Summary
Para diseñar racionalmente adyuvantes eficientes, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico (PNPE). El PNPE poseía una suavidad única y una interfaz hidrófoba para un potente contacto celular y ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, mejorando la afinidad celular del sistema de administración a las células presentadoras de antígenos e induciendo una internalización eficiente de los antígenos.
Abstract
La afinidad celular de las micro / nanopartículas es la condición previa para el reconocimiento celular, la absorción celular y la activación, que son esenciales para la administración de fármacos y la respuesta inmune. El presente estudio surgió de la observación de que generalmente se consideran los efectos de la carga, el tamaño y la forma de las partículas sólidas sobre la afinidad celular, pero rara vez nos damos cuenta del papel esencial de la suavidad, el fenómeno de reestructuración dinámica y la interacción compleja de la interfaz en la afinidad celular. Aquí, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) que superó las deficiencias de las formas rígidas y simuló la flexibilidad y fluidez de los patógenos. Se estableció un método para probar la afinidad de PNPE con las superficies celulares y elaborar sobre la posterior internalización por parte de las células inmunes. La afinidad de PNPE con vesículas extracelulares biomiméticas (bEV), el reemplazo de las células dendríticas de la médula ósea (BMDC), se determinó utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que permitió el monitoreo en tiempo real de la adhesión de la emulsión celular. Posteriormente, se utilizó el PNPE para administrar el antígeno (ovoalbúmina, OVA) y se observó la captación de los antígenos por BMDC utilizando el microscopio de barrido láser confocal (CLSM). Los resultados representativos mostraron que el PNPE disminuyó inmediatamente la frecuencia (ΔF) cuando encontró los bEV, lo que indica una rápida adhesión y una alta afinidad del PNPE con los BMDC. PNPE mostró una unión significativamente más fuerte a la membrana celular que las micropartículas PLGA (PMP) y el adyuvante AddaVax (denotado como nanoemulsión estabilizada con surfactante [SSE]). Además, debido a la mayor afinidad celular con los inmunocitos a través de cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales, la captación de antígenos se incrementó posteriormente en comparación con PMP y SSE. Este protocolo proporciona información para diseñar formulaciones novedosas con alta afinidad celular e internalización eficiente de antígenos, proporcionando una plataforma para el desarrollo de vacunas eficientes.
Introduction
Para combatir las enfermedades epidémicas, crónicas e infecciosas, es imperativo desarrollar adyuvantes efectivos para las vacunas profilácticas y terapéuticas 1,2. Idealmente, los adyuvantes deben poseer una excelente seguridad y activación inmune 3,4,5. Se cree que la captación y el proceso efectivos de antígenos por las células presentadoras de antígeno (APC) son una etapa esencial en las cascadas de señalización aguas abajo y el inicio de la respuesta inmune 6,7,8. Por lo tanto, obtener una comprensión clara del mecanismo de interacción de las células inmunes con antígenos y diseñar adyuvantes para mejorar la internalización son estrategias eficientes para mejorar la eficiencia de las vacunas.
Las micro/nanopartículas con propiedades únicas han sido previamente investigadas como sistemas de liberación de antígenos para mediar la captación celular de antígenos y la interacción celular con patrones moleculares asociados a patógenos 9,10. Al entrar en contacto con las células, los sistemas de entrega comienzan a interactuar con la matriz extracelular y la membrana celular, lo que condujo a la internalización y las respuestas celulares posteriores11,12. Estudios previos han sacado a la luz que la internalización de las partículas tiene lugar a través de la adhesión membrana-partícula celular13, seguida de la deformación flexible de la membrana celular y la difusión del receptor a la membrana superficial14,15. En estas circunstancias, las propiedades del sistema de entrega dependen de la afinidad con los APC, que posteriormente afectan la cantidad de absorción16,17.
Para obtener información sobre el diseño del sistema de administración para mejorar la respuesta inmune, se han centrado amplios esfuerzos en la investigación de la relación entre las propiedades de las partículas y la absorción celular. El presente estudio surgió de la observación de que las micro/nanopartículas sólidas con diversas cargas, tamaños y formas a menudo se estudian bajo esta luz, mientras que el papel de la fluidez en la internalización de antígenos rara vez se investiga18,19. De hecho, durante la adhesión, las partículas blandas demostraron cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales para aumentar el área de contacto para interacciones multivalentes, que difícilmente pueden ser replicadas por las partículas sólidas20,21. Además, las membranas celulares son bicapas de fosfolípidos (esfingolípidos o colesterol) en el sitio de absorción, y las sustancias hidrofóbicas pueden alterar la entropía conformacional de los lípidos, reduciendo la cantidad de energía requerida para la absorción celular22,23. Por lo tanto, amplificar la movilidad y promover la hidrofobicidad del sistema de administración puede ser una estrategia efectiva para fortalecer la internalización del antígeno para mejorar la respuesta inmune.
La emulsión Pickering, estabilizada por partículas sólidas ensambladas en la interfaz entre dos líquidos inmiscibles, ha sido ampliamente utilizada en el campo biológico24,25. De hecho, las partículas agregantes en la interfaz aceite/agua determinan la formulación de estructuras multinivel, que promueven interacciones multinivel entre el sistema de administración y la celular, e inducen aún más propiedades fisicoquímicas multifuncionales en la administración de fármacos. Debido a su deformabilidad y movilidad lateral, se esperaba que las emulsiones de Pickering entraran en interacción celular multivalente con los inmunocitos y fueran reconocidas por las proteínas de membrana26. Además, como los núcleos de micelas aceitosas en las emulsiones Pickering no están completamente cubiertos con partículas sólidas, las emulsiones Pickering poseen espacios de diferentes tamaños entre las partículas en la interfaz aceite/agua, lo que causa una mayor hidrofobicidad. Por lo tanto, es crucial explorar la afinidad de las emulsiones de Pickering con los APC y elaborar la posterior internalización para desarrollar adyuvantes eficientes.
Basándonos en estas consideraciones, diseñamos una emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de PLGA como un sistema de administración de vacunas de fluidez que también ayudó a obtener información valiosa sobre la afinidad del PNPE con los BMDC y la internalización celular. La adhesión en tiempo real de vesículas extracelulares biomiméticas (bEV; un reemplazo de BMDC) a PNPE se monitoreó a través de un método sin etiquetado utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D). Después de la caracterización de la afinidad de PNPE con BMDC, se utilizó microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para determinar la captación de antígenos. El resultado indicó la mayor afinidad de PNPE con BMDC y la internalización eficiente del antígeno. Anticipamos que el PNPE exhibiría una mayor afinidad con las APC, lo que puede estimular mejor la internalización de antígenos para mejorar las respuestas inmunes.
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Protocol
Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Instituto de Ingeniería de Procesos de la Academia China de Ciencias. Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con el Reglamento para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la Guía para la revisión ética de animales (China, GB / T35892-2018).
1. Preparación y caracterización de nanopartículas de PLGA
- Preparación de nanopartículas PLGA (PNPs)
- Añadir 0,5 g de alcohol polivinílico (PVA) a 120 ml de agua desionizada a 90 °C y remover hasta que se disuelva por completo para preparar la solución de PVA. Conservar la solución en nevera (4 °C) después de enfriar a temperatura ambiente.
- Agregue 100 mg de PLGA a 10 ml de acetona y mezcla de etanol (proporción de 4: 1) para que sirva como fase oleosa.
- Coloque 20 ml de solución acuosa de PVA debajo de la campana extractora y agite magnéticamente a 400 rpm/min. Agregue 5 ml de la fase oleosa en la solución de PVA gota a gota con una bomba de jeringa. Luego, revuelva la mezcla en la campana extractora hasta que los solventes orgánicos se evaporen por completo.
NOTA: Con el aumento de la concentración de las partículas en la fase oleosa, la solución en fase acuosa se convierte gradualmente en una clara y transparente luz de color blanco azulado o blanco lechoso. - Después de la volatilización de disolventes orgánicos (2-3 h), centrifugar la mezcla a 15.000 x g. Lave tres o más veces hasta que el agua de lavado final sea clara y transparente.
NOTA: El propósito de este paso es principalmente lavar el PVA residual en la superficie de la partícula para evitar que afecte la preparación de la emulsión Pickering. - Vuelva a suspender los PNP lavados en 2 ml de agua desionizada y congele la mezcla a -80 °C durante 24 h. Posteriormente liofilizar las partículas en un liofilizador durante 48-72 h. Los PNP preparados son blancos en bandada.
- Caracterización de PNPs
- Para caracterizar el tamaño y el potencial zeta de los PNP, agregue 10 μL de PNP en 1 ml de agua desionizada para obtener una solución diluyente y transfiera la solución diluyente a una celda DTS1070. Encienda el ordenador y el analizador dinámico de dispersión de luz (DLS) y, a continuación, coloque la celda DTS1070 en el sistema DLS.
- Haga clic en el software Zeta Size y cree un nuevo archivo de medición para configurar el procedimiento de determinación. A continuación, inicie el procedimiento de determinación para obtener el tamaño de partícula y la distribución del potencial zeta.
- Para observar la morfología de los PNP, extienda uniformemente la solución de PNP de 0,1 ml (diluida 40 veces) en una lámina de papel de aluminio de 5 cm x 5 cm y deje que el agua se evapore naturalmente en una campana extractora bien ventilada durante la noche.
- Corte una pequeña parte del papel de aluminio y asegúrelo en la mesa de muestras con cinta conductora. Rocíe con oro a una corriente de 10 mA durante 120 s. Posteriormente observar la morfología superficial de la muestra mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).
2. Preparación y caracterización del PNPE
- Para preparar PNPE, agregue PNP liofilizados al agua desionizada a una concentración de 4 mg / ml (la fase acuosa) y luego agregue escualeno como fase oleosa. Prepare PNPE a través de sonicación de un solo paso durante 5 minutos a 100 W en un sonicador de baño de agua. La relación de fase aceite-agua es de 1:9.
- Caracterización del PNPE preparado
- Abra el software Mastersizer 2000 y el láser en secuencia. Haga clic en Medir para abrir el programa preestablecido y establecer el nombre de la muestra. Haga clic en Inicio para comenzar a medir el fondo de la muestra, luego, usando un gotero, agregue 1 ml de PNPE al tanque de muestra del analizador de tamaño de partícula láser para medir el tamaño de partícula de la emulsión tres veces en paralelo.
- Diluir 20 μL de PNPE en 1 mL de agua desionizada. Coloque 20 μL de la emulsión en el portaobjetos. Observar la morfología y homogeneidad de la emulsión mediante microscopía óptica a un aumento de 40x y obtener fotografías.
- Eficiencia de carga de antígenos
- Disolver 200 μg de ovoalbúmina (OVA) en 500 ml de agua desionizada. Luego mezclar con 500 mL de PNPE preparado y agitar durante 1 h a temperatura ambiente. Eliminar el antígeno fluídico por centrifugación a 5000 x g durante 20 min.
- Determinar las concentraciones de antígeno fluídico mediante ensayos de ácido bicinchonínico (ACB)27. La fórmula para calcular la eficiencia de carga de antígenos es la siguiente:
Eficiencia de carga de antígenos =
Utilice el mismo método para determinar la eficiencia de carga de antígenos de la EES que se utiliza como grupo control.
- Estabilidad del PNPE
- Divida 6 ml del PNPE preparado en seis porciones iguales y almacene tres partes a 4 °C y 25 °C, respectivamente. Diluir 20 μL de PNPE almacenado en 1 ml de agua desionizada (1:50) los días 0, 3 y 6. Luego, mida el tamaño y el potencial zeta de las soluciones madre PNPE mantenidas a diferentes temperaturas.
NOTA: Las diferentes temperaturas de almacenamiento se establecen para comparar el efecto de diferentes temperaturas en la estabilidad de PNPE, lo que puede optimizar la condición de almacenamiento para una alta estabilidad y una larga vida útil.
- Divida 6 ml del PNPE preparado en seis porciones iguales y almacene tres partes a 4 °C y 25 °C, respectivamente. Diluir 20 μL de PNPE almacenado en 1 ml de agua desionizada (1:50) los días 0, 3 y 6. Luego, mida el tamaño y el potencial zeta de las soluciones madre PNPE mantenidas a diferentes temperaturas.
- Preparación de micropartículas PLGA (PMPs)
- Disolver 500 mg de PLGA en 5 ml de diclorometano como fase oleosa, y luego verter en 50 ml de fase acuosa externa que contenga 1,5% de PVA para obtener la mezcla de aceite / agua. Homogeneizar la mezcla a 3000 rpm durante 1 min utilizando un homogeneizador para obtener emulsiones gruesas.
- Mantener la uniformidad del tamaño de partícula PLGA de las microesferas (determinado por emulsiones gruesas) mediante emulsificación de membrana. Instale una membrana de 5,2 μm en el tubo de membrana. Ajuste la presión a 800 kPa y manténgala estable.
- Abra la válvula de escape y la válvula de alimentación, y después de agregar las emulsiones gruesas al tanque de muestra, cierre la válvula de escape y la válvula de alimentación, abra la válvula de descarga y la válvula de entrada, y tome la emulsión posterior a la película en un vaso de precipitados de 200 ml. Repita el proceso tres veces para obtener emulsiones pre-dobles.
- Revuelva las emulsiones pre-dobles para evaporar el diclorometano a temperatura ambiente para curar las microesferas. Lave las microesferas con agua desionizada a 7741 x g durante 3 minutos cinco veces. Precongelar en un congelador a -80 °C y finalmente liofilizar para obtener microesferas secas.
- Caracterización de PMPs
- Abra el software Mastersizer 2000 y el láser en secuencia. Haga clic en Medir para abrir el programa preestablecido y establecer el nombre de la muestra. Haga clic en Inicio para comenzar a medir el fondo de la muestra. Luego, agregue 1 ml de PMP al tanque de adición de muestras del analizador de tamaño de partícula láser con un gotero y mida el tamaño de partícula de las micropartículas tres veces en paralelo.
- Análisis de suavidad
NOTA: PNPE se recubrió en el sensor SiO2 para medir la suavidad.- Limpie el chip sensor de cuarzo SiO 2 con tratamiento UV-ozono durante 10 minutos, enjuague dos veces con 5 ml de etanol (75% v / v) y seque con N2. Instale el chip sensor de cuarzo SiO2 vacío en la celda de flujo.
- Encienda la computadora y active el control de temperatura en la parte inferior derecha del software para asegurarse de que la temperatura establecida sea aproximadamente 1 ° C por debajo de la temperatura ambiente.
- Haga clic en el botón Adquisición en la barra de herramientas y seleccione Configurar medición para buscar las octavas 1, 3, 5, 7, 9 y 11 del chip en el canal utilizado. Haga clic en el botón Adquisición de la barra de herramientas y seleccione Iniciar medición.
- Corrija la línea base con aire y, cuando la línea base esté equilibrada, seleccione Detener y guarde el archivo como un espacio en blanco.
- Limpie el chip y gire la capa de 10 μg/ml de PNPE en el chip. Brevemente, encienda el recubridor de centrifugado y establezca el parámetro de funcionamiento. Conecte el tubo N2 al recubridor de centrifugado, ajuste el fraccionamiento del cilindro de gas a 0,4 kPa y coloque el chip limpio en la ventosa del recubridor de centrifugado. Agregue 100 μL de PNPE gota a gota al centro del sensor de SiO2 y cierre la cubierta superior del recubrimiento de centrifugado para completar el recubrimiento.
- Instale el chip recubierto PNPE en la celda de flujo. Repita los pasos 2.7.3-2.7.4 y guarde el archivo como PNPE. Abra los archivos en blanco y PNPE y haga clic en el botón Stitch para obtener los datos relacionados de disipación (ΔD).
3. Aislar y cultivar BMDC 28
NOTA: Asegúrese de que todos los reactivos y muestras se coloquen en hielo, ya que esto tiene un efecto positivo en la actividad celular. Para mantener la esterilidad, realice todos los pasos en un banco ultralimpio utilizando utensilios estériles.
- Eutanasia a los ratones C57BL / 6 (hembra, 6-8 semanas de edad) a través de la inhalación de CO2 y remojarlos en etanol al 70% (v / v) para una breve esterilización.
- Después de remojar durante 3-5 minutos, transfiera los ratones a un banco súper limpio. Retire los músculos de las piernas con tijeras de acero inoxidable para exponer el fémur y la tibia, y luego separe el fémur y la tibia.
- Llene una placa de Petri con etanol al 70% (v / v) y remoje los huesos limpios en ella durante 5-10 s para completar la esterilización externa. Limpie todos los huesos y colóquelos en un tubo estéril con hielo alrededor de ellos.
- Recorte el fémur y la tibia cerca de la articulación con tijeras. Inserte la aguja de la jeringa en el hueso para eliminar la médula ósea en un tubo de centrífuga utilizando medio RPMI preenfriado (1640).
- Enjuague dos o tres veces hasta que el hueso esté completamente blanco. Pipetear la médula ósea varias veces para separar todos los grumos. Filtrar las células en un tubo centrífugo de 15 ml utilizando un tamiz de 40 μm de diámetro.
- Centrifugar a 4 °C y 500 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y agregue 2 ml de lisado eritrocitario al sedimento durante 4 min.
- Después del lavado dos o tres veces, vuelva a suspender las células en 2 ml de medio completo (1 % de penicilina-estreptomicina, 10 % de suero bovino fetal, 20 ng / ml de IL-4 y 10 ng / ml de GM-CSF). Luego, diluya 10 μL de células en 1 ml de PBS e inserte el chip del contador de células automatizado de mano en la dilución celular para el recuento celular. Finalmente, sembrar células a una densidad de 1 x 106 células/ml en una placa de cultivo de 10 mm con un medio completo.
- Cultivar las células en una incubadora celular con 5% deCO2 a 37 °C. Cambiar el medio cada 2 días. El día 7, transfiera las células al tubo de 50 ml y centrifugar a 450 x g durante 5 minutos para recoger las células.
4. Preparación de vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs)
- Ensamble la mini-extrusora en secuencia según las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que la carcasa de la jeringa no esté agrietada antes de usarla. Asegúrese de que todas las juntas tóricas estén en buenas condiciones antes de cada experimento y reemplace las desgastadas o dañadas de inmediato. Las juntas tóricas desgastadas o dañadas pueden causar una liberación repentina de presión al operar la extrusora.
- Aspirar los BMDC repetidamente y transferirlos a un tubo de centrífuga. Cosechar las células por centrifugación a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Presurice las suspensiones celulares a través de membranas de policarbonato de 10 μm, 5 μm y 1 μm durante 30 pasadas utilizando el miniextrusor29.
NOTA: Para permitir la uniformidad del tamaño del bEV, las suspensiones BMDC se empujaron a través de membranas de policarbonato de 10 μm, 5 μm y 1 μm durante 30 pasadas. Además, durante la operación, asegúrese de aplicar la fuerza de manera uniforme y mantener la dirección de la fuerza a lo largo del eje de la jeringa. - Centrifugar los sobrenadantes agrupados durante 5 min a 1000 x g y 4 °C para eliminar las células. Recoger el sobrenadante y centrifugarlo a 3000 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar las células restantes y los restos celulares.
- Recoger el sobrenadante y centrifugarlo a 100.000 x g durante 90 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los bEV en 2 ml de solución salina tamponada con HEPES (HBS). Purificar los bEV mediante filtración a través de una membrana de 0,45 μm y almacenar los bEV purificados a -80 °C.
5. Los vehículos eléctricos se adhieren al PNPE
NOTA: El sensor SiO2 se modificó mediante el método de recubrimiento por centrifugado.
- Sensor de SiO2 modificado con poli-L-lisina (PLL).
- Limpie el chip sensor de cuarzo SiO2 con tratamiento UV-ozono durante 10 minutos, enjuague dos veces con etanol y seque conN2.
- Encienda la recubrida de centrifugado presionando el botón de encendido, presione el botón Control y ajuste el tiempo y la velocidad de recubrimiento. La velocidad de rotación inicial es de 400 rpm, que se incrementa constantemente a 5000 rpm.
- Conecte el tubo N2 a la centrifugadora y ajuste el fraccionamiento del cilindro de gas a 0,4 kPa. Coloque el chip limpio en la ventosa del recubridor de centrifugado. Agregue 100 μL de PLL gota a gota al centro del sensor de SiO2 y cierre la cubierta superior del recubridor de centrifugado.
- Pulse el botón Inicio para comenzar a recubrir la muestra y detener la máquina cuando haya terminado. Apague la bomba de vacío, apague los botones de encendido y control y retire el sensor SiO2 modificado por PLL.
NOTA: Antes de pulsar Inicio, asegúrese de que se han ajustado el tiempo y la velocidad de recubrimiento. Además, asegúrese de que el sensor de SiO2 esté colocado en el centro de la ventosa. Asegúrese de que la tapa esté cerrada antes de ejecutar el proceso para evitar accidentes.
- Determinación de la adhesión de los bEV al PNPE
- Encienda la computadora, la unidad electrónica, la bomba peristáltica y active el control de temperatura en la parte inferior derecha del software para asegurarse de que la temperatura establecida sea aproximadamente 1 ° C por debajo de la temperatura ambiente.
- Coloque los sensores de SiO2 modificados con PLL en la celda de flujo de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conecte la línea de medición entre la celda de flujo y la bomba de flujo. Coloque la celda de flujo dentro del sistema de módulo de flujo y enjuáguelos con agua ultrapura antes de comenzar los experimentos.
- Haga clic en la barra de herramientas Adquisición y seleccione Medida de configuración para buscar 1, 3, 5, 7, 9 y 11 octavas del chip en el canal utilizado. Para corregir la línea de base, haga clic en Iniciar medición para permitir que el aire ingrese al módulo de flujo hasta que la línea de base del aire sea suave. Posteriormente, fluya agua desionizada durante 10-15 minutos para permitir nuevamente el equilibrio basal de la solución.
- Bombee la solución PNPE preparada en el módulo de flujo a un caudal de 50 μL/min para lograr la adsorción de equilibrio en el sensor de SiO2 .
NOTA: El ΔF ya no cambia cuando el PNPE se bombea nuevamente al módulo de flujo, lo que indica que la superficie de los sensores de SiO2 se ha cubierto completamente con PNPE. - Bombee la solución de bEVs preparada en el módulo de flujo a un caudal de 50 μL/min para rastrear el proceso de adhesión de bEV a la superficie PNPE.
6. Análisis CLSM de la captación de antígenos
- Co-cultivo PNPE-OVA con BMDCs
- Incubar los BMDC con 1640 medios completos (1% de penicilina-estreptomicina, 10% de suero bovino fetal, 20 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de GM-CSF) durante 7 días, y luego sembrarlos en pequeñas placas láser confocales a 1 x 106 por pozo durante la noche a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Mezclar 0,5 ml de OVA marcado con Cy5 (400 μg/ml) con 0,5 ml de PNPE durante 1 h y eliminar el antígeno fluídico por centrifugación a 5000 x g durante 20 min para desarrollar la formulación de la vacuna. Después de la resuspensión con 200 μL de agua desionizada, agregue 10 μL de la formulación (OVA de 10 μg / ml) en las pequeñas placas láser confocales bajo un banco súper limpio y cocultive con BMDC durante 6 h.
- Tinción del citoesqueleto de actina
- Retire el líquido de cultivo de las células y lávelas dos veces con solución salina tamponada con fosfato precalentada (PBS; pH 7.4).
- Fijar las células con solución de formaldehído al 4% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Durante la fijación, evite los fijadores que contienen metanol, que pueden destruir la actina.
- Lave las celdas con PBS dos o tres veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una. Permeabilizar las células con 100 μL de solución Triton X-100 al 0,5% durante 5 min a temperatura ambiente. Lave las celdas con PBS dos o tres veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una nuevamente.
- Cubra las células en el plato con fondo de vidrio de las pequeñas placas láser confocales con 200 μL de solución de trabajo de faloidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para reducir la señal de fondo, agregue albúmina sérica bovina al 1% a la solución de trabajo de faloidina conjugada con FITC. Además, cubra la tapa de los pequeños platos láser confocales durante la incubación para evitar la evaporación de la solución.
- Lave las celdas con PBS tres veces durante 5 minutos cada una. Volver a teñir los núcleos con 200 μL de solución DAPI (concentración: 100 nM) durante unos 30 s.
- Análisis de imágenes
- Encienda el hardware del microscopio confocal en secuencia, incluidos el láser, el confocal, el microscopio y la computadora. Haga clic en el software NIS-Elements AR 5.20.00 y seleccione Nikon Confocal para entrar en el sistema de prueba.
- En el sistema de microscopio confocal, encienda las distintas unidades en el orden indicado. Primero, configure los canales FITC, DAPI y Cy5 y ajuste el HV y el offset correspondientes. Luego, seleccione la lente de aceite 100x y coloque una gota de aceite de cedro en la parte superior. Coloque las pequeñas placas láser confocales que contienen BMDC teñidas en la plataforma del microscopio.
- Haga clic en el botón Escanear . Bajo un microscopio de fluorescencia, localice las células de interés moviendo el eje X, el eje Y y el eje Z. Sintoniza la intensidad del láser, el tamaño de la imagen y otros parámetros para permitir el escaneo de imágenes confocales de alta calidad. Finalmente, haga clic en el botón Capturar y guarde las imágenes.
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Representative Results
Se utilizó una sonificación simple de un solo paso para obtener PNPE. Primero, preparamos PNP uniformes para su uso como estabilizador sólido (Figura 1A). La morfología de las PNP se observó a través de SEM, mostrando que son en su mayoría uniformes y esféricas (Figura 1B). El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las formulaciones se detectaron a través de DLS. El diámetro de las PNPs fue de 187,7 ± 3,5 nm y el potencial zeta fue de -16,4 ± 0,4 mV (Figura 1C y Tabla Complementaria 1). Para preparar PNPE, la mezcla de solución de PNP (0,4%, p/v) y escualeno se sonicó simplemente a 100 w durante 5 min (Figura 1D). Después de la optimización de la fase continua, el PNPE obtenido fue compuesto internamente de escualeno y adsorbido externamente con PNPs (Figura Suplementaria 1). Se empleó un microscopio óptico para observar las gotas de emulsión, y se utilizó el analizador de tamaño de partículas Mastersizer para determinar la distribución del tamaño. PNPE no mostró menos partículas para evitar la coalescencia de las emulsiones y no más partículas en exceso en la fase continua que causan los agregados más grandes (Figura 1E). Como se muestra en la Figura 1F y la Tabla Suplementaria 1, el tamaño de la emulsión fue de 2100 ± 300 nm y el potencial zeta fue de -27.1 ± 0.5 mV, lo que indica que las partículas se agregaron en la interfaz aceite / agua. Para observar la captación celular del antígeno, el OVA Cy5-labled se adsorbió en el PNPE. Para empezar, se mezclaron 500 μL de PNPE con el OVA marcado con Cy5 de 500 μL a temperatura ambiente durante 1 h. La absorción de antígenos en las formulaciones se probó mediante el ensayo BCA. Debido a su alta superficie específica e hidrofobicidad, más del 70,6% de los antígenos fluídicos se adsorbieron en el PNPE en 1 h, lo que indica un potencial sustancial para cargar grandes cantidades de antígenos en poco tiempo. Como grupo control, también se caracterizaron las PMP y la ESS. Los PMP eran comparables en tamaño (1987 ± 310 nm) al PNPE. El SSE fue una emulsión cargada negativamente (-15,9 ± 0,8 mV) con un diámetro de 147,2 ± 0,5 nm. Además, la eficiencia de carga de PMPs y SSE fue de sólo 25,6% ± 0,6% y 23,4% ± 0,2%, respectivamente debido a la limitada adsorción con antígenos (Tabla complementaria 1). Además, para evaluar la estabilidad del PNPE, el PNPE preparado se almacenó a 4 °C y 25 °C, respectivamente. El tamaño y el potencial zeta de la solución madre se determinaron en los días 0-6 (dilución 1:50). Como se muestra en la Figura complementaria 2, las gotitas permanecieron similares en tamaño y el potencial zeta durante el almacenamiento a 4 °C y 25 °C sugirió una mayor estabilidad del PNPE para la administración de antígenos. Luego se utilizó el QCM-D para medir la flexibilidad del PNPE. Como se muestra en la Figura 1G, como resultado de su estructura rígida, los PMP exhibieron una menor disipación (ΔD). Al mismo tiempo, PNPE tenía un ΔD significativamente más alto, lo que demuestra su excelente viscoelasticidad y flexibilidad, lo que puede ser una de las razones para mejorar la unión y absorción celular.
Para validar la afinidad de PNPE con la membrana de BMDC, los bEV se utilizaron para reemplazar las células intactas debido a su tamaño de ajuste para la detección precisa de QCM-D. En este proceso, los BMDC maduros se cosecharon y se extruyeron en serie a través de filtros de membrana de policarbonato que contenían tamaños de poro de 10, 5 y 1 μm para preparar vesículas de tamaño nanométrico. Los bEV obtenidos se recogieron y purificaron mediante ultracentrifugación y se resuspendieron en solución salina tamponada HEPES (Figura 2A). La morfología de los bEV teñidos negativamente se exploró utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Se utilizó un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para probar el tamaño de los bEV. Los resultados revelaron que los bEV eran formas vesiculares cerradas con bicapas lipídicas y la distribución era homogénea (Figura 2B). NTA mostró que la distribución de tamaño de los bEV con diámetro máximo de los bEV purificados fue de 131 nm (Figura 2C). Por lo tanto, concluimos que los bEV eran una estructura de membrana típica con distribución uniforme, lo que permitió una mayor precisión en el ensayo QCM-D como sustituto de los BMDC.
A continuación, se rastreó la adhesión de los bEV a PNPE utilizando QCM-D. En primer lugar, el sensor QCM-D SiO2 se modificó con PLL para conferir una carga positiva para posteriormente fijar PNPE en la superficie y simular el proceso de biointerfase. Inmediatamente se añadió la solución de bEV en la cámara para dilucidar la interacción entre PNPE y bEVs (Figura 3A). Como se muestra en la Figura 3B, la disminución inmediata de la frecuencia (ΔF) indicó una rápida adhesión de los bEV a la PNPE después del encuentro. Además, el ΔF disminuyó con el aumento de la concentración de bEV, lo que refleja un efecto dependiente de la concentración. PNPE tiene una superficie densamente empaquetada para soportar el lugar de aterrizaje; además, exhibió cambios de curvatura dinámica y difusión lateral para un contacto celular potente, lo que resultó en una alta afinidad con los BMDC. En contraste, las PMP y la SSE se unieron débilmente a los bEV, incluso a altas concentraciones (80 μg / ml), lo que probablemente resultó de la falta de sitios de contacto con las células inmunes (Figura 3C).
Después de confirmar el proceso de adhesión a los BMDC, se utilizó PNPE para administrar antígeno a los BMDC. Para visualizar directamente los perfiles de internalización de antígenos in vitro, se mezcló OVA marcada con Cy5 con PMP, SSE y PNPE para tratar con BMDC, respectivamente. Después de 6 h después del tratamiento, se realizó CLSM para analizar la captación celular de OVA marcada con Cy5 en BMDC. Como se muestra en la Figura 4A, la señal de fluorescencia Cy5-OVA indicó que la cantidad total de antígeno internalizado en las células es significativamente mayor en el grupo tratado con PNPE en comparación con el grupo de PMP y SSE. Además, se realizó el análisis cuantitativo de la captación celular, mostrando una intensidad relativa significativamente mayor de fluorescencia en las CMOO tratadas con PNPE que en las tratadas con PMP y SSE (p < 0,001), lo que corroboró la observación anterior (Figura 4B). Los resultados obtenidos demostraron que el PNPE promovió la internalización del antígeno y administró eficazmente el antígeno intracelularmente. En consecuencia, la eficiencia de absorción de antígenos se asoció positivamente con la afinidad del sistema de administración a las células objetivo, y PNPE aumentó efectivamente la captación celular de antígenos a través del contacto multinivel con la membrana celular.
Figura 1: Caracterización de la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas de PLGA. (A) Esquema del procedimiento experimental utilizado para la preparación de nanopartículas de PLGA (PNPs). (B) Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de PNP. Barra de escala = 200 nm. (C) Distribución de tamaño de PNPs. (D) Esquema del procedimiento experimental utilizado para la preparación de emulsión Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE). (E) Micrografías ópticas de PNPE. Barra de escala = 20 μm. (F) Distribución del tamaño del PNPE. (G) Microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D) análisis sobre la suavidad de PNPE, micropartículas PLGA (PMP) y emulsión estabilizada con surfactante (SSE) a través de la detección de disipación (ΔD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de vesículas extracelulares biomiméticas. (A) Esquema del procedimiento experimental utilizado para la preparación de vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs). (B) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de bEVs. Barra de escala = 200 nm. (C) Distribución del tamaño de los bEV medidos mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Afinidad de PNPE a bEVs analizados usando QCM-D . (A) Esquema de la modificación de la superficie de PLL a través del recubrimiento PNPE. (B) Cambios en la frecuencia (ΔF) de PNPE después de encontrarse con diferentes concentraciones de bEVs. (C) Comparación de los cambios en ΔF en micropartículas de PLGA (PMP), emulsión estabilizada con surfactante (SSE) y PNPE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Captación de antígenos. (A) Diagrama representativo de la captación celular de antígenos. Barra de escala = 20 μm. (B) Fluorescencia de intensidad relativa de la captación celular de antígenos. El gráfico muestra la media ± SEM de tres experimentos independientes. Se utilizó ANOVA unidireccional para analizar la significación de las diferencias observadas. p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: La optimización de la fase continua. (A) Micrografías ópticas de PNPE construidas por diferentes fases continuas. Barra de escala = 20 μm. (B) Los tamaños de las emulsiones se detectaron después de la preparación. Los resultados se expresaron como media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: La estabilidad del PNPE. Tamaño (A) y potencial zeta (B) de PNPE después de 0, 3 y 6 días de almacenamiento a las temperaturas indicadas. Los datos se demostraron como media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 1: Caracterizaciones de las formulaciones. Los PNP, el PNPE y la ESS se prepararon de acuerdo con el protocolo indicado. Las distribuciones de tamaño y el potencial zeta se determinaron mediante el analizador dinámico de dispersión de luz (DLS) o el analizador de tamaño de partículas Mastersizer. La eficiencia de carga se evaluó mediante el ensayo BCA. Los datos se demostraron como media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Desarrollamos una emulsión de aceite/agua estabilizada con nanopartículas de PLGA como un sistema de administración para mejorar la internalización de antígenos. El PNPE preparado poseía una superficie densamente empaquetada para soportar el lugar de aterrizaje y una suavidad y fluidez únicas para un potente contacto celular con la membrana celular inmune. Además, la interfaz aceite/agua ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, y el PLGA anfifílico confería PNPE con alta estabilidad para el transporte de antígenos a las células inmunes. El PNPE podría adherirse rápidamente a la superficie de las células, lo que indica que la emulsión estabilizada con nanopartículas PLGA tiene una fuerte afinidad con la membrana celular para la absorción celular. Además, PNPE tenía un alto perfil de seguridad porque tanto el escualeno como el PLGA son ingredientes30 aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), lo que se espera que aproveche la transferencia segura a la clínica.
El peso molecular del PLGA y el tipo de fases continuas y dispersas afectaron las propiedades del PNPE, incluyendo la estabilidad y la hidrofobicidad. En esta investigación, se seleccionaron nanopartículas de PLGA de peso molecular de 17 kDa como estabilizador y escualeno como fase dispersa, lo que resultó en una mayor estabilidad. Además, el agua desionizada como fase continua simplificó la composición de la formulación. Bajo esta condición, PNPE permitió el ensamblaje eficiente de antígenos y promovió la entrega de antígenos a las células inmunes. Además, se utilizó el método de sonicación de un solo paso para preparar PNPE, lo que eliminó el tedioso proceso y evitó la posibilidad de contaminación. Es esencial tener en cuenta que el sistema de administración compuesto de PNP y escualeno debe ser una fuerza uniforme, de lo contrario no se forma emulsión o el PNPE preparado no es uniforme en tamaño.
Si bien estudiar la afinidad del sistema de entrega a las células fue un desafío extraordinario realizado in vivo, los estudios in vitro podrían ayudar a dilucidar el proceso involucrado en la adhesión e internalización celular. Recientemente, este problema ha recibido mucha atención en el campo biomédico. Se han realizado esfuerzos sustanciales para arrojar luz sobre la afinidad de las partículas con las células utilizando citometría de flujo y análisis CLSM31,32. Si bien estos métodos proporcionan una lectura promedio a nivel celular, los procesos específicos de unión dinámica entre las células y los sistemas de administración no se monitorean fácilmente. En contraste, QCM depende principalmente de un cristal piezoeléctrico sensible que el ΔF cambia con la masa. La capacidad de detectar cambios de masa diminutos permite a QCM-D monitorear las interacciones moleculares específicas. La técnica puede ser utilizada para monitorear eventos en tiempo real, permitiendo el estudio de la afinidad de PNPE con BMDC bajo diferentes condiciones33.
La adhesión a PNPE se investigó utilizando bEVs en lugar de células intactas. Como los APC simples bien controlados, se cree que los bEV heredan la mayoría de las características de las células madre. En general, las vesículas extracelulares con tamaños de partícula pequeños y homogéneos funcionan mejor en los ensayos de adhesión. Así, los bEVs fueron preparados por extrusión a través de filtros de policarbonato con tamaños de poro de 10, 5 y 1 μm34. El diámetro y el rendimiento de los bEV podrían controlarse regulando el número de extrusiones y el tamaño de poro de las membranas de policarbonato. Se recomienda hacer 30 pasadas a través de las membranas de policarbonato. Sin embargo, este método también tenía una limitación en que parte de la membrana puede invertirse, haciendo que las proteínas en la superficie de CC se encapsulen en los bEV, lo que disminuyó ligeramente la afinidad con las emulsiones.
Se demostró que la modificación de las superficies del sensor deSiO2 utilizando proteínas cargadas positivamente era adecuada para el posterior recubrimiento PNPE. La implementación descrita de PLL (polipéptido policatiónico) como la capa intermedia entre las superficies del sensor de SiO2 y PNPE demostró ser una mejora para el método de recubrimiento rápido. Los cambios en la masa causados por cualquier evento, por ejemplo, adsorciones no específicas de cualquier componente del flujo de solución en el sensor deSiO2 , podrían afectar la precisión de los resultados experimentales35. Por lo tanto, era necesario asegurarse de que el PLL conservara una calidad constante en el chip después del recubrimiento por centrifugado, y su superficie estuviera completamente cubierta por PNPE para evitar el error de medición causado por la adsorción inespecífica. Al mismo tiempo, cuando ΔF ya no cambiaba durante el contacto con la fase móvil que contenía PNPE, la superficie del chip se consideraba completamente cubierta. Esto aseguró que las señales detectadas fueran generadas por la adhesión de bEVs al PNPE. Demostramos que QCM-D era un buen método para mostrar la adhesión de bEV a PNPE en tiempo real, reflejando la alta afinidad de PNPE con APC. Desafortunadamente, este método no pudo reflejar la interacción entre las células individuales y el sistema de administración. Por lo tanto, una determinación más precisa requerirá un mayor diseño del protocolo y la optimización del procedimiento de medición.
Después de evaluar la alta afinidad de PNPE con bEV, se verificó aún más la internalización mejorada. Demostramos que la potente captación celular de antígenos se correlacionaba con la alta afinidad de PNPE. PNPE poseía la estructura multinivel para la carga efectiva de antígenos y flexibilidad para el contacto multinivel con la membrana celular para mejorar la entrega. Por lo tanto, la emulsión Pickering diseñada racionalmente estimuló la internalización celular y las vías intracelulares a través de la interacción robusta con la membrana celular. Una vez demostradas estas ventajas, PNPE puede arrojar luz sobre el desarrollo de sistemas de administración de antígenos novedosos, seguros y eficientes para mejorar las vacunas.
Este protocolo demostró con éxito la alta afinidad de PNPE a la bicapa de fosfolípidos de las células inmunes y la posterior administración intracelular del antígeno a las células inmunes in vitro. Por lo tanto, se pueden administrar y caracterizar varios tipos de antígenos de diferentes patógenos utilizando el protocolo propuesto para conferir protección contra enfermedades infecciosas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), De 0 a 1 Proyecto de Innovación Original del Programa de Investigación Científica Básica de Frontera de la Academia China de Ciencias (ZDBS-LY-SLH040), la Fundación para Grupos de Investigación Innovadores de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
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