ヒト胞状卵胞からの系統特異的細胞の抽出、標識、精製
Summary
ここでは、胞状卵胞からの卵巣細胞の同定と精製のためのプロトコルを提示します。皮質ストリップの凍結保存のために卵巣全体を処理すると同時に、顆粒膜、テカ、内皮、造血、間質細胞など、複数の卵胞常在細胞タイプを遊離させるために酵素的に処理される無傷の胞状卵胞を採取する方法について詳しく説明しています。
Abstract
卵母細胞の活性化、成長、発達、および成熟は、卵巣の複数の細胞タイプ間だけでなく、視床下部/下垂体/卵巣回路内の複数の制御ポイント間で調整される複雑なプロセスです。卵巣内では、複数の特殊な細胞型が卵巣卵胞内の卵母細胞と密接に関連して成長します。これらの細胞の生物学は、生殖補助医療の副産物として容易に回収される後の段階でよく説明されています。しかし、卵巣から直接分離された小さな胞状卵胞の詳細な分析は、ヒト卵巣組織の不足と生殖補助治療を受けている患者の卵巣へのアクセスの制限のために一般的に行われていません。
皮質ストリップの凍結保存のために卵巣全体を処理し、卵巣常在細胞を同時に同定/分離するこれらの方法は、胞状卵胞発生の初期段階の高解像度分析を可能にします。胞状卵胞を酵素的に処理し、顆粒膜細胞、テカ細胞、内皮細胞、造血細胞、間質細胞を分離することにより、個別の細胞タイプを分離するためのプロトコルを示します。胞状卵胞からさまざまなサイズと発生段階で細胞を分離することで、卵胞の成長と卵巣生理機能を促進する細胞および分子メカニズムの包括的な分析が可能になり、卵胞の微小環境を再現するために in vitro で培養できる生存細胞の供給源が提供されます。
Introduction
ヒト卵巣の主要な機能要素は卵胞であり、卵母細胞の成長と発達を支配する。卵胞細胞を単離するためのプロトコルは、 体外 受精の文脈で十分に確立されていますが、これらは卵母細胞回収の時点で黄体化卵胞から細胞を収集する場合にのみ適切です1。私たちは、天然の卵巣または異種移植された卵巣組織から生じるさまざまな発生段階で、胞状卵胞から離散細胞集団を分離できるようにするプロトコルを開発しました2。卵母細胞の培養に対する卵胞常在細胞の寄与が非常に重要であるというコンセンサスがありますが、胞期卵胞に存在する固有の表現型サブタイプを前向きに特定して抽出した研究はほとんどありません。異なる発生段階における特殊細胞間の分化階層とシグナル伝達のより深い理解は、恒常性および病理学的条件下での卵巣生理学の理解を広げる可能性があります。さらに、個別の細胞サブタイプと卵胞の成長/成熟へのそれらの分子的寄与の識別は、卵母細胞の成熟を促進し、および/または内分泌機能障害を治療するために卵巣機能を再構築する ex vivo 代理を生成する手段を提供する可能性があります。
卵巣内のそれぞれのユニークな細胞型は、卵胞の複雑な機能に寄与し、卵胞に含まれる卵母細胞の成長と成熟を促進するための個別のミニ器官として効果的に機能します。卵胞の中心である卵母細胞は、顆粒膜細胞(GC)の連続層に直接包まれており、テカ細胞(TC)は卵母細胞およびGCと結合して卵胞単位を構成する細胞の二次層を形成します。GCとTCは2つのグループに分類されますが、多数のサブタイプが含まれています。GCは卵胞内の位置に従って分類されます。卵母細胞を囲むGCと基底膜に隣接するGCは、それぞれ卵母性GCと壁状GCとして指定され、これらのサブタイプは固有のトランスクリプトームシグネチャを示します。TCには、ステロイド産生性、代謝性、および構造的サポートを提供するように機能する多数のサブタイプがあります。内皮細胞、血管周囲細胞、および免疫細胞は、正常な卵巣生理機能を維持する上で中心的な役割を果たします。卵巣間質は、卵胞の成長の基質として機能するだけでなく、TCを生じさせる前駆細胞の供給源を提供する可能性があります。卵巣内の細胞サブタイプのこの多層複合体は、内分泌器官と生殖器官の両方としての機能を可能にするものです。
この論文は、胞状卵胞からの顆粒膜、テカ、間質、内皮、および造血細胞の同定と精製のためのプロトコルを提示します。このプロトコルを利用して、これらの卵巣細胞を分離し、シングルセルシーケンシングを使用して分析し、その後、さまざまな発生段階の卵胞で特異的染色を行いました。このプロトコルは、複製可能な簡単な方法論を提供し、卵巣の生理学と病理学の両方の高解像度分析を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
卵巣卵胞内の細胞多様性のより良い分解能は、いくつかの理由で臨床的に重要です。上記のプロトコルを、胞状期の卵胞内に存在する固有の表現型サブタイプの分離に適用する際には、いくつかの要因を考慮する必要があります。第一に、胞状卵胞の由来となる卵巣組織の健全性と生存率は、細胞の品質と下流への適用の成功を決定する上で重要です。これは、虚血間隔を最小限に抑え、迅?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、クイニー・ビクトリーナ・ネリ研究奨学生賞(D.J.)と劉鴻慶研究奨学生賞(L.M.)からの支援を認めています。N.L.Gは、NYSTEM幹細胞および再生医療ポスドクトレーニング助成金によってサポートされています。
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
