항원 내재화를 촉진하기 위한 입자 안정화 에멀젼의 세포 친화도
Summary
효율적인 보조제를 합리적으로 설계하기 위해 우리는 폴리 락틱 공동 글리콜 산 나노 입자 안정화 피커링 에멀젼 (PNPE)을 개발했습니다. PNPE는 강력한 세포 접촉을 위한 독특한 부드러움과 소수성 인터페이스를 가지고 있으며 고함량 항원 로딩을 제공하여 항원 제시 세포에 대한 전달 시스템의 세포 친화도를 개선하고 항원의 효율적인 내재화를 유도했습니다.
Abstract
마이크로/나노입자의 세포 친화력은 약물 전달 및 면역 반응에 필수적인 세포 인식, 세포 흡수 및 활성화의 전제 조건입니다. 본 연구는 고체 입자의 전하, 크기 및 모양이 세포 친화도에 미치는 영향이 일반적으로 고려된다는 관찰에서 비롯되었지만 세포 친화도에서 부드러움, 동적 구조 조정 현상 및 복잡한 계면 상호 작용의 본질적인 역할을 거의 깨닫지 못합니다. 여기에서 우리는 단단한 형태의 단점을 극복하고 병원균의 유연성과 유동성을 시뮬레이션한 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA) 나노입자 안정화 피커링 에멀젼(PNPE)을 개발했습니다. 세포 표면에 대한 PNPE의 친화력을 테스트하고 면역 세포에 의한 후속 내재화에 대해 자세히 설명하는 방법이 설정되었습니다. 골수 수지상 세포(BMDC)를 대체하는 생체 모방 세포외 소포(bEV)에 대한 PNPE의 친화도는 소산 모니터링(QCM-D)이 있는 석영 결정 마이크로 저울을 사용하여 결정되었으며, 이를 통해 세포 에멀젼 접착을 실시간으로 모니터링할 수 있었습니다. 이어서, PNPE를 사용하여 항원 (오발 부민, OVA)을 전달하고 BMDCs에 의한 항원의 흡수를 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)을 사용하여 관찰했습니다. 대표적인 결과는 PNPE가 bEV와 조우했을 때 즉시 빈도(ΔF)를 감소시켰으며, 이는 BMDC에 대한 PNPE의 빠른 접착력과 높은 친화력을 나타냅니다. PNPE는 PLGA 미세입자(PMP) 및 AddaVax 보조제(계면활성제-안정화 나노에멀젼[SSE]로 표시됨)보다 세포막에 훨씬 더 강한 결합을 보였다. 또한, 동적 곡률 변화 및 측면 확산을 통해 면역 세포에 대한 향상된 세포 친화력으로 인해 항원 흡수가 PMP 및 SSE에 비해 연속적으로 증가했습니다. 이 프로토콜은 높은 세포 친화도와 효율적인 항원 내재화를 가진 새로운 제형을 설계하기 위한 통찰력을 제공하여 효율적인 백신 개발을 위한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
전염병, 만성 및 전염병과 싸우기 위해서는 예방 및 치료 예방 접종을위한 효과적인 보조제를 개발하는 것이 필수적입니다 1,2. 이상적으로, 보조제는 우수한 안전성 및 면역 활성화 3,4,5를 가져야한다. 항원 제시 세포(APC)에 의한 항원의 효과적인 흡수 및 과정은 다운스트림 신호 전달 캐스케이드 및 면역 반응 6,7,8의 시작에서 필수적인 단계로 생각됩니다. 따라서 면역 세포와 항원의 상호 작용 메커니즘을 명확하게 이해하고 내재화를 강화하기 위해 보조제를 설계하는 것은 백신의 효율성을 향상시키는 효율적인 전략입니다.
독특한 특성을 갖는 마이크로-나노입자는 이전에 항원의 세포 흡수 및 병원체-관련 분자 패턴과의 세포 상호작용을 매개하는 항원 전달 시스템으로서 조사되었다 9,10. 세포와 접촉하면 전달 시스템이 세포 외 기질 및 세포막과 상호 작용하기 시작하여 내재화 및 후속 세포 반응11,12이 발생했습니다. 이전의 연구들은 입자의 내재화가 세포막-입자 접착 (13)을 통해 일어나고, 세포막의 유연한 변형 및 표면 막(14, 15)으로의 수용체의 확산이 뒤 따른다는 것을 밝혀 냈다. 이러한 상황에서 전달 시스템의 속성은 APC에 대한 친화도에 따라 달라지며, 이는 이후에 흡수량(16,17)에 영향을 미칩니다.
개선된 면역 반응을 위한 전달 시스템의 설계에 대한 통찰력을 얻기 위해 입자의 특성과 세포 흡수 사이의 관계에 대한 조사에 광범위한 노력이 집중되었습니다. 본 연구는 다양한 전하, 크기 및 모양을 가진 고체 마이크로 / 나노 입자가 종종 이러한 관점에서 연구되는 반면 항원 내재화에서 유동성의 역할은 거의 조사되지 않는다는 관찰에서 비롯되었습니다18,19. 실제로, 접착 동안, 연질 입자는 동적 곡률 변화 및 측면 확산을 입증하여 다가 상호작용을 위한 접촉 면적을 증가시켰으며, 이는 고체 입자(20,21)에 의해 거의 복제될 수 없다. 또한 세포막은 흡수 부위의 인지질 이중층 (스핑 고지 질 또는 콜레스테롤)이며 소수성 물질은 지질의 구조적 엔트로피를 변경하여 세포 흡수에 필요한 에너지의 양을 줄일 수 있습니다22,23. 따라서, 이동성을 증폭시키고 전달 시스템의 소수성을 촉진하는 것은 면역 반응을 향상시키기 위해 항원 내재화를 강화하기 위한 효과적인 전략이 될 수 있다.
두 개의 비혼화성 액체 사이의 계면에서 조립된 고체 입자에 의해 안정화된 피커링 에멀젼은 생물학적 분야에서 널리 사용되어 왔다(24,25). 사실, 오일/물 계면의 응집 입자는 다단계 구조의 공식을 결정하여 다단계 전달 시스템-세포 상호 작용을 촉진하고 약물 전달에서 다기능 물리화학적 특성을 추가로 유도합니다. 이들의 변형성 및 측면 이동성 때문에, 피커링 에멀젼은 면역세포와의 다가 세포 상호작용에 들어가 막 단백질26에 의해 인식될 것으로 예상되었다. 또한 피커링 에멀젼의 유성 미셀 코어는 고체 입자로 완전히 덮여 있지 않기 때문에 피커링 에멀젼은 오일/물 계면의 입자 사이에 크기가 다른 간격을 가지고 있어 더 높은 소수성을 유발합니다. 따라서 APC에 대한 피커링 에멀젼의 친화력을 탐구하고 효율적인 보조제를 개발하기 위해 후속 내재화에 대해 자세히 설명하는 것이 중요합니다.
이러한 고려 사항을 바탕으로 우리는 PLGA 나노입자 안정화 피커링 에멀젼(PNPE)을 유동성 백신 전달 시스템으로 설계하여 BMDC에 대한 PNPE의 친화력 및 세포 내재화에 대한 귀중한 통찰력을 얻는 데 도움이 되었습니다. PNPE에 대한 생체모방 세포외 소포(bEV, BMDC의 대체)의 실시간 접착은 소산 모니터링(QCM-D)이 있는 석영 결정 마이크로저울을 사용하는 무표지 방법을 통해 모니터링되었습니다. BMDC에 대한 PNPE의 친화도를 특성화한 후 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용하여 항원 흡수를 결정했습니다. 결과는 BMDC에 대한 PNPE의 더 높은 친화도 및 항원의 효율적인 내재화를 나타내었다. 우리는 PNPE가 APC에 더 높은 친화력을 나타낼 것으로 예상했으며, 이는 면역 반응을 향상시키기 위해 항원의 내재화를 더 잘 자극할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 향상된 항원 내재화를 위한 전달 시스템으로 PLGA 나노입자 안정화 오일/물 에멀젼을 개발했습니다. 준비된 PNPE는 착륙 지점을 지원하기 위해 조밀하게 채워진 표면과 면역 세포막과의 강력한 세포 접촉을 위한 독특한 부드러움과 유동성을 가지고 있습니다. 또한 오일/물 계면은 고함량 항원 로딩을 제공했으며 양친매성 PLGA는 항원을 면역 세포로 운반하기 위한 높은 안정성을 PNPE에 부여했…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142)이 지원하는 프로젝트, 0에서 1까지 중국 과학원 기초 프론티어 과학 연구 프로그램 (ZDBS-LY-SLH040), 중국 국립 자연 과학 재단 혁신 연구 그룹 재단 (보조금 번호 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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