Verimli adjuvanları rasyonel olarak tasarlamak için, poli-laktik-ko-glikolik asit nanopartikül-stabilize Pickering emülsiyonu (PNPE) geliştirdik. PNPE, güçlü hücresel temas için benzersiz yumuşaklığa ve hidrofobik bir arayüze sahipti ve yüksek içerikli antijen yüklemesi sundu, dağıtım sisteminin antijen sunan hücrelere hücresel afinitesini artırdı ve antijenlerin verimli bir şekilde içselleştirilmesini sağladı.
Mikro-/nanopartiküllerin hücresel afinitesi, ilaç dağıtımı ve immün yanıt için gerekli olan hücresel tanıma, hücresel alım ve aktivasyonun ön koşuludur. Bu çalışma, katı parçacıkların yükünün, boyutunun ve şeklinin hücre afinitesi üzerindeki etkilerinin genellikle göz önünde bulundurulduğu gözleminden kaynaklanmıştır, ancak yumuşaklığın, dinamik yeniden yapılanma fenomeninin ve karmaşık arayüz etkileşiminin hücresel afinitedeki temel rolünü nadiren fark ediyoruz. Burada, katı formların eksikliklerinin üstesinden gelen ve patojenlerin esnekliğini ve akışkanlığını simüle eden poli-laktik-ko-glikolik asit (PLGA) nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonu (PNPE) geliştirdik. PNPE’nin hücre yüzeylerine afinitesini test etmek ve bağışıklık hücreleri tarafından daha sonra içselleştirilmesini detaylandırmak için bir yöntem oluşturulmuştur. PNPE’nin biyo-mimetik hücre dışı veziküllere (bEV’ler) olan afinitesi – kemik iliği dendritik hücrelerinin (BMDC’ler) yerini alır – hücre emülsiyon yapışmasının gerçek zamanlı izlenmesine izin veren dağılım izlemeli (QCM-D) bir kuvars kristali mikro dengesi kullanılarak belirlendi. Daha sonra, PNPE antijeni (ovalbümin, OVA) vermek için kullanıldı ve BMDC’ler tarafından antijenlerin alımı konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak gözlendi. Temsili sonuçlar, PNPE’nin bEV’lerle karşılaştığında frekansı (ΔF) hemen azalttığını ve PNPE’nin BMDC’lere hızlı yapışmasını ve yüksek afinitesini gösterdiğini gösterdi. PNPE, PLGA mikropartiküllerinden (PMP’ler) ve AddaVax adjuvanından (yüzey aktif madde stabilize nano-emülsiyon [SSE] olarak belirtilen) hücre zarına önemli ölçüde daha güçlü bağlanma gösterdi. Ayrıca, dinamik eğrilik değişiklikleri ve lateral difüzyonlar yoluyla immünositlere hücresel afinitenin artması nedeniyle, antijen alımı daha sonra PMP’ler ve SSE ile karşılaştırıldığında artmıştır. Bu protokol, yüksek hücre afinitesi ve etkili antijen içselleştirmesi ile yeni formülasyonlar tasarlamak için içgörüler sağlar ve etkili aşıların geliştirilmesi için bir platform sağlar.
Epidemik, kronik ve bulaşıcı hastalıklarla mücadele etmek için, profilaktik ve terapötik aşılar için etkili adjuvanlar geliştirmek zorunludur 1,2. İdeal olarak, adjuvanlar mükemmel güvenlik ve immün aktivasyona sahip olmalıdır 3,4,5. Antijen sunan hücreler (APC’ler) tarafından antijenlerin etkin alımı ve işlenmesinin, aşağı akış sinyal kaskadlarında ve immün yanıtın başlatılmasında önemli bir aşama olduğu düşünülmektedir 6,7,8. Bu nedenle, bağışıklık hücrelerinin antijenlerle etkileşim mekanizmasını net bir şekilde anlamak ve içselleştirmeyi arttırmak için adjuvanlar tasarlamak, aşıların etkinliğini artırmak için etkili stratejilerdir.
Benzersiz özelliklere sahip mikro-/ nanopartiküller daha önce antijenlerin hücresel alımına ve patojenle ilişkili moleküler modellerle hücresel etkileşime aracılık etmek için antijen dağıtım sistemleri olarak araştırılmıştır 9,10. Hücrelerle temas ettikten sonra, dağıtım sistemleri hücre dışı matris ve hücre zarı ile etkileşime girmeye başlar, bu da içselleştirmeye ve ardından hücresel tepkilere yol açar11,12. Önceki çalışmalar, parçacıkların içselleştirilmesinin hücre zarı-parçacık yapışması13, ardından hücre zarının esnek deformasyonu ve reseptörün yüzey zarına difüzyonu14,15 yoluyla gerçekleştiğini ortaya koymuştur. Bu koşullar altında, dağıtım sisteminin özellikleri, APC’lere olan yakınlığa bağlıdır ve bu da daha sonra16,17 alım miktarını etkiler.
Gelişmiş bağışıklık tepkisi için dağıtım sisteminin tasarımı hakkında fikir edinmek için, parçacıkların özellikleri ile hücresel alım arasındaki ilişkinin araştırılmasına kapsamlı çabalar odaklanmıştır. Bu çalışma, çeşitli yüklere, boyutlara ve şekillere sahip katı mikro-/ nanopartiküllerin genellikle bu ışıkta incelendiği, akışkanlığın antijen içselleştirmedeki rolünün nadiren araştırıldığı gözleminden kaynaklanmıştır18,19. Aslında, yapışma sırasında, yumuşak parçacıklar, katı parçacıklar20,21 tarafından zorlukla çoğaltılabilen çok değerli etkileşimler için temas alanını arttırmak için dinamik eğrilik değişiklikleri ve yanal difüzyonlar gösterdi. Ek olarak, hücre zarları alım bölgesinde fosfolipid çift katmanlıdır (sfengolipidler veya kolesterol) ve hidrofobik maddeler lipitlerin konformasyonel entropisini değiştirebilir ve hücresel alım için gereken enerji miktarını azaltabilir22,23. Bu nedenle, hareketliliği arttırmak ve dağıtım sisteminin hidrofobikliğini teşvik etmek, bağışıklık tepkisini arttırmak için antijen içselleştirmesini güçlendirmek için etkili bir strateji olabilir.
İki karışmaz sıvı arasındaki arayüzde bir araya getirilen katı parçacıklar tarafından stabilize edilen Pickering emülsiyonu, biyolojik alanda yaygın olarak kullanılmaktadır24,25. Aslında, yağ / su arayüzündeki toplayıcı parçacıklar, çok seviyeli dağıtım sistemi-hücresel etkileşimleri teşvik eden çok seviyeli yapıların formülasyonunu belirler ve ilaç dağıtımında çok fonksiyonlu fizyokimyasal özellikleri daha da indükler. Deforme olmaları ve lateral hareketlilikleri nedeniyle, Pickering emülsiyonlarının immünositlerle çok değerli hücresel etkileşime girmesi ve membran proteinleri tarafından tanınması bekleniyordu26. Ek olarak, Pickering emülsiyonlarındaki yağlı misel çekirdekleri tamamen katı parçacıklarla kaplı olmadığından, Pickering emülsiyonları, yağ/su arayüzündeki parçacıklar arasında farklı boyutlarda boşluklara sahiptir ve bu da daha yüksek hidrofobikliğe neden olur. Bu nedenle, Pickering emülsiyonlarının APC’lere olan afinitesini araştırmak ve verimli adjuvanlar geliştirmek için sonraki içselleştirmeyi detaylandırmak çok önemlidir.
Bu düşüncelere dayanarak, PNPE’nin BMDC’lere ve hücresel içselleştirmeye olan yakınlığı konusunda değerli bilgiler edinmeye yardımcı olan bir akışkanlık aşısı dağıtım sistemi olarak PLGA nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonunu (PNPE) tasarladık. Biyo-mimetik hücre dışı veziküllerin (bEV’ler; BMDC’lerin değiştirilmesi) PNPE’ye gerçek zamanlı yapışması, dağılım izlemeli (QCM-D) bir kuvars kristali mikro terazisi kullanılarak etiketsiz bir yöntemle izlendi . PNPE’nin BMDC’lere afinitesinin karakterizasyonunu takiben, antijen alımını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanıldı. Sonuç, PNPE’nin BMDC’lere daha yüksek afinitesini ve antijenin verimli bir şekilde içselleştirilmesini göstermiştir. PNPE’nin APC’lere daha yüksek afinite göstereceğini ve bu da immün yanıtları arttırmak için antijenlerin içselleştirilmesini daha iyi uyarabileceğini tahmin ettik.
Gelişmiş antijen içselleştirme için bir dağıtım sistemi olarak PLGA nanopartikül stabilize yağ / su emülsiyonunu geliştirdik. Hazırlanan PNPE, iniş noktasını desteklemek için yoğun bir şekilde paketlenmiş bir yüzeye ve bağışıklık hücresi zarı ile güçlü hücresel temas için benzersiz yumuşaklık ve akışkanlığa sahipti. Ayrıca, yağ / su arayüzü yüksek içerikli antijen yüklemesi sundu ve amfifilik PLGA, antijenlerin bağışıklık hücrelerine taşınması için PNPE’ye yüksek s…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), Çin Bilimler Akademisi Temel Sınır Bilimsel Araştırma Programı (ZDBS-LY-SLH040), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Yenilikçi Araştırma Grupları Vakfı (Hibe No. 21821005) tarafından desteklenen Proje tarafından desteklenmiştir.
AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |