Summary
Um effiziente Adjuvantien rational zu gestalten, haben wir die Poly-Milchsäure-Co-Glykolsäure-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) entwickelt. Das PNPE besaß eine einzigartige Weichheit und eine hydrophobe Schnittstelle für einen potenten zellulären Kontakt und bot eine Antigenladung mit hohem Gehalt, was die zelluläre Affinität des Abgabesystems zu Antigen-präsentierenden Zellen verbesserte und eine effiziente Internalisierung von Antigenen induzierte.
Abstract
Die zelluläre Affinität von Mikro-/Nanopartikeln ist die Voraussetzung für zelluläre Erkennung, zelluläre Aufnahme und Aktivierung, die für die Wirkstoffabgabe und Immunantwort unerlässlich sind. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass die Auswirkungen von Ladung, Größe und Form fester Partikel auf die Zellaffinität normalerweise berücksichtigt werden, aber wir erkennen selten die wesentliche Rolle von Weichheit, dynamischem Umstrukturierungsphänomen und komplexer Grenzflächeninteraktion in der Zellaffinität. Hier entwickelten wir die Polymilch-Co-Glykolsäure (PLGA) nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE), die die Mängel starrer Formen überwand und die Flexibilität und Fließfähigkeit von Krankheitserregern simulierte. Es wurde eine Methode entwickelt, um die Affinität von PNPE zu Zelloberflächen zu testen und die anschließende Internalisierung durch Immunzellen zu erarbeiten. Die Affinität von PNPE zu biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs) - dem Ersatz für dendritische Knochenmarkzellen (BMDCs) - wurde unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) bestimmt, die eine Echtzeitüberwachung der Zellemulsionsadhäsion ermöglichte. Anschließend wurde das PNPE verwendet, um das Antigen (Ovalbumin, OVA) zu verabreichen, und die Aufnahme der Antigene durch BMDCs wurde mit konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) beobachtet. Repräsentative Ergebnisse zeigten, dass die PNPE sofort die Frequenz (ΔF) verringerte, wenn sie auf die bEVs traf, was auf eine schnelle Adhäsion und eine hohe Affinität der PNPE zu den BMDCs hindeutet. PNPE zeigte eine signifikant stärkere Bindung an die Zellmembran als PLGA-Mikropartikel (PMPs) und AddaVax-Adjuvans (bezeichnet als tensidstabilisierte Nanoemulsion [SSE]). Darüber hinaus wurde aufgrund der erhöhten zellulären Affinität zu den Immunzyten durch dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen die Antigenaufnahme im Vergleich zu PMPs und SSE gesteigert. Dieses Protokoll liefert Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Formulierungen mit hoher Zellaffinität und effizienter Antigeninternalisierung und bietet eine Plattform für die Entwicklung effizienter Impfstoffe.
Introduction
Zur Bekämpfung epidemischer, chronischer und infektiöser Krankheiten ist es unerlässlich, wirksame Adjuvantien für prophylaktische und therapeutische Impfungen zu entwickeln 1,2. Idealerweise sollten die Adjuvantien eine ausgezeichnete Sicherheit und Immunaktivierungbesitzen 3,4,5. Es wird angenommen, dass die effektive Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) ein wesentliches Stadium in den nachgeschalteten Signalkaskaden und der Initiierung der Immunantwortist 6,7,8. Daher sind ein klares Verständnis des Mechanismus der Interaktion von Immunzellen mit Antigenen und die Entwicklung von Adjuvantien zur Verbesserung der Internalisierung effiziente Strategien, um die Effizienz von Impfstoffen zu verbessern.
Mikro-/Nanopartikel mit einzigartigen Eigenschaften wurden zuvor als Antigenabgabesysteme untersucht, um die zelluläre Aufnahme von Antigenen und die zelluläre Interaktion mit pathogenassoziierten molekularen Mustern zu vermitteln 9,10. Bei Kontakt mit Zellen beginnen Abgabesysteme mit der extrazellulären Matrix und Zellmembran zu interagieren, was zur Internalisierung und nachfolgenden zellulären Reaktionen führte11,12. Frühere Studien haben ans Licht gebracht, dass die Internalisierung von Partikeln durch Zellmembran-Partikel-Adhäsion13 erfolgt, gefolgt von flexibler Verformung der Zellmembran und Diffusion des Rezeptors zur Oberflächenmembran14,15. Unter diesen Umständen hängen die Eigenschaften des Verabreichungssystems von der Affinität zu APCs ab, die sich anschließend auf die Aufnahmemenge16,17 auswirken.
Um Erkenntnisse über das Design des Abgabesystems für eine verbesserte Immunantwort zu gewinnen, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um den Zusammenhang zwischen den Eigenschaften von Partikeln und der zellulären Aufnahme zu untersuchen. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass feste Mikro-/Nanopartikel mit unterschiedlichen Ladungen, Größen und Formen oft in diesem Licht untersucht werden, während die Rolle der Fluidität bei der Antigeninternalisierung selten untersucht wird18,19. Tatsächlich zeigten die weichen Partikel während der Adhäsion dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen, um die Kontaktfläche für multivalente Wechselwirkungen zu vergrößern, die von den festen Partikeln kaum repliziert werden können20,21. Darüber hinaus sind Zellmembranen Phospholipiddoppelschichten (Sphingolipide oder Cholesterin) an der Aufnahmestelle, und hydrophobe Substanzen können die Konformationsentropie von Lipiden verändern und die für die zelluläre Aufnahme erforderliche Energiemenge verringern22,23. Daher kann die Verstärkung der Mobilität und die Förderung der Hydrophobie des Abgabesystems eine wirksame Strategie zur Stärkung der Antigeninternalisierung sein, um die Immunantwort zu verbessern.
Pickering-Emulsion, stabilisiert durch feste Partikel, die an der Grenzfläche zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten angeordnet sind, sind im biologischen Bereich weit verbreitet24,25. Tatsächlich bestimmen die aggregierenden Partikel an der Öl-Wasser-Grenzfläche die Formulierung von mehrstufigen Strukturen, die mehrstufige Verabreichungssystem-zelluläre Interaktionen fördern und weitere multifunktionale physikalisch-chemische Eigenschaften bei der Wirkstoffabgabe induzieren. Aufgrund ihrer Verformbarkeit und lateralen Beweglichkeit wurde erwartet, dass Pickering-Emulsionen in multivalente zelluläre Interaktion mit den Immunzyten eintreten und von den Membranproteinen26 erkannt werden. Da ölige Mizellenkerne in Pickering-Emulsionen nicht vollständig mit festen Partikeln bedeckt sind, besitzen Pickering-Emulsionen unterschiedlich große Lücken zwischen Partikeln an der Öl-Wasser-Grenzfläche, die eine höhere Hydrophobie verursachen. Daher ist es entscheidend, die Affinität von Pickering-Emulsionen zu APCs zu untersuchen und die anschließende Internalisierung zu erarbeiten, um effiziente Adjuvantien zu entwickeln.
Basierend auf diesen Überlegungen entwickelten wir eine PLGA-nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) als Fluiditäts-Impfstoffverabreichungssystem, das auch dazu beitrug, wertvolle Erkenntnisse über die Affinität des PNPE zu BMDCs und die zelluläre Internalisierung zu gewinnen. Die Echtzeit-Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs; ein Ersatz von BMDCs) an PNPE wurde über eine markierungsfreie Methode unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) überwacht. Nach der Charakterisierung der Affinität von PNPE zu BMDCs wurde die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verwendet, um die Antigenaufnahme zu bestimmen. Das Ergebnis zeigte die höhere Affinität von PNPE zu BMDCs und die effiziente Internalisierung des Antigens. Wir erwarteten, dass die PNPE eine höhere Affinität zu APCs aufweisen würde, was die Internalisierung von Antigenen besser stimulieren könnte, um die Immunantwort zu verstärken.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institut für Verfahrenstechnik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigt. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und der Richtlinie für die ethische Überprüfung von Tieren (China, GB/T35892-2018) durchgeführt.
1. Herstellung und Charakterisierung von PLGA-Nanopartikeln
- Herstellung von PLGA-Nanopartikeln (PNPs)
- 0,5 g Polyvinylalkohol (PVA) werden zu 120 ml entionisiertem Wasser bei 90 °C gegeben und gerührt, bis sie vollständig aufgelöst sind, um die PVA-Lösung herzustellen. Lagern Sie die Lösung nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur im Kühlschrank (4 °C).
- Fügen Sie 100 mg PLGA zu 10 ml Aceton und Ethanolgemisch (Verhältnis 4: 1) hinzu, um als Ölphase zu dienen.
- 20 ml PVA-wässrige Lösung unter den Abzug geben und bei 400 U/min magnetisch rühren. Geben Sie 5 mL der Ölphase Tropfen für Tropfen mit einer Spritzenpumpe in die PVA-Lösung. Dann rühren Sie die Mischung in den Abzug, bis die organischen Lösungsmittel vollständig verdampft sind.
HINWEIS: Mit der Erhöhung der Konzentration der Partikel in der Ölphase verwandelt sich die Wasserphasenlösung allmählich in ein klares und transparentes hellbläulich-weißes oder milchiges Weiß. - Nach der Verflüchtigung organischer Lösungsmittel (2-3 h) zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 x g. Waschen Sie drei oder mehrmals, bis das endgültige Waschwasser klar und transparent ist.
HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht hauptsächlich darin, das restliche PVA auf der Partikeloberfläche abzuwaschen, um zu verhindern, dass es die Pickering-Emulsionszubereitung beeinträchtigt. - Die gewaschenen PNPs werden in 2 mL entionisiertem Wasser erneut suspendiert und das Gemisch bei -80 °C für 24 h eingefroren. Anschließend gefriertrocknen Sie die Partikel in einem Gefriertrockner für 48-72 h. Die vorbereiteten PNPs sind weiß flockig.
- Charakterisierung von PNPs
- Um die Größe und das Zetapotential von PNPs zu charakterisieren, fügen Sie 10 μL PNPs in 1 ml entionisiertes Wasser hinzu, um Verdünnungslösung zu erhalten, und überführen Sie die Verdünnungslösung in eine DTS1070-Zelle. Schalten Sie den Computer und den dynamischen Lichtstreuanalysator (DLS) ein, und setzen Sie die DTS1070-Zelle in das DLS-System ein.
- Klicken Sie auf die Zeta Size Software und erstellen Sie eine neue Messdatei, um das Bestimmungsverfahren einzurichten. Starten Sie dann das Bestimmungsverfahren, um die Partikelgröße und Zetapotentialverteilung zu erhalten.
- Um die Morphologie der PNPs zu beobachten, verteilen Sie die 0,1 ml PNPs-Lösung (40-fach verdünnt) gleichmäßig auf einer 5 cm x 5 cm großen Zinnfolienfolie und lassen Sie das Wasser über Nacht in einem gut belüfteten Abzug auf natürliche Weise verdunsten.
- Schneiden Sie einen kleinen Teil der Zinnfolie aus und sichern Sie sie mit leitfähigem Klebeband auf dem Probentisch. Besprühen Sie es mit Gold bei einem Strom von 10 mA für 120 s. Anschließend wird die Oberflächenmorphologie der Probe mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) beobachtet.
2. Herstellung und Charakterisierung von PNPE
- Um PNPE herzustellen, fügen Sie gefriergetrocknete PNPs zu entionisiertem Wasser in einer Konzentration von 4 mg / ml (der wässrigen Phase) hinzu und fügen Sie dann Squalen als Ölphase hinzu. Bereiten Sie PNPE über eine einstufige Beschallung für 5 min bei 100 W in einem Wasserbadsonikator vor. Das Öl-Wasser-Phasenverhältnis beträgt 1:9.
- Charakterisierung der hergestellten PNPE
- Öffnen Sie die Mastersizer 2000-Software und den Laser nacheinander. Klicken Sie auf Messen , um das voreingestellte Programm zu öffnen und den Beispielnamen festzulegen. Klicken Sie auf Start , um mit der Messung des Hintergrunds der Probe zu beginnen, und geben Sie dann mit einem Tropfer 1 ml PNPE in den Probentank des Laser-Partikelgrößenanalysators, um die Partikelgröße der Emulsion dreimal parallel zu messen.
- Verdünnen Sie 20 μL PNPE in 1 ml entionisiertem Wasser. Geben Sie 20 μL der Emulsion auf den Objektträger. Beobachten Sie die Morphologie und Homogenität der Emulsion mit optischer Mikroskopie bei 40-facher Vergrößerung und erhalten Sie Fotos.
- Antigen-Ladeeffizienz
- 200 μg Ovalbumin (OVA) werden in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst. Dann mischen Sie es mit 500 mL vorbereitetem PNPE und schütteln Sie es für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das fluidische Antigen durch Zentrifugation bei 5000 x g für 20 min.
- Bestimmung der fluidischen Antigenkonzentrationen mit Hilfe von Bicinchoninsäure (BCA)-Assays27. Die Formel zur Berechnung der Antigenbelastungseffizienz lautet wie folgt:
Antigen-Ladeeffizienz =
Verwenden Sie dieselbe Methode, um die Antigenladeeffizienz der SSE zu bestimmen, die als Kontrollgruppe verwendet wird.
- Stabilität von PNPE
- 6 ml des vorbereiteten PNPE werden in sechs gleiche Portionen aufgeteilt und jeweils drei Teile bei 4 °C bzw. 25 °C gelagert. Verdünnen Sie 20 μL gespeichertes PNPE in 1 ml entionisiertes Wasser (1:50) an Tag 0, 3 und 6. Messen Sie dann die Größe und das Zetapotenzial der PNPE-Stammlösungen, die bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden.
HINWEIS: Die unterschiedlichen Lagertemperaturen sind so eingestellt, dass die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturen auf die Stabilität von PNPE verglichen werden, wodurch die Lagerbedingungen für hohe Stabilität und lange Haltbarkeit optimiert werden können.
- 6 ml des vorbereiteten PNPE werden in sechs gleiche Portionen aufgeteilt und jeweils drei Teile bei 4 °C bzw. 25 °C gelagert. Verdünnen Sie 20 μL gespeichertes PNPE in 1 ml entionisiertes Wasser (1:50) an Tag 0, 3 und 6. Messen Sie dann die Größe und das Zetapotenzial der PNPE-Stammlösungen, die bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden.
- Herstellung von PLGA-Mikropartikeln (PMPs)
- 500 mg PLGA werden in 5 ml Dichlormethan als Ölphase gelöst und dann in 50 ml externe wässrige Phase mit 1,5% PVA gegossen, um das Öl-Wasser-Gemisch zu erhalten. Homogenisieren Sie die Mischung bei 3000 U/min für 1 min mit einem Homogenisator, um grobe Emulsionen zu erhalten.
- Aufrechterhaltung der Gleichmäßigkeit der PLGA-Partikelgröße von Mikrokugeln (bestimmt durch Grobemulsionen) durch Membranemulgierung. Installieren Sie eine 5,2 μm Membran im Membranrohr. Stellen Sie den Druck auf 800 kPa ein und halten Sie ihn ruhig.
- Öffnen Sie das Auslassventil und das Zuführventil, und nachdem Sie die groben Emulsionen in den Probenbehälter gegeben haben, schließen Sie das Auslassventil und das Zuführventil, öffnen Sie das Auslassventil und das Einlassventil und nehmen Sie die Nachfilmemulsion in ein 200-ml-Becherglas. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um Pre-Double-Emulsionen zu erhalten.
- Rühren Sie die Pre-Double-Emulsionen um, um das Dichlormethan bei Raumtemperatur zu verdampfen, um die Mikrokugeln auszuhärten. Waschen Sie die Mikrokugeln mit entionisiertem Wasser bei 7741 x g für 3 min fünfmal. Im Gefrierschrank bei -80 °C vorgefrieren und schließlich gefriertrocknen, um getrocknete Mikrosphären zu erhalten.
- Charakterisierung von PMPs
- Öffnen Sie die Mastersizer 2000-Software und den Laser nacheinander. Klicken Sie auf Messen , um das voreingestellte Programm zu öffnen und den Beispielnamen festzulegen. Klicken Sie auf Start , um mit der Messung des Hintergrunds der Probe zu beginnen. Geben Sie dann 1 ml PMPs in den Probenbehälter des Laser-Partikelgrößenanalysators mit einem Tropfer und messen Sie die Partikelgröße der Mikropartikel dreimal parallel.
- Weichheitsanalyse
HINWEIS: PNPE wurde auf denSiO2-Sensor aufgebracht, um die Weichheit zu messen.- Reinigen Sie den SiO-2-Quarzsensorchip durch UV-Ozon-Behandlung für 10 min, spülen Sie ihn zweimal mit 5 mL Ethanol (75% v / v) ab und trocknen Sie ihn mit N2. Einbau des leeren SiO2-Quarzsensorchips in die Durchflusszelle.
- Schalten Sie den Computer ein und aktivieren Sie die Temperaturregelung unten rechts in der Software, um sicherzustellen, dass die eingestellte Temperatur etwa 1 °C unter der Raumtemperatur liegt.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassung in der Symbolleiste und wählen Sie Messung einrichten , um nach den 1, 3, 5, 7, 9 und 11 Oktaven des Chips im verwendeten Kanal zu suchen. Klicken Sie in der Symbolleiste auf die Schaltfläche Erfassung und wählen Sie Messung starten.
- Korrigieren Sie den Basisplan mit Luft, und wenn der Basisplan ausgeglichen ist, wählen Sie Beenden aus, und speichern Sie die Datei als leer.
- Reinigen Sie den Chip und beschichten Sie 10 μg/ml PNPE auf dem Chip. Schalten Sie kurz den Spin Coater ein und stellen Sie den Betriebsparameter ein. Verbinden Sie dasN2-Rohr mit dem Schleuderbeschichter, stellen Sie die Fraktionierung der Gasflasche auf 0,4 kPa ein und legen Sie den sauberen Chip auf den Saugnapf des Schleuderbeschichters. Geben Sie 100 μL PNPE tropfenweise in die Mitte desSiO2-Sensors und schließen Sie die obere Abdeckung des Schleuderbeschichters, um die Beschichtung abzuschließen.
- Setzen Sie den PNPE-beschichteten Chip in die Durchflusszelle ein. Wiederholen Sie die Schritte 2.7.3-2.7.4 und speichern Sie die Datei als PNPE. Öffnen Sie sowohl die leere als auch die PNPE-Datei und klicken Sie auf die Schaltfläche Stitch, um die zugehörigen Daten der Dissipation (ΔD) zu erhalten.
3. Isolierung und Kultur BMDCs 28
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien und Proben auf Eis gelegt werden, da sich dies positiv auf die Zellaktivität auswirkt. Um die Sterilität zu erhalten, führen Sie alle Schritte auf einer ultrasauberen Bank mit sterilen Utensilien durch.
- Euthanasieren Sie die C57BL / 6 (weiblich, 6-8 Wochen alt) Mäuse durch CO2 -Inhalation und tränken Sie sie in Ethanol 70% (v / v) für eine kurze Sterilisation.
- Nach dem Einweichen für 3-5 min die Mäuse auf eine super saubere Bank geben. Entfernen Sie die Beinmuskulatur mit einer Edelstahlschere, um Femur und Tibia freizulegen, und trennen Sie dann Femur und Tibia.
- Füllen Sie eine Petrischale mit 70% (v / v) Ethanol und weichen Sie die sauberen Knochen für 5-10 s darin ein, um die externe Sterilisation abzuschließen. Reinigen Sie alle Knochen und legen Sie sie in eine sterile Röhre mit Eis um sie herum.
- Schneiden Sie den Femur und die Tibia in der Nähe des Gelenks mit einer Schere. Führen Sie die Spritzennadel in den Knochen ein, um das Knochenmark mit vorgekühltem RPMI-Medium (1640) in ein Zentrifugenröhrchen auszuspülen.
- Spülen Sie zwei- oder dreimal aus, bis der Knochen vollständig weiß ist. Pipettieren Sie das Knochenmark mehrmals, um alle Klumpen zu trennen. Filtern Sie die Zellen mit einem Sieb mit einem Durchmesser von 40 μm in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren bei 4 °C und 500 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 2 ml Erythrozytenlysat für 4 min in das Sediment.
- Nach zwei- oder dreimaligem Waschen werden die Zellen in 2 ml vollständigem Medium (1 % Penicillin-Streptomycin, 10 % fötales Rinderserum, 20 ng/ml IL-4 und 10 ng/ml GM-CSF) resuspendiert. Dann verdünnen Sie 10 μL Zellen in 1 ml PBS und führen Sie den Chip des tragbaren automatisierten Zellzählers zur Zellzählung in die Zellverdünnung ein. Schließlich werden Keimzellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml in eine 10 mm Kulturschale mit einem vollständigen Medium gepflanzt.
- Kultur der Zellen in einem Zellinkubator mit 5%CO2 bei 37 °C. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. Am Tag 7 die Zellen in ein 50-ml-Röhrchen überführen und bei 450 x g für 5 Minuten zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln.
4. Herstellung biomimetischer extrazellulärer Vesikel (bEV)
- Montieren Sie den Mini-Extruder nacheinander gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das Spritzengehäuse nicht rissig ist, bevor Sie es verwenden. Stellen Sie vor jedem Versuch sicher, dass alle O-Ringe in gutem Zustand sind, und ersetzen Sie abgenutzte oder beschädigte umgehend. Verschlissene oder beschädigte O-Ringe können beim Betrieb des Extruders zu einer plötzlichen Druckentlastung führen.
- Die BMDCs wiederholt absaugen und in ein Zentrifugenröhrchen überführen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Druckbeaufschlagung der Zellsuspensionen durch 10 μm, 5 μm und 1 μm Polycarbonatmembranen für 30 Durchgänge mit dem Mini-Extruder29.
HINWEIS: Um die Gleichmäßigkeit der bEV-Größe zu ermöglichen, wurden die BMDC-Suspensionen für 30 Durchgänge durch 10 μm, 5 μm und 1 μm Polycarbonatmembranen geschoben. Achten Sie außerdem während des Betriebs darauf, die Kraft gleichmäßig aufzubringen und die Kraftrichtung entlang der Achse der Spritze beizubehalten. - Zentrifugieren Sie die gepoolten Überstände für 5 min bei 1000 x g und 4 °C, um die Zellen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn bei 3000 x g für 5 min bei 4 °C, um die verbleibenden Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
- Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn bei 100.000 x g für 90 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die bEVs in 2 ml HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS). Reinigen Sie die bEVs durch Filtration durch eine 0,45 μm Membran und lagern Sie die gereinigten bEVs bei −80 °C.
5. bEVs halten sich an die PNPE
HINWEIS: Der SiO2-Sensor wurde durch Spin-Coating-Verfahren modifiziert.
- SiO-2-Sensor modifiziert mit Poly-L-Lysin (PLL).
- Reinigen Sie den SiO2-Quarzsensorchip mit UV-Ozon-Behandlung für 10 min, spülen Sie ihn zweimal mit Ethanol ab und trocknen Sie ihn mit N2.
- Schalten Sie den Spin Coater ein, indem Sie die Ein / Aus-Taste drücken, die Steuerungstaste drücken und die Beschichtungszeit und -geschwindigkeit einstellen. Die anfängliche Drehzahl beträgt 400 U/min, die stetig auf 5000 U/min erhöht wird.
- Verbinden Sie dasN2-Rohr mit dem Schleuderbeschichter und stellen Sie die Fraktionierung der Gasflasche auf 0,4 kPa ein. Legen Sie den sauberen Chip auf den Saugnapf des Schleuderbeschichters. Geben Sie 100 μL PLL tropfenweise in die Mitte desSiO2-Sensors und schließen Sie die obere Abdeckung des Spin-Coaters.
- Drücken Sie die Taste Start, um die Beschichtung der Probe zu starten und die Maschine zu stoppen, wenn sie fertig ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, schalten Sie die Power- und Control-Tasten aus und entfernen Sie den PLL-modifizierten SiO2-Sensor.
HINWEIS: Bevor Sie auf Start drücken, stellen Sie sicher, dass die Beschichtungszeit und -geschwindigkeit eingestellt wurden. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich derSiO2-Sensor in der Mitte des Saugnapfes befindet. Stellen Sie sicher, dass der Deckel geschlossen ist, bevor Sie den Prozess ausführen, um Unfälle zu vermeiden.
- Bestimmung der Adhäsion von bEVs an PNPE
- Schalten Sie den Computer, die Elektronik, die Schlauchpumpe ein und aktivieren Sie die Temperaturregelung unten rechts in der Software, um sicherzustellen, dass die eingestellte Temperatur ca. 1 °C unter Raumtemperatur liegt.
- Setzen Sie die PLL-modifizierten SiO2-Sensoren gemäß der Bedienungsanleitung in die Durchflusszelle ein und verbinden Sie die Messleitung zwischen Durchflusszelle und Durchflusspumpe. Platzieren Sie die Durchflusszelle im Durchflussmodulsystem und spülen Sie sie vor Beginn der Experimente mit Reinstwasser ab.
- Klicken Sie auf die Erfassungssymbolleiste und wählen Sie Messung einrichten , um nach 1, 3, 5, 7, 9 und 11 Oktaven des Chips im verwendeten Kanal zu suchen. Um die Basislinie zu korrigieren, klicken Sie auf Messung starten , damit Luft in das Strömungsmodul eindringen kann, bis die Luftbasislinie glatt ist. Anschließend ententionisiertes Wasser für 10-15 min fließen, um das Gleichgewicht der Lösung wieder zu ermöglichen.
- Die vorbereitete PNPE-Lösung wird mit einer Durchflussrate von 50 μL/min in das Durchflussmodul gepumpt, um eine Gleichgewichtsasorption amSiO2-Sensor zu erreichen.
HINWEIS: Der ΔF ändert sich nicht mehr, wenn das PNPE wieder in das Durchflussmodul gepumpt wird, was darauf hinweist, dass die Oberfläche derSiO2-Sensoren vollständig mit PNPE bedeckt wurde. - Pumpen Sie die vorbereitete bEVs-Lösung mit einer Durchflussrate von 50 μL/min in das Durchflussmodul, um den Prozess der bEV-Adhäsion an der PNPE-Oberfläche zu verfolgen.
6. CLSM-Analyse der Antigenaufnahme
- Co-Kultur PNPE-OVA mit BMDCs
- Inkubieren Sie die BMDCs mit 1640 vollständigen Medien (1% Penicillin-Streptomycin, 10% fetales Rinderserum, 20 ng/ml IL-4 und 10 ng/ml GM-CSF) für 7 Tage und säen Sie sie dann in kleine konfokale Laserschalen bei 1 x 106 pro Vertiefung über Nacht bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator .
- Mischen Sie 0,5 ml Cy5-markierte OVA (400 μg/ml) mit 0,5 ml PNPE für 1 h und entfernen Sie das fluidische Antigen durch Zentrifugation bei 5000 x g für 20 min, um eine Impfstoffformulierung zu entwickeln. Nach der Resuspension mit 200 μL entionisiertem Wasser 10 μL der Formulierung (10 μg/ml OVA) in die kleinen konfokalen Laserschalen unter einer supersauberen Bank geben und 6 h lang mit BMDCs kokulturieren.
- Aktin-Zytoskelett-Färbung
- Entfernen Sie die Kulturflüssigkeit aus den Zellen und waschen Sie sie zweimal mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4).
- Fixieren Sie die Zellen mit 4% iger Formaldehydlösung in PBS für 10 min bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie während der Fixierung Methanol-haltige Fixiermittel, die Aktin zerstören können.
- Waschen Sie die Zellen zwei- bis dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten mit PBS. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 μL 0,5% Triton X-100 Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit PBS zwei- bis dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten.
- Die Zellen auf der Glasbodenschale der kleinen konfokalen Laserschalen mit 200 μL fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierter Phalloidin-Arbeitslösung abdecken und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Um das Hintergrundsignal zu reduzieren, fügen Sie der FITC-konjugierten Phalloidin-Arbeitslösung 1% Rinderserumalbumin hinzu. Decken Sie außerdem den Deckel der kleinen konfokalen Laserschalen während der Inkubation ab, um ein Verdampfen der Lösung zu verhindern.
- Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS. Färben Sie die Kerne mit 200 μL DAPI-Lösung (Konzentration: 100 nM) für ca. 30 s.
- Bildanalyse
- Schalten Sie die konfokale Mikroskophardware nacheinander ein, einschließlich Laser, Konfokal, Mikroskop und Computer. Klicken Sie auf die Software NIS-Elements AR 5.20.00 und wählen Sie Nikon Confocal aus, um das Prüfsystem aufzurufen.
- Schalten Sie im konfokalen Mikroskopsystem die verschiedenen Einheiten in der angegebenen Reihenfolge ein. Richten Sie zunächst die FITC-, DAPI- und Cy5-Kanäle ein und passen Sie die entsprechenden HV- und Offset-Kanäle an. Wählen Sie dann die 100-fache Öllinse und legen Sie einen Tropfen Zedernöl auf die Oberseite. Legen Sie die kleinen konfokalen Laserschalen mit gefärbten BMDCs auf den Mikroskoptisch.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen . Lokalisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop interessante Zellen, indem Sie die X-Achse, Y-Achse und Z-Achse bewegen. Passen Sie die Laserintensität, die Bildgröße und andere Parameter an, um das Scannen hochwertiger konfokaler Bilder zu ermöglichen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Aufnehmen und speichern Sie die Bilder.
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Representative Results
Eine einfache einstufige Sonifikation wurde verwendet, um PNPE zu erhalten. Zunächst bereiteten wir einheitliche PNPs für den Einsatz als Festkörperstabilisator vor (Abbildung 1A). Die Morphologie der PNPs wurde durch REM beobachtet, was zeigt, dass sie meist einheitlich und kugelförmig sind (Abbildung 1B). Die hydrodynamische Größe und das Zetapotenzial der Formulierungen wurden mittels DLS detektiert. Der Durchmesser der PNPs betrug 187,7 ± 3,5 nm und das Zetapotential betrug -16,4 ± 0,4 mV (Abbildung 1C und Zusatztabelle 1). Zur Herstellung von PNPE wurde die Mischung aus PNP-Lösung (0,4%, w/v) und Squalen einfach bei 100 w für 5 min beschallt (Abbildung 1D). Nach Optimierung der kontinuierlichen Phase wurde das erhaltene PNPE intern aus Squalen zusammengesetzt und extern mit PNPs adsorbiert (ergänzende Abbildung 1). Ein optisches Mikroskop wurde verwendet, um die Emulsionströpfchen zu beobachten, und der Mastersizer Partikelgrößenanalysator wurde verwendet, um die Größenverteilung zu bestimmen. PNPE zeigte nicht weniger Partikel, um die Koaleszenz der Emulsionen zu verhindern, und keine Partikel mehr im Überschuss in der kontinuierlichen Phase, die die größeren Aggregate verursachen (Abbildung 1E). Wie in Abbildung 1F und Zusatztabelle 1 dargestellt, betrug die Emulsionsgröße 2100 ± 300 nm und das Zetapotential -27,1 ± 0,5 mV, was darauf hindeutet, dass die Partikel an der Öl/Wasser-Grenzfläche aggregierten. Um die zelluläre Aufnahme von Antigen zu beobachten, wurde die Cy5-labled OVA an der PNPE adsorbiert. Zunächst wurden 500 μL PNPE mit der 500 μL Cy5-markierten OVA bei Raumtemperatur für 1 h gemischt. Die Absorption von Antigenen auf den Formulierungen wurde mittels BCA-Assay getestet. Aufgrund der hohen spezifischen Oberfläche und Hydrophobie wurden innerhalb von 1 h mehr als 70,6% der fluidischen Antigene an der PNPE adsorbiert, was auf ein erhebliches Potenzial für die Beladung großer Mengen von Antigenen in kurzer Zeit hindeutet. Als Kontrollgruppe wurden auch PMPs und SSE charakterisiert. Die PMPs waren in ihrer Größe (1987 ± 310 nm) mit der PNPE vergleichbar. Die SSE war eine negativ geladene Emulsion (-15,9 ± 0,8 mV) mit einer Durchmessergröße von 147,2 ± 0,5 nm. Darüber hinaus betrug die Beladungseffizienz von PMPs und SSE aufgrund der begrenzten Adsorption mit Antigenen nur 25,6% ± 0,6% bzw. 23,4% ± 0,2% (Zusatztabelle 1). Um die Stabilität von PNPE zu bewerten, wurden die präparierten PNPE zusätzlich bei 4 °C bzw. 25 °C gelagert. Die Größe und das Zetapotential der Stammlösung wurden an den Tagen 0-6 (1:50 Verdünnung) bestimmt. Wie in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt, blieben die Tröpfchen während der Lagerung bei 4 °C und 25 °C in Größe und Zetapotential ähnlich, was auf eine höhere Stabilität der PNPE für die Abgabe von Antigenen hindeutet. Dann wurde das QCM-D verwendet, um die Flexibilität von PNPE zu messen. Wie in Abbildung 1G dargestellt, wiesen die PMPs aufgrund ihrer starren Struktur eine geringere Dissipation (ΔD) auf. Gleichzeitig hatte PNPE eine signifikant höhere ΔD, was seine ausgezeichnete Viskoelastizität und Flexibilität zeigt, was einer der Gründe für eine verbesserte Zellanheftung und -aufnahme sein könnte.
Um die Affinität von PNPE zur BMDC-Membran zu validieren, wurden die bEVs verwendet, um die intakten Zellen aufgrund ihrer Passgröße für die genaue QCM-D-Detektion zu ersetzen. In diesem Prozess wurden die reifen BMDCs geerntet und seriell durch Polycarbonat-Membranfilter extrudiert, die Porengrößen von 10, 5 und 1 μm enthielten, um Vesikel in Nanogröße herzustellen. Die erhaltenen bEVs wurden gesammelt und mittels Ultrazentrifugation gereinigt und in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung resuspendiert (Abbildung 2A). Anschließend wurde die Morphologie der negativ gefärbten bEVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) wurde verwendet, um die Größe von bEVs zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass bEVs geschlossene lipid-zweischichtige vesikuläre Formen waren und die Verteilung homogen war (Abbildung 2B). NTA zeigte, dass die Größenverteilung der bEVs mit dem Peakdurchmesser der gereinigten bEVs 131 nm betrug (Abbildung 2C). Wir kamen daher zu dem Schluss, dass die bEVs eine typische Membranstruktur mit gleichmäßiger Verteilung waren, was eine höhere Genauigkeit im QCM-D-Assay als Ersatz für BMDCs ermöglichte.
Als nächstes wurde die Adhäsion von bEVs an PNPE mit QCM-D verfolgt. Zunächst wurde der QCM-D SiO2-Sensor mit PLL modifiziert, um eine positive Ladung zu verleihen, um PNPE anschließend auf der Oberfläche zu fixieren und den Bio-Interphasen-Prozess zu simulieren. Unmittelbar darauf folgte die Zugabe der bEV-Lösung in die Kammer, um die Wechselwirkung zwischen PNPE und bEVs aufzuklären (Abbildung 3A). Wie in Abbildung 3B gezeigt, deutete die sofortige Abnahme der Frequenz (ΔF) auf eine schnelle Adhäsion von bEVs an PNPE nach dem Auftreten hin. Darüber hinaus nahm ΔF mit steigender bEV-Konzentration ab, was einen konzentrationsabhängigen Effekt widerspiegelt. PNPE hat eine dicht gepackte Oberfläche, um den Landeplatz zu stützen; Darüber hinaus zeigte es dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusion für einen starken zellulären Kontakt, was zu einer hohen Affinität zu BMDCs führte. Im Gegensatz dazu waren PMPs und SSE selbst bei hoher Konzentration (80 μg/ml) schwach an bEVs gebunden, was wahrscheinlich auf fehlende Kontaktstellen mit den Immunzellen zurückzuführen war (Abbildung 3C).
Nach Bestätigung des Adhäsionsprozesses an BMDCs wurde PNPE verwendet, um Antigen an die BMDCs zu liefern. Um die Antigeninternalisierungsprofile in vitro direkt zu visualisieren, wurde Cy5-markierte OVA mit PMPs, SSE und PNPE gemischt, um sie mit BMDCs zu behandeln. Nach 6 Stunden nach der Behandlung wurde CLSM durchgeführt, um die zelluläre Aufnahme von Cy5-markierten OVA in BMDCs zu analysieren. Wie in Abbildung 4A gezeigt, zeigte das Cy5-OVA-Fluoreszenzsignal, dass die Gesamtmenge des in Zellen internalisierten Antigens in der PNPE-behandelten Gruppe signifikant höher ist als in der PMP- und SSE-behandelten Gruppe. Die quantitative Analyse der zellulären Aufnahme wurde weiter durchgeführt und zeigte eine signifikant höhere relative Intensität der Fluoreszenz in BMDCs, die mit PNPE behandelt wurden, als in denen, die mit PMPs und SSE behandelt wurden (p < 0,001), was die obige Beobachtung bestätigte (Abbildung 4B). Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die PNPE die Antigeninternalisierung förderte und das Antigen effektiv intrazellulär abgab. Folglich war die Aufnahmeeffizienz von Antigenen positiv mit der Affinität des Verabreichungssystems zu Zielzellen assoziiert, und PNPE erhöhte effektiv die zelluläre Antigenaufnahme durch mehrstufigen Kontakt mit der Zellmembran.
Abbildung 1: Charakterisierung der PLGA-nanopartikelstabilisierten Pickering-Emulsion. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens zur Herstellung von PLGA-Nanopartikeln (PNPs). (B) Rasterelektronenmikroskopie (REM) Bilder von PNPs. Maßstabsbalken = 200 nm. (C) Größenverteilung der PNPs. (D) Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens zur Herstellung der nanopartikelstabilisierten Pickering-Emulsion (PNPE). (E) Optische Mikroaufnahmen von PNPE. Maßstabsbalken = 20 μm. (F) Größenverteilung von PNPE. (G) Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) Analyse der Weichheit von PNPE, PLGA-Mikropartikeln (PMPs) und tensidstabilisierter Emulsion (SSE) durch Detektion der Dissipation (ΔD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Charakterisierung biomimetischer extrazellulärer Vesikel. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens zur Herstellung biomimetischer extrazellulärer Vesikel (bEV). (B) Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von bEVs. Maßstabsbalken = 200 nm. (C) Größenverteilung von bEVs, gemessen mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Affinität von PNPE zu bEVs, analysiert mit QCM-D . (A) Schematische Darstellung der Modifizierung der PLL-Oberfläche durch PNPE-Beschichtung. (B) Änderungen der Häufigkeit (ΔF) von PNPE nach Auftreten unterschiedlicher bEV-Konzentrationen. (C) Vergleich der Veränderungen des ΔF in PLGA-Mikropartikeln (PMPs), tensidstabilisierter Emulsion (SSE) und PNPE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Aufnahme von Antigenen. (A) Repräsentatives Diagramm der zellulären Aufnahme von Antigenen. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Relative Intensität der zellulären Aufnahme von Antigenen. Die Grafik zeigt den Mittelwert ± REM aus drei unabhängigen Experimenten. Die Einweg-ANOVA wurde verwendet, um die Signifikanz der beobachteten Unterschiede zu analysieren. p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Die Optimierung der kontinuierlichen Phase. (A) Optische Mikroaufnahmen von PNPE, die durch verschiedene kontinuierliche Phasen erstellt wurden. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Die Größen der Emulsionen wurden nach der Herstellung nachgewiesen. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Die Stabilität von PNPE. Größe (A) und Zetapotential (B) von PNPE nach 0, 3 und 6 Tagen Lagerung bei den angegebenen Temperaturen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (n = 3) demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatztabelle 1: Charakterisierungen der Formulierungen. PNPs, PNPE und SSE wurden gemäß dem angegebenen Protokoll erstellt. Die Größenverteilungen und das Zetapotential wurden mittels dynamischem Lichtstreuanalysator (DLS) oder Mastersizer Partikelgrößenanalysator bestimmt. Die Belastungseffizienz wurde mit dem BCA-Assay bewertet. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (n = 3) demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Wir haben die PLGA-Nanopartikel-stabilisierte Öl/Wasser-Emulsion als Abgabesystem für eine verbesserte Antigeninternalisierung entwickelt. Das präparierte PNPE besaß eine dicht gepackte Oberfläche, um den Landeplatz zu unterstützen, und eine einzigartige Weichheit und Fließfähigkeit für einen starken zellulären Kontakt mit der Immunzellmembran. Darüber hinaus bot die Öl/Wasser-Schnittstelle eine hochgradige Antigenbeladung, und amphiphiles PLGA verlieh PNPE eine hohe Stabilität für den Transport von Antigenen zu Immunzellen. Das PNPE könnte schnell an der Oberfläche der Zellen haften, was darauf hindeutet, dass die PLGA-Nanopartikel-stabilisierte Emulsion eine starke Affinität zur Zellmembran für die zelluläre Aufnahme aufweist. Darüber hinaus hatte PNPE ein hohes Sicherheitsprofil, da sowohl Squalen als auch PLGA von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Inhaltsstoffe30 sind, von denen erwartet wird, dass sie einen sicheren Transfer in die Klinik ermöglichen.
Das Molekulargewicht des PLGA und die Art der kontinuierlichen und dispergierten Phasen beeinflussten die PNPE-Eigenschaften, einschließlich Stabilität und Hydrophobie. In dieser Forschung wurden 17 kDa Molekulargewicht PLGA-Nanopartikel als Stabilisator und Squalen als disperse Phase ausgewählt, was zu einer erhöhten Stabilität führte. Zusätzlich vereinfachte entionisiertes Wasser als kontinuierliche Phase die Zusammensetzung der Formulierung. Unter dieser Bedingung ermöglichte PNPE eine effiziente Assemblierung von Antigenen und förderte die Abgabe von Antigenen an Immunzellen. Darüber hinaus wurde die Methode der einstufigen Ultraschallbehandlung zur Herstellung von PNPE verwendet, wodurch der langwierige Prozess eliminiert und die Möglichkeit einer Kontamination vermieden wurde. Es ist wichtig zu beachten, dass das aus PNPs und Squalen zusammengesetzte Abgabesystem eine gleichmäßige Kraft haben muss, da sonst keine Emulsion gebildet wird oder das vorbereitete PNPE nicht einheitlich groß ist.
Während die Untersuchung der Affinität des Abgabesystems zu Zellen eine außergewöhnliche Herausforderung war, die in vivo durchgeführt wurde, konnten In-vitro-Studien dazu beitragen, den Prozess der zellulären Adhäsion und Internalisierung aufzuklären. In letzter Zeit hat dieses Problem im biomedizinischen Bereich viel Aufmerksamkeit erregt. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Affinität von Partikeln zu Zellen mittels Durchflusszytometrie und CLSM-Analyse aufzuklären31,32. Während diese Methoden eine durchschnittliche Anzeige auf zellulärer Ebene liefern, sind die spezifischen dynamischen Bindungsprozesse zwischen Zellen und Abgabesystemen nicht einfach zu überwachen. Im Gegensatz dazu hängt QCM in erster Linie von einem empfindlichen piezoelektrischen Kristall ab, den der ΔF mit der Masse ändert. Die Fähigkeit, winzige Massenänderungen zu erkennen, ermöglicht es QCM-D, die gezielten molekularen Wechselwirkungen zu überwachen. Die Technik kann verwendet werden, um Echtzeitereignisse zu überwachen, was die Untersuchung der Affinität von PNPE mit BMDCs unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht33.
Die Adhäsion an PNPE wurde mit bEVs anstelle von intakten Zellen untersucht. Als gut kontrollierte einfache APCs wird angenommen, dass bEVs die meisten Eigenschaften der Elternzellen erben. Im Allgemeinen schneiden extrazelluläre Vesikel mit kleinen und homogenen Partikelgrößen in Adhäsionsassays besser ab. So wurden die bEVs mittels Extrusion durch Polycarbonatfilter mit 10, 5 und 1 μm Porengröße34 hergestellt. Der Durchmesser und die Ausbeute von bEVs könnten durch Regulierung der Anzahl der Extrusionen und der Porengröße von Polycarbonatmembranen gesteuert werden. Es wird empfohlen, 30 Durchgänge durch die Polycarbonatmembranen zu machen. Diese Methode hatte jedoch auch eine Einschränkung, da ein Teil der Membran umgekehrt sein kann, wodurch die Proteine auf der DC-Oberfläche in den bEVs eingekapselt werden, was die Affinität zu Emulsionen leicht verringert.
Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikation derSiO2-Sensoroberflächen mit positiv geladenen Proteinen für die anschließende PNPE-Beschichtung geeignet war. Die beschriebene Implementierung von PLL (Polycation Polypeptide) als Zwischenschicht zwischen SiO2-Sensoroberflächen und PNPE erwies sich als Verbesserung für das Fast-Coating-Verfahren. Massenänderungen, die durch ein Ereignis verursacht werden, z. B. unspezifische Adsorptionen einer Komponente aus dem Lösungsfluss auf demSiO2-Sensor, können die Genauigkeit der experimentellen Ergebnissebeeinträchtigen 35. Daher musste sichergestellt werden, dass die PLL nach der Schleuderbeschichtung eine gleichbleibende Qualität auf dem Chip behält und ihre Oberfläche vollständig von PNPE bedeckt wird, um den durch unspezifische Adsorption verursachten Messfehler zu vermeiden. Gleichzeitig galt die Chipoberfläche, wenn sich ΔF während des Kontakts mit der PNPE-haltigen mobilen Phase nicht mehr veränderte, als vollständig bedeckt. Dadurch wurde sichergestellt, dass die detektierten Signale durch die Adhäsion von bEVs an die PNPE erzeugt wurden. Wir haben gezeigt, dass QCM-D eine gute Methode ist, um die Adhäsion von bEVs an PNPE in Echtzeit zu zeigen, was die hohe Affinität von PNPE zu APCs widerspiegelt. Leider konnte diese Methode die Interaktion zwischen einzelnen Zellen und dem Abgabesystem nicht widerspiegeln. Daher erfordert eine genauere Bestimmung eine weitere Gestaltung des Protokolls und eine Optimierung des Messverfahrens.
Nach der Untersuchung der hohen Affinität von PNPE zu bEVs wurde die verstärkte Internalisierung weiter verifiziert. Wir zeigten, dass die starke zelluläre Aufnahme von Antigenen mit der hohen Affinität von PNPE korreliert. PNPE besaß die mehrstufige Struktur für eine effektive Beladung von Antigenen und die Flexibilität für den mehrstufigen Kontakt mit der Zellmembran, um die Abgabe zu verbessern. Daher stimulierte die rational gestaltete Pickering-Emulsion die zelluläre Internalisierung und intrazelluläre Signalwege durch die robuste Interaktion mit der Zellmembran. Nachdem PNPE diese Vorteile demonstriert hat, kann es Aufschluss über die Entwicklung neuartiger, sicherer und effizienter Antigenverabreichungssysteme zur Verbesserung von Impfstoffen geben.
Dieses Protokoll demonstrierte erfolgreich die hohe Affinität von PNPE zur Phospholipid-Doppelschicht von Immunzellen und die anschließende intrazelluläre Abgabe des Antigens an Immunzellen in vitro. Daher können verschiedene Arten von Antigenen aus verschiedenen Krankheitserregern unter Verwendung des vorgeschlagenen Protokolls verabreicht und charakterisiert werden, um Schutz vor Infektionskrankheiten zu gewährleisten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Projekt, das vom National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), der Foundation for Innovative Research Groups der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005), unterstützt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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