Summary
Här presenterar vi protokoll för identifiering och rening av äggstocksceller från antrala folliklar. Vi utarbetar metoder för bearbetning av hela äggstockar för kryokonservering av kortikala remsor samtidigt som vi skördar intakta antrala folliklar som behandlas enzymatiskt för att frigöra flera follikelbosatta celltyper, inklusive granulosa, theca, endotelial, hematopoietisk och stromaceller.
Abstract
Aktivering, tillväxt, utveckling och mognad av oocyter är en komplex process som samordnas inte bara mellan flera celltyper av äggstocken utan också över flera kontrollpunkter inom hypotalamus/hypofysen/äggstockskretsen. Inom äggstocken växer flera specialiserade celltyper i nära anslutning till äggcellen i äggstocksfolliklarna. Biologin hos dessa celler har beskrivits väl i senare skeden, när de lätt återvinns som biprodukter av assisterad reproduktiv behandling. Den fördjupade analysen av små antrala folliklar isolerade direkt från äggstocken utförs emellertid inte vanligtvis på grund av bristen på human äggstocksvävnad och den begränsade tillgången till äggstocken hos patienter som genomgår assisterad reproduktiv behandling.
Dessa metoder för bearbetning av hela äggstockar för kryokonservering av kortikala remsor med samtidig identifiering / isolering av äggstocksbosatta celler möjliggör högupplöst analys av de tidiga stadierna av antralfollikelutveckling. Vi demonstrerar protokoll för att isolera diskreta celltyper genom att behandla antrala folliklar enzymatiskt och separera granulosa-, theca-, endotel-, hematopoietiska och stromaceller. Isoleringen av celler från antrala folliklar i olika storlekar och utvecklingsstadier möjliggör en omfattande analys av de cellulära och molekylära mekanismer som driver follikeltillväxt och äggstocksfysiologi och ger en källa till livskraftiga celler som kan odlas in vitro för att rekapitulera follikelmikromiljön.
Introduction
De primära funktionella elementen i den mänskliga äggstocken är folliklarna, som styr tillväxten och utvecklingen av oocyter. Protokoll för isolering av follikulära celler har varit väl etablerade i samband med in vitro-fertilisering , men dessa är endast lämpliga för insamling av celler från luteiniserade folliklar vid tidpunkten för ägguttag1. Vi har utvecklat ett protokoll som möjliggör isolering av diskreta cellpopulationer från antrala folliklar i olika utvecklingsstadier som uppstår från inhemska äggstockar eller xenotransplanterad äggstocksvävnad2. Även om det finns enighet om att bidragen från follikelbosatta celler till odlingen av äggcellen är mycket viktiga, har få studier prospektivt identifierat och extraherat de unika fenotypiska subtyperna som finns i folliklar i antralstadiet. En djupare förståelse av differentieringshierarkin och signaltransduktionen mellan specialiserade celler under de olika utvecklingsstadierna kan bredda vår förståelse av äggstocksfysiologi under homeostatiska och patologiska förhållanden. Dessutom kan diskriminering av diskreta cellulära subtyper och deras molekylära bidrag till follikeltillväxt/mognad tillhandahålla ett sätt att generera ex vivo-surrogat som rekonstruerar äggstocksfunktionen för att främja äggstocksmognad och/eller behandla endokrin dysfunktion.
Varje unik celltyp inom äggstocken bidrar till follikelns komplexa funktion, som effektivt fungerar som ett diskret miniorgan för att främja tillväxten och mognaden av äggcellen den innehåller. Oocyten, follikelns mittpunkt, är direkt omsluten av ett kontinuerligt skikt av granulosaceller (GC), med theca-cellerna (TC) som bildar ett sekundärt lager av celler som kombinerar med oocyten och GC för att komponera follikelenheten. Även om de klassificeras i två grupper innehåller GC och TC många undertyper. GC klassificeras enligt deras position i follikeln; GC som omger äggcellen kontra de som ligger intill basalmembranet betecknas som oophorous respektive mural GC, och dessa subtyper visar unika transkriptomiska signaturer. TC har många subtyper som fungerar för att ge steroidogent, metaboliskt och strukturellt stöd. Endotel-, perivaskulära och immunceller spelar en central roll för att upprätthålla normal äggstocksfysiologi. Äggstocksstroma fungerar inte bara som ett substrat för follikeltillväxt utan ger sannolikt också en källa till förfäder som ger upphov till TC. Detta flerskiktade komplex av cellulära subtyper inom äggstocken är det som möjliggör dess funktion som både ett endokrint och ett reproduktionsorgan.
Detta dokument presenterar ett protokoll för identifiering och rening av granulosa-, theca-, stromal-, endotelial- och hematopoetiska celler från antrala folliklar. Vi har använt detta protokoll för att isolera dessa äggstocksceller och analysera dem med hjälp av encellssekvensering, följt av specifik färgning i folliklar i olika utvecklingsstadier. Protokollet ger en enkel metod som är replikerbar och möjliggör högupplöst analys av både äggstockens fysiologi och patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som involverar möss godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Weill Cornell Medicine. Alla xenotransplantationsexperiment med äggstocksvävnad utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. Båda äggstockarna isolerades från en 14-årig hjärndöd organdonator utan historia av radio/kemoterapi och ingen dokumenterad historia av endokrina eller reproduktiva tillstånd. Den institutionella granskningsnämnden (IRB) Committee of Weill Cornell Medicine godkände insamlingen av vävnad, och godkännande från organdonatorns familj erhölls efter informerat samtycke angående användning av vävnad.
1. Insamling och hantering av äggstocksvävnad
- Samla upp hela äggstockarna och tillhörande vävnad och skölj i steril saltlösning.
- Använd steril pincett och placera äggstockarna i en steril behållare. Häll steril, buffrad, kall lösning (t.ex. Leibovitz L-15-medium) i behållaren. Se till att vävnaden är helt täckt med vätskan.
- Stäng behållaren och dubbelpåse den med sterila plastpåsar. Transportera behållaren på is i en isolerad låda (t.ex. frigolit). Överför proverna till laboratoriet som kommer att bearbeta äggstockarna så snart som möjligt, helst inom en tid som inte överstiger 5 h 3,4.
2. Bearbetning av äggstocksvävnaden
OBS: Se till att alla reagens och verktyg är förberedda innan vävnaden anländer till laboratoriet för att minska det ischemiska intervallet så mycket som möjligt. Buffertarna kan beredas upp till 1 vecka före frysning och kylas till användning.
- Förberedelser för bearbetning och frysning av äggstockarna
- Ställ steriliserade kirurgiska verktyg i biosäkerhetsskåpet som förberedelse för vävnadsbehandling: ett nummer 21 skalpell; ett nummer 11 skalpell; skarpa fina böjda saxar; en lång pincett (~ 150 mm längd); och två medelstora pincett (~ 110 mm längd).
- Bered 100 ml vävnadsbearbetningsmedium (se materialtabellen): Leibovitz L-15-medium innehållande antibiotika-antimykotisk lösning och filtreras med ett 0,2 μm-filter. Håll mediet kylt.
- Märk kryovialerna, tillsätt 1,5 ml fryslösning (se materialtabellen) till varje injektionsflaska och förvara den vid 4 °C.
- Ha en 6-brunnsplatta till hands för användning.
- Vid ankomsten av vävnaden
- Spraya behållaren med 70% etanollösning, torka noggrant och placera den i biosäkerhetsskåpet.
- Använd sterila handskar, öppna behållaren. Lägg äggstocken i en steril petriskål och häll kylt medium (från steg 2.1.2) för att hydrera vävnaden. Se till att äggstocken är halvt nedsänkt i mediet.
- Ta bort suturer eller annat material och dissekera kvarvarande omgivande vävnad bort från äggstocken.
3. Isolering av antrala folliklar
- Identifiera enskilda folliklar för isolering. När du väljer friska folliklar, uteslut blodfyllda, mörka eller icke-symmetriska folliklar, eftersom de sannolikt kommer att vara atretic.
- Isolera de valda antrala folliklarna från hela äggstocken med skalpeller, håll antrummet intakt genom att excisera den kortikala vävnaden som omfattar follikeln.
- Placera varje utskuren intakt antralfollikel i en brunn på 6-brunnsplattan. Om det behövs för beskrivande ändamål, använd en linjal placerad under skålen för att bestämma follikeldiametern.
- Använd en skalpell, skär den intakta antrala follikeln för att få tillgång till antralhålan och tillsätt 4 ml enzymatiskt cellavskiljningsmedium. Inkubera plattan i en fuktad inkubator vid 5 %CO2 och 37 °C i 10 minuter.
- Upprepa extraktionen av ytterligare antrala folliklar efter behov.
4. Isolering av follikelbosatta celler
- Efter inkubation, tillsätt 4 ml tillgängligt medium innehållande 20% FBS och spola genom upprepad, kraftig pipettering av mediet över de halverade folliklarna med en P1,000-mikropipett.
- Samla upp mediet och passera det genom ett 100 μm filter.
- Centrifugera den filtrerade supernatanten vid 300 × g och 4 °C i 3 minuter. Aspirera supernatanten och reservera cellpelleten (berikad med GC) på is för märkning och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
- Placera den återstående vävnaden i en blandning av kollagenas (100 E/ml) och dispas (1 E/ml) utspädd i en balanserad saltlösning (t.ex. Hanks) och inkubera i 30 minuter vid 5 % CO2 och 37 °C, vilket mekaniskt stör vävnaden genom triturering och kraftig pipettering (dvs. 10-15 passerar genom pipettspetsen) två gånger efter 10 minuter och 20 minuter.
- Återvinn media som innehåller vävnaden, spola via pipettering genom en P1 000 mikropipettspets och sila genom ett 100 μm filter.
- Centrifugera vid 300 × g och 4 °C i 3 minuter. Aspirera supernatanten och lägg undan cellpelleten (berikad med TC och stromaceller) på is för märkning och FACS.
5. Fluorescensaktiverad cellsortering
- Återsuspendera cellpelletsen i blockerande lösning (PBS + 0,1 % FBS) och inkubera i 10 minuter vid 4 °C.
- Centrifugera vid 300 × g och 4 °C i 3 minuter och aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellpellets i blockerande lösning innehållande direkt konjugerade antikroppar (se tabell 1 för lämpliga antikroppskombinationer för att identifiera GC och TC) och inkubera på is i 10 minuter.
- Tvätta och centrifugera cellerna vid 300 × g och 4 °C i 3 minuter. Resuspendera cellerna i FACS-buffert innehållande 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och kör cellsuspensionen genom ett FACS-instrument för att fånga en liten population av cellerna (500-1,000) med hjälp av fluorescensintensiteten hos fluoroforkonjugerade antikroppar för grindning.
- För identifiering av unika delpopulationer, använd följande grindstrategier:
- För rening av GC, rita en grind runt CD45 + -cellerna (figur 1B) och uteslut denna population från CD99 + -populationen (figur 1A och figur 1C); dela sedan upp den återstående CD99 + -fraktionen ytterligare i PVRL +/- fraktioner (figur 1A och figur 1C).
- För rening av TC och stroma, grinda den totala ENG + (figur 1A) eller CD55 + (figur 1D) populationen för att utesluta CD34 + endotelfraktionen (figur 1E) och skilja de steroidogena (ANPEP +) och icke-steroidogena (ANPEP-) cellerna. Var noga med att kompensera för genomblödning mellan fluoroforer som ligger nära emissionsspektra.
- För att validera renheten hos den sorterade cellfraktionen, kör 5% av den totala fångade volymen genom FACS-instrumentet och se till att cellerna fyller de förväntade grindarna och är närvarande med >95% renhet.
6. Bearbetning av äggstockskortikal vävnad
- Skär resten av äggstocken och skär medulla med böjda fina saxar och skalpeller, var försiktig för att undvika skador på äggstocksbarken.
- Fortsätt bearbeta och tunna äggstocksbarken genom försiktig skrapning tills minimal medulla kvarstår. Se till att använda den minsta kraft som behövs.
OBS: Den kortikala vävnadstjockleken bör vara mellan 1 mm och 1,5 mm. - Dela den kortikala vävnaden i 2-3 mm breda remsor längs äggstockens längd.
7. Långsam frysning av äggstocksvävnad
- Förberedelse för frysning
- Placera en kortikal remsa i varje kyld kryogen injektionsflaska som innehåller fryslösning.
- Skaka de kryogena injektionsflaskorna med kortikala remsor på en roterande platta i 20 minuter vid 4 °C.
- Långsam frysning av äggstocksvävnaden5
- Placera kryovialerna som innehåller äggstocksvävnad i en programmerbar frys som börjar vid 0 °C.
- Låt svalna med en hastighet av 2 °C/min tills −7 °C.
- Håll kryovialerna vid denna temperatur i 10 minuter.
- Kärnbildning av iskristall genom att röra vid varje kryovial med en bomullsspets som har nedsänkts kort i flytande kväve (LN2).
- Kyl med en hastighet av 0,3 ° C / min tills provtemperaturen når −40 ° C.
- Öka kylningshastigheten till 10 °C/min tills provtemperaturen når −140 °C.
- Överför kryovialerna för förvaring i LN2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi isolerade folliklar från ytan av äggstocken och behandlade dem enzymatiskt för att isolera GCs såväl som theca- och stromaceller som omger antralhålan. Cellerna samlades in och cellfraktionerna sorterades från antralfolliklarna (diametrar mellan 0,5 mm och 4 mm) med FACS till >95% renhet (figur 1).
För att märka och rena unika cellulära fraktioner inom de mänskliga antrala folliklarna kombinerade vi enzymatisk nedbrytning med flödescytometrisk sortering. Vi har tidigare identifierat ytproteiner som specifikt markerar follikelresidenta fraktioner2. Vi har visat att CD99 (röd i figur 1A) specifikt märker GC, och PVRL1 (gul i figur 1A) blir alltmer lokaliserad till det oofora GC-facket när antralfolliklarna ökar i storlek2. Vi har också visat att antikroppar mot endoglin (ENG, grönt i figur 1A) eller CD55 (figur 1D) specifikt avgränsar alla stroma och TC och att alaninaminopeptidas (ANPEP, figur 1E) uttrycks specifikt av androgena TC 2,6.
Cellerna märktes med en antikropp riktad mot CD99 för att identifiera GC, och antikroppar mot CD45 användes för att utesluta hematopoetiska celler (Figur 1B, C). Antikroppar mot PVRL1 möjliggjorde separation av GC-populationen i oofor- och väggfack (figur 1C). Efter enzymatisk nedbrytning med kollagenas / dispase möjliggjorde cellpreparaten märkta med antikroppar mot CD55 (eller alternativt ENG), CD34 och ANPEP infångning av alla stroma / TC (CD55 +) och / eller androgena TC (ANPEP +), med undantag av endotelceller (CD34 +) från TC-populationerna (figur 1D, E). Med hjälp av denna panel och ett stegvis enzymatiskt dissociationsprotokoll märkte och renade vi hematopoetiska, endoteliala, granulosa (oophorous och väggmålning) och theca (stromal och androgena) celler från antralfolliklarna hos nyligen resekterade äggstockar.
Figur 1: Märkning och rening av härstamningsspecifika celler från humana antrala folliklar. (A) Representativ mikrograf som visar GC (CD99 + PVRL+/-) och TC (ENG +) fack i humana folliklar vid antralstadiet; Vita linjeraster förstoras till höger. (B–E) Representativa sorteringsdiagram som identifierar GC som CD45- CD99 + PVRL1 +/- celler (a och b) samt generiska (CD34- CD55 +) och androgena (CD34- CD55 + ANPEP +) TC (C, D). Gated populationer delas mellan (B, C) och (D, E); Ofärgade kontroller visas till vänster i (B-E). Skalstapel = (A) 100 μm. Förkortningar: GC = granulosacell; TC = theca-cell; PVRL = nektin; ANPEP = alaninaminopeptidas; Nuc = kärnor; SSC = sidospridning; PE = fykoerytrin; APC = allofykocyanin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Typ av cell | Inklusionsantikroppar | Exklusions antikroppar |
| Granulosa celler | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| Alla Theca-celler | CD55 eller ENG | CD34 och CD45 |
| Steroidogena Theca-celler | ANPEP | CD34 och CD45 |
Tabell 1: Förteckning över antikroppar som kan användas för att identifiera GC, TC och äggstocksstroma. Förkortningar: GC = granulosacell; TC = theca-cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bättre upplösning av den cellulära mångfalden i äggstocksfolliklarna är kliniskt viktigt av flera skäl. Vid tillämpning av ovanstående protokoll på isoleringen av de unika fenotypiska subtyperna som finns inom folliklar i antralstadiet bör flera faktorer beaktas. För det första är hälsan och livskraften hos äggstocksvävnaden från vilken antralfollikeln härrör avgörande för att bestämma cellernas kvalitet och framgången för nedströmsapplikationer. Detta kan optimeras genom att minimera det ischemiska intervallet, arbeta snabbt (helst i par) och förbereda laboratorieutrymmena som ska användas för vävnadsbehandling och FACS. För det andra är dessa protokoll väl lämpade för folliklar i antralstadiet just för att de lätt kan identifieras och extraheras från äggstocken för att effektivt komma åt antralhålan; Ett liknande tillvägagångssätt för studier av tidiga och pre-antrala folliklar skulle ge en cellpopulation med mycket större heterogenitet. Slutligen kommer antalet och kvaliteten på celler som erhålls från folliklarna att variera mycket beroende på hur utvecklingsmässigt avancerad en follikel är och huruvida follikeln har gått in i ett tillstånd av atresi. Medan dessa begränsningar gör studien av rekonstruktionen av follikulogenes till en utmaning, kommer effektiv och robust isolering av follikelhärledda celler att möjliggöra ytterligare förhör av mekanismerna bakom mänsklig äggstocksbiologi och infertilitet.
Reningen av GC från antralfolliklarna har tidigare använts av vår grupp för att visa det skadliga inflytandet av superfysiologiska nivåer av anti-Mullerian hormon (AMH) på follikelutveckling6. I den studien transplanterades kryokonserverad och tinad äggstocksvävnad från både fertilitetsbevarande patienter och organdonatorer till immunsupprimerade möss i olika experimentella armar: kontroll- eller AMH-uttryckande endotelceller. Kronisk exponering för AMH föranledde en fenotyp av accelererad luteinisering som återspeglades i ökad follikelstorlek, men detta belystes endast tydligt i den molekylära signaturen av follikelbosatta GC.
När oocyten lämnar viloläge förvärvar GC: er en kuboidal morfologi7, börjar föröka sig och tillsammans med oocyten utsöndrar signaler som rekryterar de omgivande stromacellerna och främjar deras differentiering mot ett TC-öde8. Även om korrekt differentiering av stromaceller till specialiserade TC är känd för att vara avgörande för fertilitet, är mekanismerna som driver TC-specifikationen och styr deras interaktion med follikelbosatta celler under oocytmognad inte väldefinierade. Hos människor är den cellulära heterogeniteten som finns i TC: erna som omger follikeln fortfarande särskilt svårfångad eftersom, till skillnad från GC, som är lättillgängliga i en IVF-inställning, kräver isolering och odling av TC en direkt biopsi av preovulatoriska folliklar. Dessutom har de flesta studier förlitat sig på mekanisk dissociation av theca-skiktet från isolerade antrala folliklar 9,10, vilket ger en heterogen blandning av stromala-, theca-, vaskulära och immunpopulationer.
Single-cell multi-omics-metoder har avslöjat den cellulära heterogeniteten hos många vävnader och de olika celltyperna som främjar oocytutveckling inom äggstocken finns inom folliklar över ett brett spektrum av storlekar och mognadsstadier. De metoder som beskrivs ovan kompletterar befintliga protokoll för isolering och frysning av äggstocksvävnad i syfte att bevara fertiliteten och kan implementeras parallellt för tillvaratagande av follikelbosatta celler för kliniska eller experimentella ändamål. Tillämpningen av dessa metoder kommer att vara viktig för att dechiffrera de molekylära mekanismer som styr human follikulogenes och är en kritisk förutsättning för metoder som syftar till att främja oocytutveckling / mognad från primordiala folliklar in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna erkänner stöd från Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (DJ) och Hung-Ching Liu Research Scholar Award (LM). N.L.G stöds av NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine postdoktoralt utbildningsbidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
