Summary
効率的なアジュバントを合理的に設計するために、ポリ乳酸-コグリコール酸ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を開発しました。PNPEは、強力な細胞接触のための独特の柔らかさと疎水性界面を有し、ハイコンテント抗原ローディングを提供し、抗原提示細胞への送達システムの細胞親和性を改善し、抗原の効率的な内在化を誘導した。
Abstract
マイクロ/ナノ粒子の細胞親和性は、薬物送達と免疫応答に不可欠な細胞認識、細胞取り込み、および活性化の前提条件です。本研究は、固体粒子の電荷、サイズ、形状が細胞親和性に及ぼす影響が通常考慮されるが、細胞親和性における柔らかさ、動的再構成現象、および複雑な界面相互作用の本質的な役割をほとんど認識していないという観察から生じました。ここでは、硬質形態の欠点を克服し、病原体の柔軟性と流動性をシミュレートするポリ乳酸-co-グリコール酸(PLGA)ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を開発しました。PNPEの細胞表面への親和性をテストし、その後の免疫細胞による内在化について詳しく説明する方法を設定しました。骨髄樹状細胞(BMDC)の代替物である生体模倣細胞外小胞(bEV)に対するPNPEの親和性を、細胞乳剤接着のリアルタイムモニタリングを可能にする散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)を用いて決定した。続いて、PNPEを使用して抗原(オボアルブミン、OVA)を送達し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用してBMDCによる抗原の取り込みを観察しました。代表的な結果は、PNPEがbEVに遭遇するとすぐに頻度(ΔF)が低下することを示し、PNPEのBMDCへの迅速な接着と高い親和性を示しました。 PNPEは、PLGA微粒子(PMP)およびAddaVaxアジュバント(界面活性剤安定化ナノエマルジョン[SSE]と表記)よりも細胞膜への有意に強い結合を示しました。さらに、動的な曲率変化と側方拡散による免疫細胞への細胞親和性の向上により、PMPやSSEと比較して抗原の取り込みが促進されました。このプロトコルは、高い細胞親和性と効率的な抗原インターナリゼーションを備えた新規製剤を設計するための洞察を提供し、効率的なワクチン開発のためのプラットフォームを提供します。
Introduction
流行病、慢性疾患、感染症と闘うためには、予防的および治療的ワクチン接種のための効果的なアジュバントを開発することが不可欠です1,2。理想的には、アジュバントは優れた安全性および免疫活性化を有するべきである3、4、5。抗原提示細胞(APC)による抗原の効果的な取り込みおよびプロセスは、下流のシグナル伝達カスケードおよび免疫応答の開始において不可欠な段階であると考えられている6、7、8。したがって、免疫細胞と抗原の相互作用のメカニズムを明確に理解し、内在化を促進するためのアジュバントを設計することは、ワクチンの効率を高めるための効率的な戦略です。
ユニークな特性を持つマイクロ/ナノ粒子は、抗原の細胞内取り込みおよび病原体関連分子パターンとの細胞相互作用を媒介する抗原送達システムとして以前に研究されてきた9,10。細胞と接触すると、送達系は細胞外マトリックスおよび細胞膜と相互作用し始め、それが内在化およびその後の細胞応答をもたらした11,12。これまでの研究では、粒子の内在化は細胞膜-粒子接着13、続いて細胞膜の柔軟な変形および表面膜への受容体の拡散によって起こることが明らかになった14,15。このような状況下では、送達システムの特性はAPCへの親和性に依存し、APCはその後、取り込み量に影響を与える16,17。
免疫応答を改善するための送達システムの設計に関する洞察を得るために、粒子の特性と細胞取り込みとの関係の調査に広範な努力が注がれてきました。本研究は、様々な電荷、サイズ、形状を有する固体マイクロ/ナノ粒子がこの観点からしばしば研究される一方で、抗原インターナリゼーションにおける流動性の役割はほとんど研究されないという観察から生じた18,19。実際、接着中、軟質粒子は動的曲率変化および横方向拡散を示し、多価相互作用の接触面積を増加させたが、これは固体粒子20,21によってほとんど複製できない。さらに、細胞膜は取り込み部位のリン脂質二重層(スフィンゴ脂質またはコレステロール)であり、疎水性物質は脂質の立体構造エントロピーを変化させ、細胞の取り込みに必要なエネルギー量を減少させる可能性があります22,23。したがって、移動度を増幅し、送達系の疎水性を促進することは、免疫応答を増強するために抗原インターナリゼーションを強化するための有効な戦略であり得る。
ピッカリングエマルジョンは、2つの非混和性液体間の界面に集合した固体粒子によって安定化され、生物学分野において広く使用されている24、25。実際、油/水界面の凝集粒子は、マルチレベルデリバリーシステムと細胞相互作用を促進し、薬物送達における多機能物理化学的特性をさらに誘導するマルチレベル構造の定式化を決定します。それらの変形能および横方向の移動度のために、ピッカリングエマルジョンは免疫細胞との多価細胞相互作用に入り、膜タンパク質によって認識されることが期待された26。さらに、ピッカリングエマルジョンの油性ミセルコアは固体粒子で完全に覆われていないため、ピッカリングエマルジョンは油/水界面の粒子間に異なるサイズのギャップを持ち、疎水性を高めます。したがって、ピカリングエマルジョンのAPCへの親和性を調査し、その後の内在化について詳しく説明して、効率的なアジュバントを開発することが重要です。
これらの考察に基づいて、我々は、PNPEのBMDCおよび細胞内在化への親和性に関する貴重な洞察を得るのにも役立つ流動性ワクチン送達システムとしてPLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を設計しました。PNPEへの生体模倣細胞外小胞(bEV、BMDCの置換)のリアルタイム接着を、散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)を用いたラベルフリー法 で モニターしました。PNPEのBMDCへの親和性の特性評価に続いて、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を使用して抗原取り込みを決定しました。その結果、PNPEのBMDCに対する親和性が高く、抗原の効率的なインターナリゼーションが示されました。PNPEはAPCに対してより高い親和性を示し、抗原の内在化をよりよく刺激して免疫応答を増強する可能性があると予想しました。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての方法は、中国科学院プロセスエンジニアリング研究所によって承認されています。すべての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する規則および動物の倫理審査に関するガイドライン(中国、GB / T35892-2018)に厳密に従って実施されました。
1. PLGAナノ粒子の作製と特性評価
- PLGAナノ粒子(PNP)の調製
- 90°Cのイオン交換水120mLにポリビニルアルコール(PVA)0.5gを加え、完全に溶解するまで攪拌してPVA溶液を調製した。室温まで冷却した後、溶液を冷蔵庫(4°C)に保存した。
- 油相として機能するアセトンとエタノールの混合物10 mL(4:1の比率)に100 mgのPLGAを加えます。
- 20 mLのPVA水溶液をヒュームフードの下に置き、400 rpm / minで磁気的に攪拌します。シリンジポンプを使用して、5 mLの油相をPVA溶液に一滴ずつ加えます。次に、有機溶媒が完全に蒸発するまで、ヒュームフード内で混合物を攪拌します。
注:油相中の粒子の濃度が増加するにつれて、水相溶液は徐々に透明で透明な淡い青みがかった白色または乳白色に変わります。 - 有機溶媒の揮発(2〜3時間)後、混合物を15,000 x gで遠心分離します。最終的な洗浄水が透明で透明になるまで、3回以上洗浄します。
注:このステップの目的は、主に粒子表面の残留PVAを洗い流して、ピッカリングエマルジョン調製に影響を与えないようにすることです。 - 洗浄したPNPを2 mLの脱イオン水に再懸濁し、混合物を-80°Cで24時間凍結します。続いて、粒子を凍結乾燥機中で48〜72時間凍結乾燥する。準備されたPNPは白いフロッキーです。
- PNPの特性評価
- PNPのサイズとゼータ電位を特徴付けるには、10 μLのPNPを1 mLの脱イオン水に加えて希釈液を得、その希釈液をDTS1070セルに移します。コンピュータと動的光散乱アナライザ(DLS)の電源を入れ、DTS1070セルをDLSシステムに配置します。
- Zeta Sizeソフトウェアをクリックし、新しい測定ファイルを作成して決定手順を設定します。そして、粒径及びゼータ電位分布を求める決定手順を開始する。
- PNPの形態を観察するには、0.1 mLのPNPs溶液(40倍に希釈)を5 cm x 5 cmのブリキ箔シートに均一に広げ、通気孔のあるヒュームフードで一晩自然蒸発させます。
- 錫箔のごく一部を切り取り、導電性テープでサンプルテーブルに固定します。10 mAの電流で120秒間金をスプレーします。続いて走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて試料の表面形態を観察する。
2. PNPEの調製と特性評価
- PNPEを調製するには、凍結乾燥PNPを4mg/mLの濃度の脱イオン水(水相)に加え、油相としてスクアレンを加えます。水浴超音波処理器で100Wで5分間のワンステップ超音波処理 を介して PNPEを準備します。油水相比は1:9です。
- 調製されたPNPEの特性評価
- マスターサイザー2000ソフトウェアとレーザーを順番に開きます。[測定]をクリックしてプリセットプログラムを開き、サンプル名を設定します。[開始]をクリックしてサンプルのバックグラウンドの測定を開始し、スポイトを使用して、レーザー粒度分析計のサンプルタンクに1 mLのPNPEを追加して、エマルジョンの粒子サイズを並行して3回測定します。
- 20 μLのPNPEを1 mLの脱イオン水で希釈します。20 μLのエマルジョンをスライドに落とします。40倍の倍率で光学顕微鏡を使用してエマルションの形態と均質性を観察し、写真を取得します。
- 抗原ローディング効率
- 200 μgのオボアルブミン(OVA)を500 mLの脱イオン水に溶解します。次に、それを調製したPNPE500 mLと混合し、室温で1時間振とうします。5000 x g で20分間遠心分離することにより、流体抗原を除去します。
- ビシンコニン酸(BCA)アッセイ27を用いて流体抗原濃度を決定する。抗原負荷効率の計算式は次のとおりです。
抗原負荷効率=
同じ方法を使用して、対照群として使用されるSSEの抗原負荷効率を決定します。
- PNPEの安定性
- 調製したPNPE6mLを6等分し、それぞれ4°Cと25°Cで3部ずつ保存します。0、3、および6日目に、20 μLの保存されたPNPEを1 mLの脱イオン水(1:50)に希釈します。次に、異なる温度に保たれたPNPEストック溶液のサイズとゼータ電位を測定します。
注:PNPEの安定性に対するさまざまな温度の影響を比較するために、さまざまな保管温度が設定されており、高い安定性と長い貯蔵寿命のために保管条件を最適化できます。
- 調製したPNPE6mLを6等分し、それぞれ4°Cと25°Cで3部ずつ保存します。0、3、および6日目に、20 μLの保存されたPNPEを1 mLの脱イオン水(1:50)に希釈します。次に、異なる温度に保たれたPNPEストック溶液のサイズとゼータ電位を測定します。
- PLGA微粒子(PMP)の調製
- 油相として500 mgのPLGAを5 mLのジクロロメタンに溶解し、次に1.5%PVAを含む50 mLの外水相に注ぎ、油/水混合物を得ます。ホモジナイザーを用いて混合物を3000rpmで1分間均質化し、粗エマルジョンを得た。
- 膜乳化により、ミクロスフェアのPLGA粒子径(粗エマルジョンによって決定)の均一性を維持します。メンブレンチューブに5.2μmのメンブレンを取り付けます。圧力を800 kPaに調整し、安定させます。
- 排気バルブと供給バルブを開き、粗エマルジョンをサンプルタンクに追加した後、排気バルブとフィードバルブを閉じ、排出バルブと入口バルブを開き、200mLビーカーにポストフィルムエマルジョンを取ります。このプロセスを3回繰り返して、プレダブルエマルジョンを得る。
- プレダブルエマルジョンを攪拌して室温でジクロロメタンを蒸発させ、ミクロスフェアを硬化させます。7741 x g の脱イオン水を使用してミクロスフェアを3分間5回洗浄します。-80°Cの冷凍庫で予備凍結し、最後に凍結乾燥して乾燥したミクロスフェアを得ます。
- PMPの特性評価
- マスターサイザー2000ソフトウェアとレーザーを順番に開きます。[測定]をクリックしてプリセットプログラムを開き、サンプル名を設定します。[開始]をクリックして、サンプルのバックグラウンドの測定を開始します。次に、スポイト付きのレーザー粒度分析装置の試料添加槽にPMPs1mLを添加し、微粒子の粒径を並行して3回測定した。
- 柔らかさ分析
注:PNPEをSiO2 センサーにコーティングして、柔らかさを測定しました。- SiO 2石英センサーチップをUVオゾン処理で10分間洗浄し、5 mLのエタノール(75% v / v)で2回すすぎ、N2で乾燥させます。空のSiO2石英センサーチップをフローセルに取り付けます。
- コンピュータの電源を入れ、ソフトウェアの右下にある温度制御をアクティブにして、設定温度が室温より約1°C低いことを確認します。
- ツールバーの 「アクイジション 」ボタンをクリックし、「 測定のセットアップ 」を選択して、使用するチャンネル内のチップの1、3、5、7、9、および11オクターブを検索します。ツールバーの 集録 ボタンをクリックし、 測定開始を選択します。
- 空気でベースラインを修正し、ベースラインのバランスが取れたら、[停止]を選択してファイルを空白として保存します。
- チップを洗浄し、チップ上の10 μg/mLのPNPEをスピンコートします。簡単に言えば、スピンコーターの電源を入れ、動作パラメータを設定します。N2パイプをスピンコーターに接続し、ガスボンベの分別を0.4kPaに調整し、クリーンチップをスピンコーターの吸盤に置きます。PNPEをSiO2センサーの中央に100μL滴下し、スピンコーターの上部カバーを閉じてコーティングを完了します。
- PNPEコーティングされたチップをフローセルに取り付けます。手順 2.7.3 から 2.7.4 を繰り返し、ファイルを PNPE として保存します。ブランクファイルとPNPEファイルの両方を開き、[ステッチ]ボタンをクリックして、関連する散逸データ(ΔD)を取得します。
3. BMDCの単離と培養 28
注:細胞活性にプラスの効果があるため、すべての試薬とサンプルが氷上に配置されていることを確認してください。無菌性を維持するには、滅菌器具を使用して超クリーンベンチですべてのステップを実行します。
- C57BL / 6(雌、6〜8週齢)マウスをCO2吸入で安楽死させ、エタノール70%(v / v)に浸して短時間滅菌します。
- 3〜5分間浸した後、マウスを超クリーンベンチに移します。ステンレス鋼のハサミを使用して脚の筋肉を取り除き、大腿骨と脛骨を露出させてから、大腿骨と脛骨を分離します。
- ペトリ皿に70%(v / v)エタノールを入れ、きれいな骨を5〜10秒間浸して、外部滅菌を完了します。すべての骨をきれいにし、それらの周りに氷が入った滅菌チューブに入れます。
- はさみを使用して関節に近い大腿骨と脛骨をトリミングします。シリンジ針を骨に挿入し、事前に冷却されたRPMI培地(1640)を使用して骨髄を遠心管に洗い流します。
- 骨が完全に白くなるまで2〜3回すすいでください。骨髄を数回ピペットで固定して、すべての塊を分離します。直径40 μmのふるいを使用して、細胞を15 mLの遠沈管にろ過します。
- 4°C、500 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、2 mLの赤血球溶解物を沈殿物に4分間加えます。
- 2〜3回洗浄した後、細胞を2 mLの完全培地(1%ペニシリン-ストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清、20 ng / mLのIL-4、および10 ng / mLのGM-CSF)に再懸濁します。次に、10 μLの細胞を1 mLのPBSに希釈し、ハンドヘルド自動セルカウンターのチップを細胞希釈液に挿入して細胞計数を行います。最後に、1 x 106 細胞/mLの密度で細胞を完全培地で10 mmの培養皿に播種します。
- 細胞を37°Cで5%CO2 を含む細胞インキュベーター内で培養する。 2日ごとに培地を交換してください。7日目に、細胞を50 mLチューブに移し、450 x g で5分間遠心分離して細胞を回収します。
4. 生体模倣細胞外小胞(bEV)の調製
- 製造元の指示に従って、ミニ押出機を順番に組み立てます。使用する前に、シリンジハウジングにひびが入っていないことを確認してください。すべての実験の前に、すべてのOリングが良好な状態にあることを確認し、摩耗または損傷したものを速やかに交換してください。Oリングが摩耗または損傷すると、押出機の運転時に突然の圧力解放を引き起こす可能性があります。
- BMDCを繰り返し吸引し、遠心管に移します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離して細胞を回収します。 ミニ押出機29を用いて、細胞懸濁液を10μm、5μm、および1μmのポリカーボネート膜を通して30パス加圧する。
注:bEVサイズの均一性を実現するために、BMDCサスペンションを10 μm、5 μm、および1 μmのポリカーボネート膜に30パス押し込みました。さらに、操作中は、均等に力を加え、シリンジの軸に沿って力の方向を維持するようにしてください。 - プールした上清を1000 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、細胞を除去します。上清を回収し、3000 x g で4°Cで5分間遠心分離して、残りの細胞と細胞破片を除去します。
- 上清を回収し、100,000 x g で4°Cで90分間遠心分離します。 上清を廃棄し、2 mLのHEPES緩衝生理食塩水(HBS)にbEVを再懸濁します。0.45 μmのメンブレンによるろ過でbEVを精製し、精製したbEVを-80°C で 保管します。
5. 電気自動車はPNPEに準拠しています
注:SiO2 センサーは、スピンコーティング法 によって 変更されました。
- ポリ-L-リジン(PLL)で修飾されたSiO2 センサー。
- UVオゾン処理を使用してSiO 2石英センサーチップを10分間洗浄し、エタノールで2回すすぎ、N2で乾燥させます。
- 電源ボタンを押してスピンコーターの電源を入れ、コントロールボタンを押して、コーティング時間と速度を設定します。初回転数は400rpmで、5000rpmまで着実に上昇しています。
- N2パイプをスピンコーターに接続し、ガスボンベの分別を0.4kPaに調整します。きれいなチップをスピンコーターの吸盤に置きます。100 μLのPLLをSiO2センサーの中央に滴下し、スピンコーターの上部カバーを閉じます。
- スタートボタンを押してサンプルのコーティングを開始し、終了したらマシンを停止します。真空ポンプをオフにし、電源ボタンと制御ボタンをオフにして、PLLで変更されたSiO2センサーを取り外します。
注意: [開始]を押す前に、コーティングの時間と速度が設定されていることを確認してください。さらに、SiO2 センサーが吸盤の中央に配置されていることを確認してください。事故を防ぐために、プロセスを実行する前に蓋が閉まっていることを確認してください。
- PNPEへのbEVの接着性の測定
- コンピューター、電子ユニット、ペリスタルティックポンプの電源を入れ、ソフトウェアの右下にある温度制御をアクティブにして、設定温度が室温より約1°C低いことを確認します。
- 取扱説明書に従ってPLL修飾SiO2 センサーをフローセルに配置し、フローセルとフローポンプの間に測定ラインを接続します。フローセルをフローモジュールシステム内に置き、超純水ですすいでから実験を開始してください。
- 「集録」ツールバーをクリックし、「測定のセットアップ」を選択して、使用するチャンネル内のチップの1、3、5、7、9、および11オクターブを検索します。ベースラインを修正するには、[測定の開始]をクリックして、空気のベースラインが滑らかになるまで空気がフローモジュールに入るようにします。続いて、脱イオン水を10〜15分間流して、溶液のベースライン平衡を再び可能にする。
- 調製したPNPE溶液を50 μL/minの流量でフローモジュールにポンプで送り込み、SiO2 センサーに平衡吸着を実現します。
注:PNPEがフローモジュールに再度ポンプで送られてもΔFは変化しなくなり、SiO2 センサーの表面がPNPEで完全に覆われていることを示します。 - 調製したbEV溶液を50 μL/minの流量でフローモジュールにポンプで送り込み、PNPE表面へのbEVの接着プロセスを追跡します。
6. 抗原取り込みのCLSM解析
- PNPE-OVAとBMDCの共培養
- BMDCを1640の完全な培地(1%ペニシリン-ストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清、20 ng/mLのIL-4、および10 ng/mLのGM-CSF)で7日間インキュベートし、次に5%CO2インキュベーター内で37°Cで一晩、ウェルあたり1 x 106の小さな共焦点レーザー皿に播種します。
- 0.5 mLのCy5標識OVA(400 μg/mL)と0.5 mLのPNPEを1時間混合し、5000 x g で20分間遠心分離して流体抗原を除去し、ワクチン製剤を開発します。200 μLの脱イオン水で再懸濁した後、10 μLの製剤(10 μg/mL OVA)をスーパークリーンベンチ下の小さな共焦点レーザー皿に加え、BMDCと6時間共培養します。
- アクチン細胞骨格染色
- 細胞から培養液を取り出し、事前に温めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で2回洗浄します。
- PBS中の4%ホルムアルデヒド溶液で室温で10分間細胞を固定します。固定中は、アクチンを破壊する可能性のあるメタノールを含む固定剤を避けてください。
- 細胞をPBSで室温で2〜3回、それぞれ10分間洗浄します。100 μLの0.5%Triton X-100溶液で室温で5分間細胞を透過処理します。細胞をPBSで室温で2〜3回、それぞれ10分間洗浄します。
- 小型共焦点レーザーディッシュのガラス底ディッシュ上の細胞を200 μLのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合ファロイジン作業溶液で覆い、暗所で室温で30分間インキュベートします。バックグラウンドシグナルを低減するには、FITC結合ファロイジン作業溶液に1%ウシ血清アルブミンを加えます。さらに、インキュベーション中に小さな共焦点レーザー皿の蓋を覆い、溶液の蒸発を防ぎます。
- 細胞をPBSでそれぞれ5分間洗浄します。核を200 μLのDAPI溶液(濃度:100 nM)で約30秒間再染色します。
- 画像解析
- レーザー、共焦点、顕微鏡、コンピューターなどの共焦点顕微鏡ハードウェアを順番にオンにします。 NIS-Elements AR 5.20.00 ソフトウェアをクリックし、 ニコン共焦点 を選択してテストシステムに入ります。
- 共焦点顕微鏡システムでは、記載されている順序でさまざまなユニットの電源を入れます。まず、FITC、DAPI、およびCy5チャネルを設定し、対応するHVとオフセットを調整します。次に、100倍のオイルレンズを選択し、上に杉油を一滴垂らします。染色されたBMDCを含む小さな共焦点レーザー皿を顕微鏡ステージに置きます。
- [ スキャン ]ボタンをクリックします。蛍光顕微鏡下で、X軸、Y軸、Z軸を動かして目的の細胞を見つけます。レーザー強度、画像サイズ、その他のパラメータを調整して、高品質の共焦点画像をスキャンできるようにします。最後に、[ キャプチャ ]ボタンをクリックして画像を保存します。
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Representative Results
PNPEを得るために、単純なワンステップソニフィケーションを使用しました。まず、固体安定剤として使用する均一なPNPを準備しました(図1A)。PNPの形態はSEMで観察され、ほとんど均一で球形であることがわかりました(図1B)。製剤の流体力学的サイズおよびゼータ電位をDLS を介して 検出した。PNPの直径は187.7 ± 3.5 nmで、ゼータ電位は-16.4 ± 0.4 mVでした(図1C および 補足表1)。PNPEを調製するために、PNP溶液(0.4%、w / v)とスクアレンの混合物を5分間100wで単に超音波処理した(図1D)。連続相の最適化後、得られたPNPEは内部的にスクアレンで構成され、PNPで外部吸着されました(補足図1)。光学顕微鏡を用いてエマルジョン液滴を観察し、マスターサイザー粒度分析計を用いて粒度分布を決定した。PNPEは、エマルションの合体を妨げる粒子が少なくなく、連続相でより大きな凝集体を引き起こす粒子が過剰になることもありませんでした(図1E)。 図1F および 補足表1に示すように、エマルションサイズは2100 ± 300 nmであり、ゼータ電位は-27.1 ± 0.5 mVであり、粒子が油/水界面で凝集していることを示しています。抗原の細胞内取り込みを観察するために、Cy5ラベルOVAをPNPEに吸着させた。まず、500 μLのPNPEを500 μLのCy5標識OVAと室温で1時間混合しました。製剤上の抗原の吸収をBCAアッセイを用いて試験した。その高い比表面積と疎水性により、流体抗原の70.6%以上が1時間以内にPNPEに吸着され、短時間で大量の抗原をロードできる可能性が非常に高いことを示しています。対照群として、PMPおよびSSEも特徴付けられた。PMPのサイズはPNPEに匹敵する(1987 ± 310 nm)。SSEは、直径サイズが147.2±0.5nmの負に帯電したエマルジョン(-15.9±0.8mV)であった。さらに、PMPsおよびSSEの負荷効率は、抗原への吸着が限られているため、それぞれ0.6%±23.4%および23.4%±0.2%にとどまった(補足表1)。さらに、PNPEの安定性を評価するために、調製したPNPEをそれぞれ4°Cおよび25°Cで保存した。ストック溶液のサイズおよびゼータ電位を0〜6日目(1:50希釈)に決定した。 補足図2に示すように、液滴は4°Cおよび25°Cでの保存中に同様のサイズおよびゼータ電位を維持し、抗原送達に対するPNPEのより高い安定性を示唆した。次に、QCM-Dを使用してPNPEの柔軟性を測定しました。 図1Gに示すように、PMPは剛性の高い構造の結果、より低い散逸(ΔD)を示しました。同時に、PNPEはΔDが有意に高く、優れた粘弾性と柔軟性を示しており、これが細胞の付着と取り込みの改善の理由の1つである可能性があります。
PNPEのBMDC膜への親和性を検証するために、正確なQCM-D検出に適したサイズであるため、bEVを使用して無傷の細胞を交換しました。このプロセスでは、成熟したBMDCを回収し、10、5、および1μmの孔径を含むポリカーボネートメンブレンフィルターを通して連続的に押し出して、ナノサイズの小胞を調製しました。得られたbEVを回収し、超遠心 で 精製し、HEPES緩衝生理食塩水に再懸濁した(図2A)。次に、ネガティブ染色されたbEVの形態を透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して調査しました。ナノ粒子追跡分析(NTA)を使用して、bEVのサイズをテストしました。その結果、bEVは閉じた脂質二重層状の小胞形態であり、分布は均一であることが明らかになりました(図2B)。NTAは、精製されたbEVのピーク直径が131nmであるbEVのサイズ分布を示しました(図2C)。したがって、bEVは均一な分布を持つ典型的な膜構造であり、BMDCの代替としてQCM-Dアッセイの精度を高めることができると結論付けました。
次に、QCM-Dを用いてPNPEへのbEVの接着を追跡した。まず、QCM-D SiO2 センサーをPLLで変更して正電荷を付与し、その後PNPEを表面に固定し、生物間相プロセスをシミュレートしました。その後、PNPEとbEVの相互作用を解明するために、チャンバーにbEV溶液を添加しました(図3A)。 図3Bに示すように、周波数の即時低下(ΔF)は、遭遇後のPNPEへのbEVの急速な接着を示しました。また,ΔFはbEV濃度の増加とともに減少し,濃度依存的な効果を反映した。PNPEは着陸地点を支えるために密集した表面を持っています。さらに、強力な細胞接触のための動的な曲率変化と横方向の拡散を示し、BMDCに対する高い親和性をもたらしました。対照的に、PMPとSSEは、高濃度(80 μg/mL)でもbEVに弱く結合しており、これはおそらく免疫細胞との接触部位の欠如に起因していました(図3C)。
BMDCへの接着プロセスを確認した後、PNPEを使用してBMDCに抗原を送達しました。抗原インターナリゼーションプロファイルを in vitroで直接可視化するために、Cy5標識OVAをPMP、SSE、およびPNPEと混合して、それぞれBMDCで処理しました。治療後6時間後、BMDCにおけるCy5標識OVAの細胞取り込みを分析するためにCLSMを実施した。 図4Aに示すように、Cy5-OVA蛍光シグナルは、PNPE治療群の方がPMPおよびSSE処理群と比較して、細胞内にインターナライズされた抗原の総量が有意に高いことを示しました。細胞取り込みの定量的分析をさらに実施したところ、PNPEで処理されたBMDCでは、PMPおよびSSEで処理されたBMDCよりも有意に高い相対蛍光強度が示され(p < 0.001)、上記の観察を裏付けました(図4B)。得られた結果は、PNPEが抗原のインターナリゼーションを促進し、抗原を細胞内に効果的に送達することを実証した。その結果、抗原の取り込み効率は標的細胞への送達系親和性と正の関連があり、PNPEは細胞膜とのマルチレベル接触 を介して 抗原細胞の取り込みを効果的に増加させました。
図1:PLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョンの特性評価 。 (A)PLGAナノ粒子(PNP)の調製に用いた実験手順の概略図。(B)PNPの走査型電子顕微鏡(SEM)画像。 スケールバー= 200 nm。(C)PNPのサイズ分布。 (D)ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)の調製に使用される実験手順の概略図。(E)PNPEの光学顕微鏡写真。スケールバー = 20 μm. (F) PNPEのサイズ分布。(G)散逸(ΔD)の検出によるPNPE、PLGA微粒子(PMP)、および界面活性剤安定化エマルジョン(SSE)の柔らかさに関する散逸モニタリング(QCM-D)分析を備えた水晶振動子マイクロバランス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:生体模倣細胞外小胞の特性評価 。 (A)生体模倣細胞外小胞(bEV)の調製に使用される実験手順の概略図。(B)bEVの透過型電子顕微鏡(TEM)画像。スケールバー= 200 nm。(C)ナノ粒子追跡分析(NTA)を用いて測定したbEVのサイズ分布(n=3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:QCM-Dを用いて分析したBNPEとbEVの親和性 。 (A)PNPEコーティングによるPLL表面の改質の概略図。(B)異なる濃度のbEVに遭遇した後のPNPEの周波数(ΔF)の変化。(C)PLGA微粒子(PMP)、界面活性剤安定化エマルジョン(SSE)、PNPEにおけるΔFの変化の比較。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:抗原の取り込み 。 (A)抗原の細胞内取り込みの代表図。スケールバー = 20 μm。 (B)抗原の細胞内取り込みの相対強度蛍光。グラフには、3つの独立した実験からのSEM±平均値が表示されます。一元配置分散分析を使用して、観察された差の有意性を分析しました。p < 0.001 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:連続相の最適化。 (A)異なる連続相で構成されたPNPEの光学顕微鏡写真。スケールバー= 20μm。 (B)調製後にエマルジョンのサイズを検出した。結果はSEM±平均値(n=3)として表した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:PNPEの安定性。 示された温度での0、3、および6日間の保存後のPNPEのサイズ(A)およびゼータ電位(B)。データはSEM±平均値として実証した(n=3)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:製剤の特性評価。 PNP、PNPE、およびSSEは、示されたプロトコルに従って調製された。サイズ分布およびゼータ電位は、動的光散乱分析装置(DLS)またはマスターサイザー粒度分析装置によって決定した。負荷効率は、BCAアッセイを用いて評価した。データはSEM±平均値として実証した(n=3)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、抗原インターナリゼーションを強化するための送達システムとして、PLGAナノ粒子安定化油/水エマルジョンを開発しました。調製されたPNPEは、着弾点を支える高密度に充填された表面と、免疫細胞膜との強力な細胞接触のための独特の柔らかさおよび流動性を有していた。さらに、油/水界面はハイコンテント抗原ローディングを提供し、両親媒性PLGAは免疫細胞への抗原輸送に対して高い安定性を備えたPNPEを付与しました。PNPEは細胞の表面に急速に接着する可能性があり、PLGAナノ粒子安定化エマルジョンが細胞膜に強い親和性を持って細胞を取り込むことを示しています。さらに、PNPEは、スクワレンとPLGAの両方が食品医薬品局(FDA)承認の成分30であり、クリニックへの安全な移動を活用することが期待されているため、高い安全性プロファイルを持っていました。
PLGAの分子量と連続相および分散相の種類は、安定性や疎水性などのPNPE特性に影響を与えました。この研究では、安定性剤として分子量17 kDaのPLGAナノ粒子を選択し、分散相としてスクアレンを選択し、安定性を高めました。さらに、連続相としての脱イオン水は、製剤の組成を単純化した。この条件下で、PNPEは抗原の効率的な集合を可能にし、免疫細胞への抗原の送達を促進した。さらに、ワンステップ超音波処理の方法は、面倒なプロセスを排除し、汚染の可能性を回避したPNPEを調製するために使用されました。PNPとスクアレンからなる送達システムは均一な力である必要があり、そうでなければエマルジョンが形成されないか、調製されたPNPEのサイズが均一ではないことに注意することが重要です。
細胞への送達系の親和性を研究することはin vivoで行われる並外れた課題でしたが、in vitro研究は細胞の接着と内在化に関与するプロセスを解明するのに役立つ可能性があります。最近、この問題は生物医学分野で大きな注目を集めています。フローサイトメトリーおよびCLSM分析を用いて、粒子の細胞への親和性を明らかにするために多大な努力が払われてきた31,32。これらの方法は細胞レベルで平均的な読み出しを提供しますが、細胞と送達システム間の特定の動的結合プロセスは簡単には監視できません。対照的に、QCMは主に、ΔFが質量とともに変化する敏感な圧電結晶に依存します。微小な質量変化を検出する機能により、QCM-Dは標的分子相互作用をモニタリングすることができます。この手法は、リアルタイムイベントを監視するために使用でき、さまざまな条件下でのPNPEとBMDCとの親和性の研究を可能にします33。
PNPEへの接着は、インタクトセルの代わりにbEVを使用して調査されました。十分に制御された単純なAPCとして、bEVは親細胞の特性のほとんどを受け継ぐと考えられています。一般に、小さく均質な粒子サイズの細胞外小胞は、接着アッセイにおいて優れた性能を発揮します。したがって、bEVは、10、5、および1μmの孔径34のポリカーボネートフィルターを介した押出成形によって調製されました。bEVの直径と歩留まりは、押出数とポリカーボネート膜の孔径を調整することで制御できます。ポリカーボネート膜を30回通過させることをお勧めします。しかし、この方法には、膜の一部が逆になり、DC表面のタンパク質がbEVに封入され、エマルジョンへの親和性がわずかに低下する可能性があるという1つの制限もありました。
正に荷電したタンパク質を用いたSiO2 センサー表面の修飾は、その後のPNPEコーティングに適していることが示された。SiO2 センサー表面とPNPEの間の中間層としてのPLL(ポリカチオンポリペプチド)の記載された実装は、高速コーティング法の改善であることが証明された。任意の事象、例えば、SiO2 センサ上の溶液の流れからの任意の成分の非特異的吸着によって引き起こされる質量の変化は、実験結果の精度に影響を与える可能性がある35。そのため、スピンコート後もチップ上でPLLの品質を一定に保ち、非特異的吸着による測定誤差を回避するために、PLLの表面をPNPEで完全に覆う必要がありました。同時に、PNPE含有移動相との接触中にΔF が変化しなくなった場合、チップ表面は完全に覆われていると考えられた。これにより、検出された信号がbEVのPNPEへの接着によって生成されることが確認されました。QCM-Dは、PNPEとAPCの高い親和性を反映して、PNPEへのbEVの接着をリアルタイムで示すための優れた方法であることを実証しました。残念ながら、この方法は個々の細胞と送達システムとの間の相互作用を反映することができなかった。したがって、より正確な決定には、プロトコルのさらなる設計と測定手順の最適化が必要になります。
PNPEのbEVへの高い親和性をアッセイした後、強化されたインターナリゼーションがさらに検証されました。我々は、抗原の強力な細胞内取り込みがPNPEの高い親和性と相関していることを実証した。PNPEは、抗原を効果的にロードするためのマルチレベル構造と、送達を強化するための細胞膜とのマルチレベル接触のための柔軟性を備えていました。したがって、合理的に設計されたピッカリングエマルジョンは、細胞膜との堅牢な相互作用を介して細胞内在化および細胞内経路を刺激した。これらの利点を実証したPNPEは、ワクチンを強化するための新規で安全かつ効率的な抗原送達システムの開発に光を当てる可能性があります。
このプロトコルは、免疫細胞のリン脂質二重層に対するPNPEの高い親和性と、その後のin vitroでの免疫細胞への抗原の細胞内送達を実証することに成功しました。したがって、異なる病原体からの様々なタイプの抗原を送達し、提案されたプロトコルを使用して特徴付け、感染症に対する防御を付与することができる。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2021YFE020527、2021YFC2302605、2021YFC2300142)、中国科学院基礎フロンティア科学研究プログラム(ZDBS-LY-SLH040)の0から1のオリジナルイノベーションプロジェクト、中国国家自然科学財団の革新的研究グループ財団(助成金番号21821005)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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