כדי לתכנן באופן רציונלי אדג’ובנטים יעילים, פיתחנו תחליב פיקרינג (PNPE) של חומצה פולי-לקטית-קו-גליקולית עם ננו-חלקיקים מיוצבים. ה-PNPE היה בעל רכות ייחודית וממשק הידרופובי למגע תאי רב עוצמה והציע העמסת אנטיגן בעלת תכולה גבוהה, שיפור הזיקה התאית של מערכת ההעברה לתאים המציגים אנטיגן וגרימת הפנמה יעילה של אנטיגנים.
הזיקה התאית של מיקרו/ננו-חלקיקים היא התנאי המקדים לזיהוי תאי, ספיגה תאית והפעלה, החיוניים להעברת תרופות ולתגובה חיסונית. המחקר הנוכחי נבע מהתצפית כי ההשפעות של מטען, גודל וצורה של חלקיקים מוצקים על זיקת התא נחשבות בדרך כלל, אך לעתים רחוקות אנו מבינים את התפקיד החיוני של רכות, תופעת ארגון מחדש דינמי ואינטראקציה מורכבת של ממשקים באהדה תאית. כאן, פיתחנו תחליב פיקרינג (PNPE) עם חומצה פולי-לקטית-קו-גליקולית (PLGA) מיוצב על-ידי ננו-חלקיקים שהתגבר על החסרונות של צורות קשיחות ודימה את הגמישות והנזילות של פתוגנים. הוקמה שיטה לבדיקת הזיקה של PNPE לפני השטח של התאים ולהרחבה על ההפנמה שלאחר מכן על ידי תאי מערכת החיסון. הזיקה של PNPE לשלפוחיות חוץ-תאיות ביו-מימטיות (bEVs) – התחליף לתאים דנדריטיים של מח עצם (BMDCs) – נקבעה באמצעות מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), שאיפשר ניטור בזמן אמת של הידבקות תחליב-תאים. לאחר מכן, PNPE שימש כדי לספק את האנטיגן (ovalbumin, OVA) ואת ספיגת האנטיגנים על ידי BMDCs נצפתה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM). תוצאות מייצגות הראו כי ה-PNPE ירד באופן מיידי בתדירות (ΔF) כאשר הוא נתקל ב-bEVs, מה שמעיד על הידבקות מהירה וזיקה גבוהה של ה-PNPE ל-BMDCs. PNPE הראה קשירה חזקה יותר באופן משמעותי לקרום התא מאשר מיקרו-חלקיקים PLGA (PMPs) ואדג’ובנט AddaVax (מסומן כננו-אמולסיה מיוצב פעילי שטח [SSE]). יתר על כן, בשל הזיקה התאית המוגברת לאימונוציטים באמצעות שינויי עקמומיות דינמיים ודיפוזיות לרוחב, ספיגת האנטיגן הוגברה לאחר מכן בהשוואה ל-PMPs ו-SSE. פרוטוקול זה מספק תובנות לתכנון פורמולציות חדשניות עם זיקה גבוהה לתאים והפנמת אנטיגן יעילה, ומספק פלטפורמה לפיתוח חיסונים יעילים.
כדי להילחם במחלות מגיפות, כרוניות ומדבקות, חובה לפתח אדג’ובנטים יעילים לחיסונים מניעתיים וטיפוליים 1,2. באופן אידיאלי, האדג’ובנטים צריכים להיות בעלי בטיחות מעולה והפעלה חיסונית 3,4,5. ספיגה יעילה ותהליך של אנטיגנים על ידי תאים המציגים אנטיגן (APCs) נחשבים לשלב חיוני במפל האיתות במורד הזרם ותחילת התגובה החיסונית 6,7,8. לפיכך, השגת הבנה ברורה של מנגנון האינטראקציה של תאי מערכת החיסון עם אנטיגנים ותכנון אדג’ובנטים להגברת ההפנמה הן אסטרטגיות יעילות להגברת היעילות של חיסונים.
מיקרו/ננו-חלקיקים בעלי תכונות ייחודיות נחקרו בעבר כמערכות העברת אנטיגן כדי לתווך את הקליטה התאית של אנטיגנים ואת האינטראקציה התאית עם תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים 9,10. עם מגע עם תאים, מערכות הלידה מתחילות לקיים אינטראקציה עם המטריצה החוץ-תאית ועם קרום התא, מה שהוביל להפנמה ולתגובות תאיות לאחרמכן 11,12. מחקרים קודמים הראו כי הפנמה של חלקיקים מתרחשת באמצעות הידבקות ממברנה-חלקיקים של התא13, ולאחר מכן דפורמציה גמישה של קרום התא ודיפוזיה של הקולטן לממברנה פני השטח14,15. בנסיבות אלה, המאפיינים של מערכת האספקה תלויים בזיקה לנגמ”שים, אשר משפיעים לאחר מכן על כמות הקליטה16,17.
כדי לקבל תובנות על תכנון מערכת ההעברה לשיפור התגובה החיסונית, התמקדו מאמצים נרחבים בחקר הקשר בין תכונות החלקיקים לבין ספיגת התאים. המחקר הנוכחי נבע מהתצפית כי מיקרו/ננו-חלקיקים מוצקים בעלי מטענים, גדלים וצורות שונים נחקרים לעתים קרובות באור זה, בעוד שתפקיד הנזילות בהפנמת אנטיגן נחקר רק לעתים רחוקות18,19. למעשה, במהלך ההדבקה, החלקיקים הרכים הדגימו שינויי עקמומיות דינמיים ודיפוזיות לרוחב כדי להגדיל את שטח המגע עבור אינטראקציות רב-ערכיות, שבקושי ניתן לשכפל על ידי החלקיקים המוצקים20,21. בנוסף, קרומי התאים הם דו-שכבתיים פוספוליפידים (sphingolipids או כולסטרול) באתר הספיגה, וחומרים הידרופוביים יכולים לשנות את האנטרופיה הקונפורמציונית של שומנים, ולהפחית את כמות האנרגיה הנדרשת לקליטת תאים22,23. לכן, הגברת הניידות וקידום הידרופוביות של מערכת האספקה עשויים להיות אסטרטגיה יעילה לחיזוק הפנמת האנטיגן כדי לשפר את התגובה החיסונית.
תחליבי פיקרינג, המיוצבים על ידי חלקיקים מוצקים המורכבים בממשק שבין שני נוזלים בלתי ניתנים לערעור, היו בשימוש נרחב בתחום הביולוגי24,25. למעשה, החלקיקים הצוברים בממשק שמן/מים קובעים את הניסוח של מבנים רב-שכבתיים, המקדמים אינטראקציות רב-שכבתיות בין מערכת ההעברה לתאים, וגורמים עוד יותר לתכונות פיזיוכימיות רב-תפקודיות בהעברת תרופות. בגלל העיוות והניידות הרוחבית שלהם, תחליבי פיקרינג היו צפויים להיכנס לאינטראקציה תאית רב-ערכית עם האימונוציטים ולהיות מזוהים על ידי חלבוני הממברנה26. בנוסף, מכיוון שליבות מיצלה שמנוניות בתחליבי פיקרינג אינן מכוסות לחלוטין בחלקיקים מוצקים, תחליבי פיקרינג מכילים מרווחים בגדלים שונים בין חלקיקים בממשק השמן/מים, הגורמים להידרופוביות גבוהה יותר. לפיכך, חיוני לחקור את הזיקה של תחליבי פיקרינג לנגמ”שים ולפרט על ההפנמה שלאחר מכן כדי לפתח אדג’ובנטים יעילים.
בהתבסס על שיקולים אלה, תכננו תחליב פיקרינג (PNPE) מיוצב ננו-חלקיקים של PLGA כמערכת אספקת חיסונים לנזילות, שגם סייעה להשיג תובנות חשובות בזיקה של PNPE ל-BMDCs והפנמת תאים. ההדבקה בזמן אמת של שלפוחיות חוץ-תאיות ביו-מימטיות (bEVs; החלפה של BMDCs) ל-PNPE נותרה בשיטה נטולת תוויות באמצעות מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D). בעקבות אפיון הזיקה של PNPE ל-BMDCs, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) כדי לקבוע את ספיגת האנטיגן. התוצאה הצביעה על זיקה גבוהה יותר של PNPE ל- BMDCs, והפנמה יעילה של האנטיגן. ציפינו שה-PNPE יפגין זיקה גבוהה יותר ל-APCs, מה שעשוי לעורר טוב יותר את הפנמת האנטיגנים כדי לשפר את התגובה החיסונית.
פיתחנו תחליב שמן/מים מיוצב ננו-חלקיקים PLGA כמערכת אספקה להפנמת אנטיגן משופרת. ל-PNPE המוכן היה משטח צפוף לתמיכה בנקודת הנחיתה ורכות ונזילות ייחודיות למגע תאי חזק עם קרום תא החיסון. יתר על כן, ממשק השמן/מים הציע העמסת אנטיגן בתכולה גבוהה, ו-PLGA אמפיפילי העניק ל-PNPE יציבות גבוהה להובלת אנטיגנים לת?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט שנתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), מ 0 עד 1 פרויקט חדשנות מקורי של תוכנית מחקר מדעית בסיסית של האקדמיה הסינית למדעים (ZDBS-LY-SLH040), הקרן לקבוצות מחקר חדשניות של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘21821005).
AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |