Summary
Aquí, presentamos protocolos para la identificación y purificación de células ováricas de folículos antrales. Elaboramos métodos para procesar ovarios enteros para la criopreservación de tiras corticales mientras también cosechamos folículos antrales intactos que se tratan enzimáticamente para liberar múltiples tipos de células residentes del folículo, incluidas las células granulosa, teca, endotelial, hematopoyética y estromales.
Abstract
La activación, el crecimiento, el desarrollo y la maduración de los ovocitos es un proceso complejo que se coordina no solo entre múltiples tipos de células del ovario, sino también a través de múltiples puntos de control dentro del circuito hipotalámico / pituitario / ovárico. Dentro del ovario, múltiples tipos de células especializadas crecen en estrecha asociación con el ovocito dentro de los folículos ováricos. La biología de estas células ha sido bien descrita en etapas posteriores, cuando se recuperan fácilmente como subproductos de los tratamientos de reproducción asistida. Sin embargo, el análisis en profundidad de pequeños folículos antrales aislados directamente del ovario no se lleva a cabo comúnmente debido a la escasez de tejido ovárico humano y el acceso limitado al ovario en pacientes sometidas a tratamientos de reproducción asistida.
Estos métodos para procesar ovarios enteros para la criopreservación de tiras corticales con la identificación / aislamiento concurrente de células residentes del ovario permiten el análisis de alta resolución de las primeras etapas del desarrollo del folículo antral. Demostramos protocolos para aislar tipos de células discretas mediante el tratamiento enzimático de los folículos antrales y la separación de las células granulosa, teca, endotelial, hematopoyética y estromal. El aislamiento de células de los folículos antrales en varios tamaños y etapas de desarrollo permite el análisis exhaustivo de los mecanismos celulares y moleculares que impulsan el crecimiento del folículo y la fisiología ovárica y proporciona una fuente de células viables que pueden cultivarse in vitro para recapitular el microambiente del folículo.
Introduction
Los elementos funcionales primarios del ovario humano son los folículos, que gobiernan el crecimiento y desarrollo de los ovocitos. Los protocolos para el aislamiento de células foliculares han sido bien establecidos en el contexto de la fertilización in vitro , pero estos son apropiados solo para la recolección de células de folículos luteinizados en el punto de recuperación de ovocitos1. Hemos desarrollado un protocolo que permite el aislamiento de poblaciones de células discretas de folículos antrales en diferentes etapas de desarrollo que surgen de ovarios nativos o tejido ovárico xenotrasplantado2. Aunque existe consenso en que las contribuciones de las células residentes del folículo al cultivo del ovocito son muy importantes, pocos estudios han identificado y extraído prospectivamente los subtipos fenotípicos únicos presentes en los folículos en etapa antral. Una comprensión más profunda de la jerarquía de diferenciación y la transducción de señales entre células especializadas durante las diferentes etapas de desarrollo podría ampliar nuestra comprensión de la fisiología ovárica en condiciones homeostáticas y patológicas. Además, la discriminación de subtipos celulares discretos y sus contribuciones moleculares al crecimiento/maduración del folículo puede proporcionar un medio para generar sustitutos ex vivo que reconstruyan la función ovárica para fomentar la maduración de los ovocitos y/o tratar la disfunción endocrina.
Cada tipo de célula único dentro del ovario contribuye a la compleja función del folículo, que funciona eficazmente como un mini-órgano discreto para fomentar el crecimiento y la maduración del ovocito que contiene. El ovocito, la pieza central del folículo, está directamente envuelto por una capa continua de células de la granulosa (GC), con las células de la teca (TC) formando una capa secundaria de células que se combinan con el ovocito y los GC para componer la unidad folicular. Aunque se clasifican en dos grupos, los GC y los CT contienen numerosos subtipos. Los GC se clasifican según su posición dentro del folículo; Los GC que rodean el ovocito frente a los que están adyacentes a la membrana basal se designan como GC ooforosos y murales, respectivamente, y estos subtipos muestran firmas transcriptómicas únicas. Los CT tienen numerosos subtipos que funcionan para proporcionar soporte esteroidogénico, metabólico y estructural. Las células endoteliales, perivasculares e inmunes desempeñan un papel central en el mantenimiento de la fisiología ovárica normal. El estroma ovárico sirve no solo como sustrato para el crecimiento del folículo, sino que también proporciona una fuente de progenitores que dan lugar a CT. Este complejo multicapa de subtipos celulares dentro del ovario es lo que permite su función como órgano endocrino y reproductivo.
Este artículo presenta un protocolo para la identificación y purificación de células granulosa, teca, estromales, endoteliales y hematopoyéticas de folículos antrales. Hemos utilizado este protocolo para aislar estas células ováricas y analizarlas mediante secuenciación de células individuales, seguida de tinción específica en folículos de diferentes etapas de desarrollo. El protocolo proporciona una metodología sencilla que es replicable y permitirá el análisis de alta resolución tanto de la fisiología como de la patología del ovario.
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Protocol
Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Weill Cornell Medicine. Todos los experimentos de xenotrasplante con tejido ovárico se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Ambos ovarios se aislaron de un donante de órganos con muerte cerebral de 14 años sin antecedentes de radio/quimioterapia y sin antecedentes documentados de afecciones endocrinas o reproductivas. El Comité de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Weill Cornell Medicine aprobó la recolección de tejido, y la aprobación de la familia del donante de órganos se obtuvo después del consentimiento informado con respecto al uso del tejido.
1. Recolección y manipulación de tejido ovárico
- Recoja los ovarios enteros y el tejido asociado, y enjuague con solución salina estéril.
- Usando pinzas estériles, coloque los ovarios en un recipiente estéril. Vierta una solución estéril, tamponada y fría (por ejemplo, el medio L-15 de Leibovitz) en el recipiente. Asegúrese de que el tejido esté completamente cubierto con el líquido.
- Cierre el recipiente y doble embolsarlo con bolsas de plástico estériles. Transporte el contenedor en hielo dentro de una caja aislada (por ejemplo, espuma de poliestireno). Transfiera las muestras al laboratorio que procesará los ovarios lo antes posible, preferiblemente en un tiempo no superior a 5 h 3,4.
2. Procesamiento del tejido ovárico
NOTA: Asegúrese de que todos los reactivos y herramientas estén preparados antes de que el tejido llegue al laboratorio para reducir el intervalo isquémico tanto como sea posible. Los tampones se pueden preparar hasta 1 semana antes de la congelación y refrigerarse hasta su uso.
- Preparaciones para el procesamiento ovárico y la congelación.
- Coloque herramientas quirúrgicas esterilizadas en el gabinete de bioseguridad en preparación para el procesamiento de tejidos: un bisturí número 21; un bisturí número 11; tijeras curvas finas y afiladas; un fórceps largo (~150 mm de longitud); y dos pinzas medianas (~110 mm de longitud).
- Preparar 100 ml de medio de procesamiento de tejidos (ver la Tabla de materiales): medio L-15 de Leibovitz que contiene solución antibiótico-antimicótica y filtrado con un filtro de 0,2 μm. Mantenga el medio frío.
- Etiquete los crioviales, añada 1,5 ml de solución de congelación (consulte la Tabla de materiales) a cada vial y guárdela a 4 °C.
- Tenga disponible una placa de 6 pocillos a mano para su uso.
- A la llegada del tejido
- Rocíe el recipiente con una solución de etanol al 70%, limpie bien y colóquelo dentro del gabinete de bioseguridad.
- Con guantes estériles, abra el recipiente. Colocar el ovario en una placa de Petri estéril y verter el medio refrigerado (a partir del paso 2.1.2) para hidratar el tejido. Asegúrese de que el ovario esté medio sumergido en el medio.
- Retire cualquier sutura u otro material y disecte el tejido circundante residual lejos del ovario.
3. Aislamiento de folículos antrales
- Identificar folículos individuales para el aislamiento. Al elegir folículos sanos, excluya cualquier folículo lleno de sangre, oscuro o no simétrico, ya que es probable que sean atréticos.
- Aísle los folículos antrales elegidos de todo el ovario usando bisturís, manteniendo el antro intacto extirpando el tejido cortical que abarca el folículo.
- Coloque cada folículo antral intacto extirpado en un pocillo de la placa de 6 pocillos. Si es necesario para fines descriptivos, use una regla colocada debajo del plato para determinar el diámetro del folículo.
- Usando un bisturí, divida en dos el folículo antral intacto para obtener acceso a la cavidad antral y agregue 4 ml de medio de desprendimiento de células enzimáticas. Incubar la placa en una incubadora humidificada al 5% deCO2 y 37 °C durante 10 min.
- Repita la extracción de folículos antrales adicionales según sea necesario.
4. Aislamiento de células residentes del folículo
- Después de la incubación, agregue 4 ml de medio disponible que contenga 20% de FBS, y enjuague con un pipeteo repetido y vigoroso del medio sobre los folículos biseccionados con una micropipeta P1,000.
- Recoja el medio y páselo a través de un filtro de 100 μm.
- Centrifugar el sobrenadante filtrado a 300 × g y 4 °C durante 3 min. Aspire el sobrenadante y reserve el pellet celular (enriquecido con GC) en hielo para el etiquetado y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
- Colocar el tejido restante en una mezcla de colagenasa (100 U/ml) y dispasa (1 U/ml) diluida en una solución salina equilibrada (p. ej., Hanks), e incubar durante 30 min a 5% deCO2 y 37 °C, interrumpiendo mecánicamente el tejido mediante trituración y pipeteo vigoroso (es decir, 10-15 pasadas a través de la punta de la pipeta) dos veces después de 10 min y 20 min.
- Recupere los medios que contienen el tejido, enjuague mediante pipeteo a través de una punta de micropipeta P1,000 y filtre a través de un filtro de 100 μm.
- Centrifugar a 300 × g y 4 °C durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y dejar a un lado el pellet celular (enriquecido con TC y células del estroma) en hielo para el etiquetado y FACS.
5. Clasificación celular activada por fluorescencia
- Resuspender los gránulos celulares en solución de bloqueo (PBS + 0,1% FBS) e incubar durante 10 min a 4 °C.
- Centrifugar a 300 × g y 4 °C durante 3 min, y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender los gránulos celulares en una solución de bloqueo que contenga anticuerpos directamente conjugados (ver Tabla 1 para las combinaciones de anticuerpos apropiadas para identificar GCs y TCs), e incubar en hielo durante 10 min.
- Lavar y centrifugar las celdas a 300 × g y 4 °C durante 3 min. Resuspender las células en el tampón FACS que contiene 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), y ejecutar la suspensión celular a través de un instrumento FACS para capturar una pequeña población de las células (500-1.000) utilizando la intensidad de fluorescencia de anticuerpos conjugados con fluoróforos para gating.
- Para la identificación de subpoblaciones únicas, utilice las siguientes estrategias de compuerta:
- Para la purificación de GCs, dibuje una puerta alrededor de las células CD45+ (Figura 1B), y excluya esta población de la población CD99+ (Figura 1A y Figura 1C); luego, subdivida la fracción CD99+ restante en fracciones PVRL+/- (Figura 1A y Figura 1C).
- Para la purificación de CT y estroma, coma la población total de ENG+ (Figura 1A) o CD55+ (Figura 1D) para excluir la fracción endotelial CD34+ (Figura 1E) y distinguir las células esteroidogénicas (ANPEP+) y no esteroidogénicas (ANPEP-). Tenga cuidado de compensar el sangrado entre fluoróforos que están cerca en los espectros de emisión.
- Para validar la pureza de la fracción celular clasificada, ejecute el 5% del volumen total capturado a través del instrumento FACS y asegúrese de que las celdas llenen las puertas esperadas y estén presentes con una pureza del >95%.
6. Procesamiento del tejido cortical ovárico
- Dividir el resto del ovario y extirpar la médula con tijeras finas curvas y bisturíes, teniendo cuidado de evitar daños en la corteza ovárica.
- Continúe procesando y adelgazando la corteza ovárica raspando suavemente hasta que quede una médula mínima. Asegúrese de utilizar la fuerza mínima necesaria.
NOTA: El grosor del tejido cortical debe estar entre 1 mm y 1,5 mm. - Divida el tejido cortical en tiras de 2-3 mm de ancho a lo largo del ovario.
7. Congelación lenta del tejido ovárico
- Preparación para la congelación
- Coloque una tira cortical en cada vial criogénico refrigerado que contenga solución de congelación.
- Agitar los viales criogénicos que contienen las tiras corticales en una placa giratoria durante 20 min a 4 °C.
- Congelación lenta del tejido ovárico5
- Coloque los crioviales que contienen tejido ovárico en un congelador programable configurado para que comience a 0 °C.
- Enfriar a una velocidad de 2 °C/min hasta -7 °C.
- Mantener los crioviales a esta temperatura durante 10 min.
- Nuclear la formación de cristales de hielo tocando cada criovial con una punta de algodón que se ha sumergido brevemente en nitrógeno líquido (LN2).
- Enfriar a una velocidad de 0,3 °C/min hasta que la temperatura de la muestra alcance −40 °C.
- Aumente la velocidad de enfriamiento a 10 °C/min hasta que la temperatura de la muestra alcance −140 °C.
- Transferir los crioviales para su almacenamiento en LN2.
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Representative Results
Aislamos folículos de la superficie del ovario y los tratamos enzimáticamente para aislar los GC, así como las células de teca y estroma que rodean la cavidad antral. Las células fueron recolectadas, y las fracciones celulares fueron clasificadas de los folículos antrales (diámetros que oscilan entre 0,5 mm y 4 mm) por FACS a >95% de pureza (Figura 1).
Para etiquetar y purificar fracciones celulares únicas dentro de los folículos antrales humanos, combinamos la digestión enzimática con la clasificación citométrica de flujo. Previamente identificamos proteínas de superficie que marcan específicamente fracciones residentes en folículos2. Hemos demostrado que CD99 (rojo en la Figura 1A) etiqueta específicamente GCs, y PVRL1 (amarillo en la Figura 1A) se localiza cada vez más en el compartimiento GC oofórico a medida que los folículos antrales aumentan en tamaño2. También hemos demostrado que los anticuerpos contra la endoglina (ENG, verde en la Figura 1A) o CD55 (Figura 1D) demarcan específicamente todos los estroma y CTs y que la alanina aminopeptidasa (ANPEP, Figura 1E) es expresada específicamente por las CTs androgénicas 2,6.
Las células se marcaron con un anticuerpo dirigido contra CD99 para identificar GC, y se utilizaron anticuerpos contra CD45 para excluir células hematopoyéticas (Figura 1B, C). Los anticuerpos contra PVRL1 permitieron la separación de la población GC en compartimentos ooforosos y murales (Figura 1C). Después de la digestión enzimática con colagenasa/dispasa, las preparaciones celulares marcadas con anticuerpos contra CD55 (o alternativamente ENG), CD34 y ANPEP permitieron la captura de todos los estromas/CT (CD55+) y/o CTs androgénicos (ANPEP+), con la exclusión de las células endoteliales (CD34+) de las poblaciones de CT (Figura 1D,E). Usando este panel y un protocolo de disociación enzimática escalonada, etiquetamos y purificamos células hematopoyéticas, endoteliales, granulosas (oofóricas y murales) y teca (estromal y androgénicas) de los folículos antrales de ovarios recién resecados.
Figura 1: Etiquetado y purificación de células específicas de linaje de folículos antrales humanos. (A) Micrografía representativa que muestra los compartimentos GC (CD99+ PVRL+/-) y TC (ENG+) dentro de los folículos humanos en la etapa antral; Los cuadros de trazo blancos se magnifican a la derecha. (B-E) Gráficos de clasificación representativos que identifican GCs como células CD45- CD99+ PVRL1+/- (a y b), así como genéricas (CD34- CD55+) y androgénicas (CD34- CD55+ ANPEP+) (C,D). Las poblaciones cerradas se comparten entre (B, C) y (D, E); los controles sin teñir se muestran a la izquierda en (B-E). Barra de escala = (A) 100 μm. Abreviaturas: GC = célula de la granulosa; TC = célula teca; PVRL = nectina; ANPEP = alanina aminopeptidasa; Nuc = núcleos; SSC = dispersión lateral; PE = ficoeritrina; APC = aloficocianina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tipo de celda | Anticuerpos de inclusión | Anticuerpos de exclusión |
| Células de la granulosa | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| Todas las células de la teca | CD55 o ENG | CD34 y CD45 |
| Células esteroidogénicas de la teca | ANPEP | CD34 y CD45 |
Tabla 1: Lista de anticuerpos que se pueden usar para identificar GC, CT y estroma ovárico. Abreviaturas: GC = célula de la granulosa; TC = célula teca.
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Discussion
Una mejor resolución de la diversidad celular dentro de los folículos ováricos es clínicamente importante por varias razones. Al aplicar el protocolo anterior al aislamiento de los subtipos fenotípicos únicos que residen dentro de los folículos en etapa antral, se deben considerar varios factores. En primer lugar, la salud y la viabilidad del tejido ovárico del que se deriva el folículo antral es fundamental para determinar la calidad de las células y el éxito de las aplicaciones posteriores. Esto se puede optimizar minimizando el intervalo isquémico, trabajando rápidamente (preferiblemente en pares) y preparando los espacios de laboratorio que se utilizarán para el procesamiento de tejidos y FACS. En segundo lugar, estos protocolos son adecuados para los folículos en etapa antral precisamente porque pueden identificarse y extraerse fácilmente del ovario para acceder de manera eficiente a la cavidad antral; Un enfoque similar para el estudio de los folículos preantrales y en etapa temprana produciría una población celular con una heterogeneidad mucho mayor. Finalmente, el número y la calidad de las células obtenidas de los folículos variarán ampliamente dependiendo de qué tan avanzado esté el desarrollo de un folículo y si el folículo ha entrado o no en un estado de atresia. Si bien estas limitaciones hacen que el estudio de la reconstrucción de la foliculogénesis sea un desafío, el aislamiento eficiente y robusto de las células derivadas del folículo permitirá una mayor interrogación de los mecanismos subyacentes a la biología ovárica humana y la infertilidad.
La purificación de GCs de los folículos antrales ha sido utilizada previamente por nuestro grupo para demostrar la influencia deletérea de los niveles superfisiológicos de la hormona antimulleriana (AMH) en el desarrollo del folículo6. En ese estudio, el tejido ovárico criopreservado y descongelado tanto de pacientes con preservación de la fertilidad como de donantes de órganos se trasplantó en ratones inmunocomprometidos en diferentes brazos experimentales: células endoteliales de control o que expresan AMH. La exposición crónica a la AMH provocó un fenotipo de luteinización acelerada que se reflejó en un aumento del tamaño del folículo, pero esto solo se elucidó claramente en la firma molecular de los GC residentes en el folículo.
A medida que el ovocito sale de la latencia, los GC adquieren una morfología cuboidal7, comienzan a proliferar y, junto con el ovocito, secretan señales que reclutan las células del estroma circundantes y promueven su diferenciación hacia un destino TC8. Aunque se sabe que la diferenciación adecuada de las células del estroma en CT especializadas es esencial para la fertilidad, los mecanismos que impulsan la especificación de TC y gobiernan su interacción con las células residentes en el folículo durante la maduración de los ovocitos no están bien definidos. En los seres humanos, la heterogeneidad celular que existe en los CT que rodean el folículo sigue siendo particularmente difícil de alcanzar porque, a diferencia de los GC, que son fácilmente accesibles en un entorno de FIV, el aislamiento y el cultivo de CT requieren una biopsia directa de los folículos preovulatorios. Además, la mayoría de los estudios se han basado en la disociación mecánica de la capa de teca de folículos antrales aislados 9,10, produciendo una mezcla heterogénea de poblaciones estromal, teca, vascular e inmune.
Los enfoques multiómicos unicelulares han revelado la heterogeneidad celular de numerosos tejidos y los diversos tipos de células que fomentan el desarrollo de ovocitos dentro del ovario existen dentro de los folículos en una amplia gama de tamaños y etapas de maduración. Los métodos descritos anteriormente complementan los protocolos existentes para el aislamiento y la congelación del tejido ovárico con fines de preservación de la fertilidad y pueden implementarse en paralelo para la obtención de células residentes en el folículo con fines clínicos o experimentales. La aplicación de estos métodos será importante para descifrar los mecanismos moleculares que gobiernan la foliculogénesis humana y son un requisito previo crítico para los enfoques destinados a fomentar el desarrollo / maduración de ovocitos a partir de folículos primordiales in vitro.
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Disclosures
Todos los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo del Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) y el Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G cuenta con el apoyo de la beca de capacitación postdoctoral NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
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