لتصميم مواد مساعدة فعالة بشكل عقلاني ، قمنا بتطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بالجسيمات النانوية (PNPE) من حمض اللاكتيك والجليكوليك. يمتلك PNPE نعومة فريدة وواجهة كارهة للماء للاتصال الخلوي القوي وقدم تحميلا عالي المحتوى للمستضد ، مما أدى إلى تحسين التقارب الخلوي لنظام التوصيل إلى الخلايا المقدمة للمستضد وإحداث استيعاب فعال للمستضدات.
التقارب الخلوي للجسيمات الدقيقة / النانوية هو الشرط المسبق للتعرف الخلوي ، والامتصاص الخلوي ، والتنشيط ، والتي تعتبر ضرورية لتوصيل الدواء والاستجابة المناعية. نشأت الدراسة الحالية من ملاحظة أن تأثيرات شحنة وحجم وشكل الجسيمات الصلبة على تقارب الخلية عادة ما يتم أخذها في الاعتبار ، لكننا نادرا ما ندرك الدور الأساسي للنعومة وظاهرة إعادة الهيكلة الديناميكية وتفاعل الواجهة المعقدة في التقارب الخلوي. هنا ، قمنا بتطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بالجسيمات النانوية (PNPE) الذي تغلب على أوجه القصور في الأشكال الصلبة ومحاكاة مرونة وسيولة مسببات الأمراض. تم إعداد طريقة لاختبار تقارب PNPE مع أسطح الخلايا وتوضيح الاستيعاب اللاحق للخلايا المناعية. تم تحديد تقارب PNPE مع الحويصلات خارج الخلية المحاكية الحيوية (bEVs) – بديل الخلايا المتغصنة لنخاع العظم (BMDCs) – باستخدام توازن دقيق من بلورات الكوارتز مع مراقبة التبديد (QCM-D) ، مما سمح بالمراقبة في الوقت الفعلي للالتصاق مستحلب الخلية. بعد ذلك ، تم استخدام PNPE لتوصيل المستضد (ovalbumin ، OVA) ولوحظ امتصاص المستضدات بواسطة BMDCs باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM). أظهرت النتائج التمثيلية أن PNPE انخفض على الفور التردد (ΔF) عندما واجه bEVs ، مما يشير إلى الالتصاق سريع وتقارب عال ل PNPE مع BMDCs. أظهر PNPE ارتباطا أقوى بكثير بغشاء الخلية من الجسيمات الدقيقة PLGA (PMPs) ومساعد AddaVax (يشار إليه باسم مستحلب النانو المستقر بالسطحي [SSE]). علاوة على ذلك ، نظرا للتقارب الخلوي المعزز للخلايا المناعية من خلال تغيرات الانحناء الديناميكي والانتشار الجانبي ، تم تعزيز امتصاص المستضد لاحقا مقارنة ب PMPs و SSE. يوفر هذا البروتوكول رؤى لتصميم تركيبات جديدة ذات تقارب خلوي عالي واستيعاب فعال للمستضد ، مما يوفر منصة لتطوير لقاحات فعالة.
لمكافحة الأمراض الوبائية والمزمنة والمعدية ، من الضروري تطوير مواد مساعدة فعالة للتطعيمات الوقائية والعلاجية 1,2. من الناحية المثالية ، يجب أن تمتلك المواد المساعدة أمانا ممتازا وتنشيطا مناعيا3،4،5. يعتقد أن الامتصاص الفعال وعملية المستضدات بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) هي مرحلة أساسية في شلالات الإشارات النهائية وبدء الاستجابة المناعية6،7،8. ومن ثم ، فإن اكتساب فهم واضح لآلية تفاعل الخلايا المناعية مع المستضدات وتصميم المواد المساعدة لتعزيز الاستيعاب هي استراتيجيات فعالة لتعزيز كفاءة اللقاحات.
تم التحقيق سابقا في الجسيمات الدقيقة / النانوية ذات الخصائص الفريدة كأنظمة توصيل مستضد للتوسط في الامتصاص الخلوي للمستضدات والتفاعل الخلوي مع الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض 9,10. عند الاتصال بالخلايا ، تبدأ أنظمة التوصيل في التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية وغشاء الخلية ، مما أدى إلى الاستيعاب والاستجابات الخلوية اللاحقة11,12. كشفت الدراسات السابقة أن استيعاب الجسيمات يحدث من خلال التصاق جسيمات غشاء الخلية13 ، يليه تشوه مرن لغشاء الخلية وانتشار المستقبل إلى الغشاء السطحي14,15. في ظل هذه الظروف ، تعتمد خصائص نظام التسليم على التقارب مع ناقلات الجنود المدرعة ، مما يؤثر لاحقا على كمية الامتصاص16,17.
للحصول على نظرة ثاقبة حول تصميم نظام التوصيل لتحسين الاستجابة المناعية ، تم تركيز جهود مكثفة على التحقيق في العلاقة بين خصائص الجسيمات والامتصاص الخلوي. نشأت الدراسة الحالية من ملاحظة أن الجسيمات الدقيقة / النانوية الصلبة ذات الشحنات والأحجام والأشكال المختلفة غالبا ما تتم دراستها في ضوء ذلك ، في حين نادرا ما يتم التحقيق في دور السيولة في استيعاب المستضد18,19. في الواقع ، أثناء الالتصاق ، أظهرت الجسيمات اللينة تغيرات انحناء ديناميكية وانتشارا جانبيا لزيادة مساحة التلامس للتفاعلات متعددة التكافؤ ، والتي بالكاد يمكن تكرارها بواسطة الجسيمات الصلبة20,21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أغشية الخلايا عبارة عن طبقات ثنائية من الدهون الفوسفاتية (sphingolipids أو الكوليسترول) في موقع الامتصاص ، ويمكن للمواد الكارهة للماء أن تغير الإنتروبيا التوافقية للدهون ، مما يقلل من كمية الطاقة اللازمة لامتصاص الخلايا22,23. وبالتالي ، قد يكون تضخيم الحركة وتعزيز الكارهة للماء لنظام التوصيل استراتيجية فعالة لتعزيز استيعاب المستضد لتعزيز الاستجابة المناعية.
تم استخدام مستحلب Pickering ، الذي استقرت بواسطة جزيئات صلبة مجمعة عند الواجهة بين سائلين غير قابلين للامتزاج ، على نطاق واسع في المجال البيولوجي24,25. في الواقع ، تحدد الجسيمات المجمعة على السطح البيني للنفط / الماء صياغة هياكل متعددة المستويات ، والتي تعزز التفاعلات الخلوية لنظام التوصيل متعدد المستويات ، وتحفز بشكل أكبر الخصائص الفيزيائية الكيميائية متعددة الوظائف في توصيل الدواء. بسبب قابليتها للتشوه وحركتها الجانبية ، كان من المتوقع أن تدخل مستحلبات بيكرينغ في تفاعل خلوي متعدد التكافؤ مع الخلايا المناعية ويتم التعرف عليها بواسطة بروتينات الغشاء26. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن نوى المذيلة الزيتية في مستحلبات بيكرينغ غير مغطاة بالكامل بجزيئات صلبة ، فإن مستحلبات بيكرينغ لها فجوات بأحجام مختلفة بين الجسيمات الموجودة على واجهة الزيت / الماء ، مما يسبب مقاومة أعلى للماء. وبالتالي ، من الأهمية بمكان استكشاف تقارب مستحلبات بيكرينغ مع APCs وتوضيح الاستيعاب اللاحق لتطوير مواد مساعدة فعالة.
بناء على هذه الاعتبارات ، قمنا بتصميم مستحلب بيكرينغ المستقر للجسيمات النانوية PLGA (PNPE) كنظام توصيل لقاح سيولة ساعد أيضا في اكتساب رؤى قيمة في تقارب PNPE مع BMDCs والاستيعاب الخلوي. تمت مراقبة الالتصاق في الوقت الفعلي للحويصلات خارج الخلية المحاكية الحيوية (bEVs ؛ استبدال BMDCs) إلى PNPE عبر طريقة خالية من الملصقات باستخدام توازن دقيق من بلورات الكوارتز مع مراقبة التبديد (QCM-D). بعد توصيف تقارب PNPE إلى BMDCs ، تم استخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) لتحديد امتصاص المستضد. أشارت النتيجة إلى تقارب أعلى من PNPE إلى BMDCs ، والاستيعاب الفعال للمستضد. توقعنا أن يظهر PNPE تقاربا أعلى مع APCs ، مما قد يحفز بشكل أفضل استيعاب المستضدات لتعزيز الاستجابات المناعية.
قمنا بتطوير مستحلب الزيت / الماء المستقر بالجسيمات النانوية PLGA كنظام توصيل لتعزيز استيعاب المستضد. يمتلك PNPE المحضر سطحا معبأ بكثافة لدعم نقطة الهبوط ونعومة وسيولة فريدة من نوعها للاتصال الخلوي القوي بغشاء الخلية المناعية. علاوة على ذلك ، قدمت واجهة الزيت / الماء تحميلا عالي المحتوى للمست?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع مدعوم من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFE020527 ، 2021YFC2302605 ، 2021YFC2300142) ، من 0 إلى 1 مشروع الابتكار الأصلي لبرنامج البحث العلمي الحدودي الأساسي للأكاديمية الصينية للعلوم (ZDBS-LY-SLH040) ، مؤسسة مجموعات البحث المبتكرة التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21821005).
AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |