Summary
ここでは、胞状卵胞からの卵巣細胞の同定と精製のためのプロトコルを提示します。皮質ストリップの凍結保存のために卵巣全体を処理すると同時に、顆粒膜、テカ、内皮、造血、間質細胞など、複数の卵胞常在細胞タイプを遊離させるために酵素的に処理される無傷の胞状卵胞を採取する方法について詳しく説明しています。
Abstract
卵母細胞の活性化、成長、発達、および成熟は、卵巣の複数の細胞タイプ間だけでなく、視床下部/下垂体/卵巣回路内の複数の制御ポイント間で調整される複雑なプロセスです。卵巣内では、複数の特殊な細胞型が卵巣卵胞内の卵母細胞と密接に関連して成長します。これらの細胞の生物学は、生殖補助医療の副産物として容易に回収される後の段階でよく説明されています。しかし、卵巣から直接分離された小さな胞状卵胞の詳細な分析は、ヒト卵巣組織の不足と生殖補助治療を受けている患者の卵巣へのアクセスの制限のために一般的に行われていません。
皮質ストリップの凍結保存のために卵巣全体を処理し、卵巣常在細胞を同時に同定/分離するこれらの方法は、胞状卵胞発生の初期段階の高解像度分析を可能にします。胞状卵胞を酵素的に処理し、顆粒膜細胞、テカ細胞、内皮細胞、造血細胞、間質細胞を分離することにより、個別の細胞タイプを分離するためのプロトコルを示します。胞状卵胞からさまざまなサイズと発生段階で細胞を分離することで、卵胞の成長と卵巣生理機能を促進する細胞および分子メカニズムの包括的な分析が可能になり、卵胞の微小環境を再現するために in vitro で培養できる生存細胞の供給源が提供されます。
Introduction
ヒト卵巣の主要な機能要素は卵胞であり、卵母細胞の成長と発達を支配する。卵胞細胞を単離するためのプロトコルは、 体外 受精の文脈で十分に確立されていますが、これらは卵母細胞回収の時点で黄体化卵胞から細胞を収集する場合にのみ適切です1。私たちは、天然の卵巣または異種移植された卵巣組織から生じるさまざまな発生段階で、胞状卵胞から離散細胞集団を分離できるようにするプロトコルを開発しました2。卵母細胞の培養に対する卵胞常在細胞の寄与が非常に重要であるというコンセンサスがありますが、胞期卵胞に存在する固有の表現型サブタイプを前向きに特定して抽出した研究はほとんどありません。異なる発生段階における特殊細胞間の分化階層とシグナル伝達のより深い理解は、恒常性および病理学的条件下での卵巣生理学の理解を広げる可能性があります。さらに、個別の細胞サブタイプと卵胞の成長/成熟へのそれらの分子的寄与の識別は、卵母細胞の成熟を促進し、および/または内分泌機能障害を治療するために卵巣機能を再構築する ex vivo 代理を生成する手段を提供する可能性があります。
卵巣内のそれぞれのユニークな細胞型は、卵胞の複雑な機能に寄与し、卵胞に含まれる卵母細胞の成長と成熟を促進するための個別のミニ器官として効果的に機能します。卵胞の中心である卵母細胞は、顆粒膜細胞(GC)の連続層に直接包まれており、テカ細胞(TC)は卵母細胞およびGCと結合して卵胞単位を構成する細胞の二次層を形成します。GCとTCは2つのグループに分類されますが、多数のサブタイプが含まれています。GCは卵胞内の位置に従って分類されます。卵母細胞を囲むGCと基底膜に隣接するGCは、それぞれ卵母性GCと壁状GCとして指定され、これらのサブタイプは固有のトランスクリプトームシグネチャを示します。TCには、ステロイド産生性、代謝性、および構造的サポートを提供するように機能する多数のサブタイプがあります。内皮細胞、血管周囲細胞、および免疫細胞は、正常な卵巣生理機能を維持する上で中心的な役割を果たします。卵巣間質は、卵胞の成長の基質として機能するだけでなく、TCを生じさせる前駆細胞の供給源を提供する可能性があります。卵巣内の細胞サブタイプのこの多層複合体は、内分泌器官と生殖器官の両方としての機能を可能にするものです。
この論文は、胞状卵胞からの顆粒膜、テカ、間質、内皮、および造血細胞の同定と精製のためのプロトコルを提示します。このプロトコルを利用して、これらの卵巣細胞を分離し、シングルセルシーケンシングを使用して分析し、その後、さまざまな発生段階の卵胞で特異的染色を行いました。このプロトコルは、複製可能な簡単な方法論を提供し、卵巣の生理学と病理学の両方の高解像度分析を可能にします。
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Protocol
マウスを含むすべての手順は、ワイルコーネル医学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。卵巣組織を用いたすべての異種移植実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。両方の卵巣は、放射線/化学療法の病歴がなく、内分泌または生殖状態の病歴が記録されていない14歳の脳死臓器提供者から分離されました。ワイルコーネル医学の治験審査委員会(IRB)委員会は組織の収集を承認し、組織の使用に関するインフォームドコンセントの後に臓器提供者の家族からの承認が得られました。
1.卵巣組織の収集と取り扱い
- 卵巣全体と関連組織を収集し、滅菌生理食塩水ですすいでください。
- 滅菌ピンセットを使用して、卵巣を滅菌容器に入れます。滅菌、緩衝、冷たい溶液(例えば、リーボヴィッツのL-15培地)を容器に注ぎます。組織が液体で完全に覆われていることを確認してください。
- 容器を閉じ、滅菌ビニール袋を使用して二重袋に入れます。容器を氷上で隔離された箱(発泡スチロールなど)に入れて輸送します。できるだけ早く、できれば5時間3,4を超えない時間で、卵巣を処理するラボに検体を移します。
2.卵巣組織の処理
注:虚血間隔を可能な限り短縮するために、組織がラボに到着する前にすべての試薬とツールが準備されていることを確認してください。バッファーは、凍結の1週間前までに調製し、使用するまで冷蔵することができます。
- 卵巣処理と凍結のための準備
- 組織処理の準備としてバイオセーフティキャビネットに滅菌手術器具をセットします:1つの番号21メス;1つの番号11メス。鋭く細かい湾曲したはさみ。1つの長い鉗子(~150 mmの長さ);2つの中型鉗子(~110mmの長さ)。
- 100 mLの組織処理培地を準備します( 材料の表を参照):抗生物質抗真菌溶液を含むLeibovitzのL-15培地を0.2 μmフィルターを使用してろ過します。培地を冷やしてください。
- クライオバイアルにラベルを付け、各バイアルに1.5 mLの凍結溶液( 材料表を参照)を加え、4°Cで保存します。
- 6ウェルプレートを手元に用意して使用してください。
- 組織の到着時
- 容器に70%エタノール溶液をスプレーし、完全に拭いて、バイオセーフティキャビネット内に置きます。
- 滅菌手袋を着用して、容器を開けます。卵巣を滅菌ペトリ皿に入れ、冷やした培地(ステップ2.1.2から)を注ぎ、組織を水和させます。卵巣が培地に半分沈んでいることを確認してください。
- 縫合糸やその他の材料を取り除き、残っている周囲の組織を卵巣から解剖します。
3.胞状卵胞の分離
- 分離のために個々の卵胞を特定します。健康な卵胞を選択する際には、血液で満たされた、暗い、または非対称の卵胞は、肛門である可能性が高いため、除外します。
- メスを使用して卵巣全体から選択した枝状卵胞を分離し、卵胞を囲む皮質組織を切除して前庭を無傷に保ちます。
- 摘出した無傷の胞状卵胞をそれぞれ6ウェルプレートの1ウェルに入れる。説明の目的で必要な場合は、皿の下に配置された定規を使用して、卵胞の直径を決定します。
- メスを使用して、無傷の胞状卵胞を二等分して胞状腔にアクセスし、4 mLの酵素細胞剥離培地を追加します。プレートを加湿インキュベーター内で5%CO2 、37°Cで10分間インキュベートします。
- 必要に応じて、追加の胞状卵胞の抽出を繰り返します。
4.卵胞常在細胞の単離
- インキュベーション後、20%FBSを含む4 mLの利用可能な培地を加え、P1,000マイクロピペットで二等分した卵胞上で培地を繰り返し激しくピペッティングして洗い流します。
- 培地を回収し、100 μmのフィルターに通します。
- ろ過した上清を300 × g 、4°Cで3分間遠心分離します。上清を吸引し、標識および蛍光活性化細胞選別(FACS)のために細胞ペレット(GCで濃縮)を氷上に保存します。
- 残りの組織をバランスのとれた生理食塩水(ハンクスなど)で希釈したコラゲナーゼ(100 U/mL)とディスパーゼ(1 U/mL)の混合物に入れ、5%CO2 および37°Cで30分間インキュベートし、10分後と20分後に2回、粉砕と激しいピペッティング(つまり、ピペットチップを10〜15回通過)によって組織を機械的に破壊します。
- 組織を含む培地を回収し、P1,000マイクロピペットチップでピペッティングで洗い流し、100 μmフィルター で ひずみを加えます。
- 300 × g 、4°Cで3分間遠心分離します。上清を吸引し、標識およびFACSのために細胞ペレット(TCおよび間質細胞で濃縮)を氷上に脇に置きます。
5. 蛍光活性化セルソーティング
- 細胞ペレットをブロッキング溶液(PBS + 0.1% FBS)に再懸濁し、4°Cで10分間インキュベートします。
- 300 × g 、4°Cで3分間遠心分離し、上清を吸引した。
- 細胞ペレットを直接結合した抗体を含むブロッキング溶液に再懸濁し(GCおよびTCを同定するための適切な抗体の組み合わせについては 表1 を参照)、氷上で10分間インキュベートします。
- 細胞を洗浄し、300 × g 、4°Cで3分間遠心分離します。4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含むFACSバッファーに細胞を再懸濁し、細胞懸濁液をFACS装置に通して、ゲーティング用の蛍光色素標識抗体の蛍光強度を使用して細胞の小さな集団(500-1,000)を捕捉します。
- 固有の部分集団の同定には、次のゲーティング戦略を利用します。
- GCの精製のために、CD45+細胞の周囲にゲートを描き(図1B)、CD99+集団からこの集団を除外します(図1Aおよび図1C)。次いで、残りのCD99+画分をさらにPVRL+/-画分に細分化する(図1Aおよび図1C)。
- TCおよび間質の精製のために、総ENG+(図1A)またはCD55+(図1D)集団をゲートしてCD34+内皮画分(図1E)を除外し、ステロイド原性(ANPEP+)細胞と非ステロイド原性(ANPEP-)細胞を区別します。発光スペクトルが近い蛍光色素間のブリードスルーを補正するように注意してください。
- 選別された細胞画分の純度を検証するには、捕捉された総体積の5%をFACS装置で実行し、細胞が予想されるゲートに住み、>95%の純度で存在することを確認します。
6.卵巣皮質組織の処理
- 卵巣の残りの部分を二等分し、卵巣皮質への損傷を避けるために注意しながら、湾曲した細かいハサミとメスを使用して髄質を切除します。
- 最小限の髄質が残るまで穏やかにこすることによって卵巣皮質の処理と薄化を続けます。必要最小限の力を使用してください。
注:皮質組織の厚さは1mmから1.5mmの間でなければなりません。 - 皮質組織を卵巣の長さに沿って幅2〜3 mmのストリップに分割します。
7.卵巣組織がゆっくりと凍結する
- 凍結の準備
- 凍結溶液を含む各冷却極低温バイアルに1つの皮質ストリップを置きます。
- 皮質ストリップを含む極低温バイアルを回転プレート上で4°Cで20分間振とうします。
- 卵巣組織のゆっくりとした凍結5
- 卵巣組織を含むクライオバイアルを、0°Cで開始するように設定されたプログラム可能な冷凍庫に入れます。
- -7°Cまで2°C/分の速度で冷却します。
- クライオバイアルをこの温度で10分間維持します。
- 液体窒素(LN2)に短時間浸漬した綿の先端で各クライオバイアルに触れることにより、核氷結晶を形成します。
- サンプル温度が-40°Cに達するまで、0.3°C/minの速度で冷却します。
- サンプル温度が-140°Cに達するまで、冷却速度を10°C/分に上げます。
- LN2に保管するためにクライオバイアルを移します。
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Representative Results
卵巣表面から卵胞を分離し、酵素処理してGCと胞状腔周囲のテカ細胞と間質細胞を分離しました。細胞を回収し、細胞画分を胞状卵胞(直径0.5 mmから4 mmの範囲)からFACSによって純度>95%まで選別しました(図1)。
ヒト胞状卵胞内のユニークな細胞画分を標識および精製するために、酵素消化とフローサイトメトリーソーティングを組み合わせました。我々は以前に、卵胞常在画分2を特異的にマークする表面タンパク質を同定した。CD99(図1Aの赤色)はGCを特異的に標識し、PVRL1(図1Aの黄色)は、胞状卵胞のサイズ2が大きくなるにつれて、卵巣胞GCコンパートメントにますます局在することを示しました。また、エンドグリン(ENG、図1Aの緑色)またはCD55(図1D)に対する抗体がすべての間質とTCを特異的に区別し、アラニンアミノペプチダーゼ(ANPEP、図1E)がアンドロゲンTCによって特異的に発現されることも示しました2,6。
細胞をCD99に対する抗体で標識してGCを同定し、CD45に対する抗体を使用して造血細胞を除外しました(図1B、C)。PVRL1に対する抗体により、GC集団を卵性コンパートメントと壁コンパートメントに分離することができました(図1C)。コラゲナーゼ/ディスパーゼによる酵素消化後、CD55(またはENG)、CD34、およびANPEPに対する抗体で標識された細胞調製物は、TC集団から内皮細胞(CD34+)を除外して、すべての間質/TC(CD55+)および/またはアンドロゲンTC(ANPEP+)の捕捉を可能にしました(図1D、E).このパネルと段階的な酵素解離プロトコルを使用して、切除したばかりの卵巣の胞状卵胞から造血細胞、内皮細胞、顆粒膜細胞(卵性および壁状細胞)、およびテカ細胞(間質およびアンドロゲン性細胞)を標識および精製しました。
図1:ヒト胞状卵胞由来の系統特異的細胞の標識と精製。 (A)腹膜期のヒト卵胞内のGC(CD99+ PVRL+/-)およびTC(ENG+)コンパートメントを示す代表的な顕微鏡写真。白いストロークボックスは右に拡大されます。(B-E)GCをCD45-CD99+ PVRL1+/-細胞(aおよびb)、ならびにジェネリック(CD34-CD55+)およびアンドロゲン(CD34-CD55+ ANPEP+)TC(C、D)として識別する代表的なソートプロット。ゲート集団は(B、C)と(D、E)の間で共有されます。染色されていないコントロールは、(B-E)の左側に示されています。スケールバー = (A) 100 μm。略語:GC =顆粒膜細胞;TC = テカ細胞;PVRL = ネクチン;ANPEP = アラニンアミノペプチダーゼ;ヌク=核;SSC = 側方散乱;PE =フィコエリスリン;APC = アロフィコシアニン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| セルタイプ | 封入抗体 | 排除抗体 |
| 顆粒膜細胞 | CD99 (PVRL+/-) | CD45 |
| すべてのテカ細胞 | CD55 または英語 | CD34 & CD45 |
| ステロイド産生テカ細胞 | アンペップ | CD34 & CD45 |
表1:GC、TC、および卵巣間質を同定するために使用できる抗体のリスト。 略語:GC =顆粒膜細胞;TC =テカ細胞。
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Discussion
卵巣卵胞内の細胞多様性のより良い分解能は、いくつかの理由で臨床的に重要です。上記のプロトコルを、胞状期の卵胞内に存在する固有の表現型サブタイプの分離に適用する際には、いくつかの要因を考慮する必要があります。第一に、胞状卵胞の由来となる卵巣組織の健全性と生存率は、細胞の品質と下流への適用の成功を決定する上で重要です。これは、虚血間隔を最小限に抑え、迅速に(できればペアで)作業し、組織処理とFACSに使用される実験室スペースを準備することによって最適化できます。第二に、これらのプロトコルは、卵巣から簡単に識別して抽出し、胞状腔に効率的にアクセスできるため、胞期の卵胞に適しています。初期段階および胞状卵胞前の研究のための同様のアプローチは、はるかに大きな不均一性を有する細胞集団をもたらすであろう。最後に、卵胞から得られる細胞の数と質は、卵胞の発達がどの程度進んでいるか、卵胞が閉鎖状態に入ったかどうかによって大きく異なります。これらの限界は卵胞形成の再構築の研究を困難にしますが、卵胞由来細胞の効率的かつ堅牢な分離は、ヒト卵巣生物学と不妊症の根底にあるメカニズムのさらなる調査を可能にします。
胞状卵胞からのGCの精製は、卵胞の発達に対する抗ミュラー管ホルモン(AMH)の超生理学的レベルの有害な影響を実証するために以前に私たちのグループによって利用されました6。その研究では、生殖能力温存患者と臓器提供者の両方からの凍結保存および解凍された卵巣組織を、異なる実験群(対照またはAMH発現内皮細胞)の免疫不全マウスに移植しました。AMHへの慢性曝露は、卵胞サイズの増加に反映された加速黄体形成の表現型を促したが、これは卵胞常在性GCの分子シグネチャでのみ明確に解明された。
卵母細胞が休眠状態を出ると、GCは直方体の形態7を獲得し、増殖を開始し、卵母細胞とともに、周囲の間質細胞を動員し、TC運命8への分化を促進するシグナルを分泌します。間質細胞を特殊なTCに適切に分化させることは、生殖能力に不可欠であることが知られていますが、TCの仕様を推進し、卵母細胞の成熟中に卵胞常在細胞との相互作用を支配するメカニズムは明確に定義されていません。ヒトでは、IVFの設定で容易にアクセスできるGCとは異なり、TCの分離と培養には排卵前卵胞の直接生検が必要であるため、卵胞を取り巻くTCに存在する細胞の不均一性は特にとらえどころのないままです。さらに、ほとんどの研究は、孤立した胞状卵胞からのテカ層の機械的解離に依存しており9,10、間質、テカ、血管、および免疫集団の不均一な混合物を生み出しています。
シングルセルマルチオミクスアプローチにより、多数の組織の細胞不均一性や、卵巣内の卵母細胞発生を促進する多様な細胞型が、さまざまなサイズと成熟段階にわたって卵胞内に存在していることが明らかになりました。上記の方法は、生殖能力の維持を目的とした卵巣組織の単離および凍結のための既存のプロトコルを補完し、臨床目的または実験目的のための卵胞常在細胞の調達のために並行して実施することができる。これらの方法の適用は、ヒトの卵胞形成を支配する分子メカニズムを解読するために重要であり、 in vitroで原始卵胞からの卵母細胞の発生/成熟を促進することを目的としたアプローチの重要な前提条件です。
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Disclosures
すべての著者は、競合する利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、クイニー・ビクトリーナ・ネリ研究奨学生賞(D.J.)と劉鴻慶研究奨学生賞(L.M.)からの支援を認めています。N.L.Gは、NYSTEM幹細胞および再生医療ポスドクトレーニング助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| - 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| - 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| - 3.42 g of sucrose | |||
| - 10.65 mL of DMSO | |||
| - 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
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