洗涤并在300× g 和4°C下离心细胞3分钟。将细胞重悬于含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的FACS缓冲液中，并通过FACS仪器运行细胞悬液，以使用荧光团偶联抗体的荧光强度捕获少量细胞群（500-1，000）。
- 要识别独特的亚群，请利用以下门控策略：
- 对于GC的纯化，在CD45 +细胞周围绘制一个门（图1B），并将该群体从CD99 +群体中排除（图1A和图1C）;然后，进一步将剩余的CD99 +级分细分为PVRL + / -级分（图1A和图1C）。
- 对于TC和基质的纯化，门禁总ENG +（图1A）或CD55 +（图1D）群体以排除CD34 +内皮部分（图1E）并区分类固醇（ANPEP +）和非类固醇（ANPEP-）细胞。小心补偿发射光谱中接近的荧光团之间的渗漏。
- 为了验证分选细胞级分的纯度，请通过FACS仪器运行总捕获体积的5%，并确保细胞填充预期的门并以>95%的纯度存在。
6. 卵巢皮质组织的处理
- 将卵巢的其余部分一分为二，并使用弯曲的细剪刀和手术刀切除髓质，小心避免损坏卵巢皮层。
- 通过轻轻刮擦继续处理和变薄卵巢皮层，直到保留最少的髓质。确保使用所需的最小力。
注意：皮质组织厚度应在1毫米至1.5毫米之间。 - 沿卵巢长度将皮质组织分成2-3毫米宽的条带。
7.卵巢组织缓慢冷冻
- 冷冻准备
- 将一个皮质条放入每个含有冷冻溶液的冷冻低温小瓶中。
- 在4°C下在旋转板上摇动含有皮质条的低温小瓶20分钟。
- 卵巢组织缓慢冷冻5
- 将含有卵巢组织的冷冻管放入设置为从0°C开始的可编程冰箱中。
- 以2°C/min的速度冷却至-7°C。
- 将冷冻管在此温度下保持10分钟。
- 通过用短暂浸入液氮（LN2）的棉尖接触每个冷冻管来形成冰晶。
- 以0.3°C/min的速度冷却，直到样品温度达到-40°C。
- 将冷却速率增加到10°C / min，直到样品温度达到-140°C。
- 转移冷冻管以储存在LN2中。
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Representative Results
我们从卵巢表面分离卵泡并对其进行酶处理，以分离GC以及窦腔周围的膜和基质细胞。收集细胞，并通过FACS将细胞组分从窦卵泡（直径范围在0.5mm至4mm之间）分选至>95%纯度（图1）。
为了标记和纯化人窦卵泡内独特的细胞组分，我们将酶消化与流式细胞术分选相结合。我们之前发现了特异性标记卵泡驻留部分的表面蛋白2。我们已经表明，CD99（图1A中的红色）特异性标记GC，并且随着窦卵泡大小为2的增加，PVRL1（图1A中的黄色）越来越多地局限于卵泡GC室。我们还表明，针对内分泌蛋白（ENG，图1A中的绿色）或CD55（图1D）的抗体特异性地划分了所有基质和TC，并且丙氨酸氨基肽酶（ANPEP，图1E）由雄激素TCs2，6特异性表达。
用针对CD99的抗体标记细胞以鉴定GC，并使用针对CD45的抗体来排除造血细胞（图1B，C）。针对PVRL1的抗体能够将GC群体分离成卵泡和壁室（图1C）。用胶原酶/分散酶酶消化后，用CD55（或替代ENG），CD34和ANPEP抗体标记的细胞制剂能够捕获所有基质/ TC（CD55 +）和/或雄激素TC（ANPEP +），从TC群体中排除内皮细胞（CD34 +）（图1D，E).使用该面板和逐步酶解离方案，我们标记并纯化了来自新鲜切除卵巢的窦卵泡的造血细胞、内皮细胞、颗粒细胞（卵泡和壁画）和膜细胞（基质和雄激素）细胞。
图1：来自人窦卵泡的谱系特异性细胞的标记和纯化。 （A）代表性显微照片显示窦期人卵泡内的GC（CD99 + PVRL + / -）和TC（ENG +）区室;白色描边框向右放大。（乙-E）代表性分选图，将GC识别为CD45- CD99 + PVRL1 + / - 细胞（a和b）以及通用（CD34- CD55+）和雄激素（CD34- CD55 + ANPEP +）TC（C，D）。（B，C）和（D，E）之间共享门控种群;未染色的对照显示在（B-E）的左侧。比例尺 = （A） 100 μm。缩写：GC = 颗粒细胞;TC = 膜细胞;PVRL = 凝集素;ANPEP = 丙氨酸氨基肽酶;Nuc = 原子核;SSC = 侧散射;PE = 藻红蛋白;APC = 别藻蓝蛋白。请点击此处查看此图的大图。
| 细胞类型 | 包涵体抗体 | 排除抗体 |
| 颗粒细胞 | CD99 （PVRL+/-） | CD45 |
| 所有膜细胞 | CD55 或 ENG | CD34 和 CD45 |
| 类固醇卵管细胞 | 安佩普 | CD34 和 CD45 |
表 1：可用于识别 GC、TC 和卵巢基质的抗体列表。 缩写：GC = 颗粒细胞;TC = 膜细胞。
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Discussion
由于几个原因，更好地解析卵巢卵泡内的细胞多样性在临床上很重要。在将上述方案应用于分离位于窦期卵泡内的独特表型亚型时，应考虑几个因素。首先，来源于窦卵泡的卵巢组织的健康和活力对于确定细胞的质量和下游应用的成功至关重要。这可以通过最小化缺血间隔、快速工作（最好成对）以及准备将用于组织处理和 FACS 的实验室空间来优化。其次，这些方案非常适合窦期卵泡，因为它们可以很容易地从卵巢中识别和提取，以有效地进入窦腔;研究早期和前窦卵泡的类似方法将产生具有更大异质性的细胞群。最后，从卵泡获得的细胞的数量和质量将有很大差异，具体取决于卵泡的发育进展程度以及卵泡是否进入闭锁状态。虽然这些局限性使卵泡发生重建的研究成为一项挑战，但卵泡来源细胞的高效和稳健分离将能够进一步探究人类卵巢生物学和不孕症的机制。
我们小组以前曾利用从窦卵泡中纯化GC来证明抗苗勒管激素（AMH）的超生理水平对卵泡发育的有害影响6。在这项研究中，将来自保留生育能力的患者和器官捐献者的冷冻保存和解冻的卵巢组织移植到不同实验组中的免疫功能低下的小鼠中：对照组或表达AMH的内皮细胞。长期暴露于AMH促使黄体生成加速的表型，这反映在卵泡大小增加上，但这仅在卵泡驻留GC的分子特征中得到明确阐明。
当卵母细胞退出休眠状态时，GC获得立方体形态7，开始增殖，并与卵母细胞一起分泌信号，招募周围的基质细胞并促进它们向TC命运分化8。尽管已知基质细胞适当分化为专门的TC对于生育能力至关重要，但在卵母细胞成熟期间驱动TC规格并控制它们与卵泡驻留细胞相互作用的机制尚不清楚。在人类中，存在于卵泡周围TC中的细胞异质性仍然特别难以捉摸，因为与在IVF环境中容易获得的GC不同，TC的分离和培养需要对排卵前卵泡进行直接活检。此外，大多数研究依赖于从分离的窦卵泡中机械解离膜层9，10，产生基质，膜，血管和免疫群体的异质混合物。
单细胞多组学方法揭示了许多组织的细胞异质性，以及促进卵巢内卵母细胞发育的多种细胞类型存在于各种大小和成熟阶段的卵泡内。上述方法补充了现有的用于分离和冷冻卵巢组织以保存生育能力的方案，并且可以并行实施以用于临床或实验目的的卵泡驻留细胞的获取。这些方法的应用对于破译控制人类卵泡生成的分子机制非常重要，并且是旨在促进体 外原始卵泡卵母细胞发育/成熟的方法的关键先决条件。
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Disclosures
所有作者都声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
作者感谢Queenie Victorina Neri研究学者奖（D.J.）和刘洪清研究学者奖（L.M.）的支持。N.L.G得到了NYSTEM干细胞和再生医学博士后培训基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
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