Summary
Для рационального проектирования эффективных адъювантов мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту, стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга (PNPE). PNPE обладал уникальной мягкостью и гидрофобным интерфейсом для мощного клеточного контакта и предлагал высокую нагрузку антигена, улучшая клеточное сродство системы доставки к антигенпрезентирующим клеткам и вызывая эффективную интернализацию антигенов.
Abstract
Клеточное сродство микро-/наночастиц является предпосылкой для клеточного распознавания, клеточного поглощения и активации, которые необходимы для доставки лекарств и иммунного ответа. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что влияние заряда, размера и формы твердых частиц на сродство клеток обычно рассматривается, но мы редко осознаем существенную роль мягкости, динамического явления реструктуризации и сложного интерфейсного взаимодействия в клеточном сродстве. Здесь мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту (PLGA) наночастиц-стабилизированную эмульсию Пикеринга (PNPE), которая преодолела недостатки жестких форм и имитировала гибкость и текучесть патогенов. Был разработан метод для проверки сродства PNPE к клеточным поверхностям и разработки последующей интернализации иммунными клетками. Сродство PNPE к биомиметическим внеклеточным везикулам (bEV) - замене дендритных клеток костного мозга (BMDC) - определяли с помощью микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D), что позволило в режиме реального времени контролировать адгезию клеточной эмульсии. Впоследствии PNPE использовался для доставки антигена (ovalbumin, OVA), а поглощение антигенов BMDC наблюдалось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Репрезентативные результаты показали, что PNPE немедленно снижал частоту (ΔF), когда он сталкивался с bEV, что указывает на быструю адгезию и высокое сродство PNPE к BMDC. PNPE показал значительно более сильное связывание с клеточной мембраной, чем микрочастицы PLGA (PMP) и адъювант AddaVax (обозначаемый как сурфактант-стабилизированная наноэмульсия [SSE]). Кроме того, благодаря усиленному клеточному сродству к иммуноцитам за счет динамических изменений кривизны и боковых диффузий поглощение антигена впоследствии было увеличено по сравнению с PMP и SSE. Этот протокол дает представление о разработке новых составов с высоким сродством клеток и эффективной интернализацией антигена, обеспечивая платформу для разработки эффективных вакцин.
Introduction
Для борьбы с эпидемическими, хроническими и инфекционными заболеваниями необходимо разработать эффективные адъюванты для профилактических и лечебных прививок 1,2. В идеале адъюванты должны обладать отличной безопасностью и иммунной активацией 3,4,5. Эффективное поглощение и процесс антигенов антигенпрезентирующими клетками (АПК) считаются важным этапом в нисходящих сигнальных каскадах и инициировании иммунного ответа 6,7,8. Следовательно, получение четкого понимания механизма взаимодействия иммунных клеток с антигенами и разработка адъювантов для усиления интернализации являются эффективными стратегиями повышения эффективности вакцин.
Микро-/наночастицы с уникальными свойствами были ранее исследованы как системы доставки антигенов для опосредования клеточного поглощения антигенов и клеточного взаимодействия с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами 9,10. При контакте с клетками системы доставки начинают взаимодействовать с внеклеточным матриксом и клеточной мембраной, что приводит к интернализации и последующим клеточным ответам11,12. Предыдущие исследования показали, что интернализация частиц происходит через адгезиюклеточной мембраны-частицы 13 с последующей гибкой деформацией клеточной мембраны и диффузией рецептора к поверхностной мембране14,15. В этих условиях свойства системы доставки зависят от сродства к БТР, что впоследствии влияет на количество поглощения16,17.
Чтобы получить представление о конструкции системы доставки для улучшения иммунного ответа, обширные усилия были сосредоточены на исследовании взаимосвязи между свойствами частиц и клеточным поглощением. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что твердые микро-/наночастицы с различными зарядами, размерами и формами часто изучаются в этом свете, в то время как роль текучести в интернализации антигена редко исследуется18,19. Фактически, во время адгезии мягкие частицы продемонстрировали динамические изменения кривизны и боковые диффузии для увеличения площади контакта для поливалентных взаимодействий, которые вряд ли могут быть воспроизведены твердыми частицами20,21. Кроме того, клеточные мембраны представляют собой фосфолипидные бислои (сфинголипиды или холестерин) в месте поглощения, а гидрофобные вещества могут изменять конформационную энтропию липидов, уменьшая количество энергии, необходимой дляклеточного поглощения 22,23. Таким образом, усиление подвижности и содействие гидрофобности системы доставки может быть эффективной стратегией усиления интернализации антигена для усиления иммунного ответа.
Пикерирующие эмульсии, стабилизированные твердыми частицами, собранными на границе раздела между двумя несмешивающимися жидкостями, широко используются в биологической области24,25. Фактически, агрегирующие частицы на границе раздела нефть/вода определяют формирование многоуровневых структур, которые способствуют многоуровневым системам доставки и клеточным взаимодействиям и в дальнейшем индуцируют многофункциональные физико-химические свойства при доставке лекарств. Из-за их деформируемости и боковой подвижности эмульсии Пикеринга, как ожидалось, войдут в мультивалентное клеточное взаимодействие с иммуноцитами и будут распознаны мембранными белками26. Кроме того, поскольку маслянистые мицелловые ядра в эмульсиях Пикеринга не полностью покрыты твердыми частицами, эмульсии Пикеринга обладают промежутками разных размеров между частицами на границе раздела масло/вода, что вызывает более высокую гидрофобность. Таким образом, крайне важно исследовать сродство эмульсий Пикеринга к БТР и подробно остановиться на последующей интернализации для разработки эффективных адъювантов.
Основываясь на этих соображениях, мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга PLGA (PNPE) в качестве системы доставки вакцины с текучестью, которая также помогла получить ценную информацию о сродстве PNPE к BMDC и клеточной интернализации. Адгезия биомиметических внеклеточных везикул (bEV; замена BMDC) к PNPE в режиме реального времени контролировалась методом без меток с использованием микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D). После характеристики сродства PNPE к BMDC для определения поглощения антигена была использована конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Результат показал более высокое сродство PNPE к BMDC и эффективную интернализацию антигена. Мы ожидали, что PNPE будет демонстрировать более высокое сродство к APC, что может лучше стимулировать интернализацию антигенов для усиления иммунных реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институтом технологического проектирования Китайской академии наук. Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с Правилами ухода за лабораторными животными и их использования и Руководством по этическому обзору животных (Китай, GB/T35892-2018).
1. Получение и характеристика наночастиц PLGA
- Получение наночастиц PLGA (PNP)
- Добавьте 0,5 г поливинилового спирта (ПВА) к 120 мл деионизированной воды при 90 °C и перемешайте до полного растворения для приготовления раствора ПВА. Хранить раствор в холодильнике (4 °C) после охлаждения до комнатной температуры.
- Добавьте 100 мг PLGA к 10 мл смеси ацетона и этанола (соотношение 4:1), чтобы служить масляной фазой.
- Поместите 20 мл водного раствора ПВА под вытяжной капюшон и магнитно перемешайте со скоростью 400 об/мин. Добавьте 5 мл масляной фазы в раствор ПВА капля за каплей с помощью шприцевого насоса. Затем перемешайте смесь в вытяжке до полного испарения органических растворителей.
ПРИМЕЧАНИЕ: При повышении концентрации частиц в масляной фазе раствор водной фазы постепенно превращается в прозрачный и прозрачный светло-голубовато-белый или молочно-белый. - После испарения органических растворителей (2-3 ч) центрифугируют смесь при 15 000 х г. Мойте три или более раз, пока окончательная промывочная вода не станет прозрачной и прозрачной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель данного этапа состоит главным образом в том, чтобы смыть остаточный ПВА на поверхности частиц, чтобы предотвратить его воздействие на препарат эмульсии Пикеринга. - Повторно суспендируют промытые ПНП в 2 мл деионизированной воды и замораживают смесь при -80 °C в течение 24 ч. Впоследствии сублимируют частицы в лиофилизаторе в течение 48-72 ч. Подготовленные ПНП белые стайные.
- Характеристика PNP
- Чтобы охарактеризовать размер и дзета-потенциал PNP, добавьте 10 мкл PNP в 1 мл деионизированной воды для получения раствора разбавителя и переноса раствора разбавителя в ячейку DTS1070. Включите компьютер и динамический анализатор рассеяния света (DLS), затем поместите ячейку DTS1070 в систему DLS.
- Нажмите на программное обеспечение Zeta Size и создайте новый файл измерений, чтобы настроить процедуру определения. Затем запустите процедуру определения размера частиц и распределения дзета-потенциала.
- Чтобы наблюдать за морфологией PNP, равномерно распределите раствор PNP объемом 0,1 мл (разбавленный в 40 раз) на лист из оловянной фольги размером 5 см х 5 см и дайте воде испариться естественным образом в хорошо проветриваемом вытяжном шкафу на ночь.
- Вырежьте небольшую часть оловянной фольги и закрепите ее на столе образцов проводящей лентой. Опрыскивайте его золотом при токе 10 мА в течение 120 с. Впоследствии наблюдать морфологию поверхности образца с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
2. Подготовка и характеристика ПНПЭ
- Для приготовления PNPE добавьте лиофилизированные PNP в деионизированную воду в концентрации 4 мг/мл (водная фаза), а затем добавьте сквален в качестве масляной фазы. Приготовьте PNPE с помощью одноступенчатой обработки ультразвуком в течение 5 мин при 100 Вт в ультразвуковом аппарате для водяной бани. Соотношение фаз масло-вода составляет 1:9.
- Характеристика подготовленного PNPE
- Откройте программное обеспечение Mastersizer 2000 и лазер последовательно. Нажмите кнопку Измерить , чтобы открыть предустановленную программу и задать имя образца. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать измерение фона образца, затем, используя капельницу, добавьте 1 мл PNPE в резервуар для образцов лазерного анализатора размера частиц для измерения размера частиц эмульсии три раза параллельно.
- Разбавить 20 мкл ПНПЭ в 1 мл деионизированной воды. Опустите 20 мкл эмульсии на предметное стекло. Наблюдать морфологию и однородность эмульсии с помощью оптической микроскопии при 40-кратном увеличении и получать фотографии.
- Эффективность загрузки антигена
- Растворите 200 мкг овальбумина (OVA) в 500 мл деионизированной воды. Затем смешайте с 500 мл приготовленного ПНПЭ и встряхните в течение 1 ч при комнатной температуре. Удаляют жидкий антиген центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин.
- Определение концентраций флюидного антигена с помощью анализов бицинхониновой кислоты (БЦА)27. Формула расчета эффективности загрузки антигена выглядит следующим образом:
Эффективность загрузки антигена =
Используйте тот же метод для определения эффективности загрузки антигена SSE, который используется в качестве контрольной группы.
- Стабильность PNPE
- Разделите 6 мл приготовленного ПНПЭ на шесть равных частей и храните по три части при 4 °C и 25 °C соответственно. Разбавьте 20 мкл хранящегося PNPE в 1 мл деионизированной воды (1:50) на 0, 3 и 6 день. Затем измерьте размер и дзета-потенциал стоковых растворов PNPE, хранящихся при разных температурах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные температуры хранения настроены для сравнения влияния различных температур на стабильность PNPE, что может оптимизировать условия хранения для высокой стабильности и длительного срока хранения.
- Разделите 6 мл приготовленного ПНПЭ на шесть равных частей и храните по три части при 4 °C и 25 °C соответственно. Разбавьте 20 мкл хранящегося PNPE в 1 мл деионизированной воды (1:50) на 0, 3 и 6 день. Затем измерьте размер и дзета-потенциал стоковых растворов PNPE, хранящихся при разных температурах.
- Получение микрочастиц PLGA (PMP)
- Растворите 500 мг PLGA в 5 мл дихлорметана в качестве масляной фазы, а затем перелейте в 50 мл внешней водной фазы, содержащей 1,5% ПВА для получения смеси масло/вода. Гомогенизируют смесь при 3000 об/мин в течение 1 мин с помощью гомогенизатора для получения крупноэмульсий.
- Поддерживать однородность размеров частиц PLGA микросфер (определяемых грубыми эмульсиями) путем мембранной эмульгации. Установите мембрану 5,2 мкм в мембранную трубку. Отрегулируйте давление до 800 кПа и держите его стабильным.
- Откройте выпускной клапан и подающий клапан, а после добавления грубых эмульсий в резервуар для образцов закройте выпускной клапан и подающий клапан, откройте выпускной клапан и впускной клапан и возьмите послепленочную эмульсию в стакане объемом 200 мл. Повторите процесс три раза, чтобы получить предварительно двойные эмульсии.
- Перемешайте предварительно двойные эмульсии, чтобы испарить дихлорметан при комнатной температуре, чтобы вылечить микросферы. Промывайте микросферы деионизированной водой при 7741 х г в течение 3 мин пять раз. Предварительно заморозьте в морозильной камере при -80 °C и, наконец, высушите, чтобы получить высушенные микросферы.
- Характеристика PMP
- Откройте программное обеспечение Mastersizer 2000 и лазер последовательно. Нажмите кнопку Измерить , чтобы открыть предустановленную программу и задать имя образца. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать измерение фона образца. Затем добавляют 1 мл PMP в резервуар для добавления образца лазерного анализатора размера частиц с капельницей и измеряют размер частиц микрочастиц три раза параллельно.
- Анализ мягкости
ПРИМЕЧАНИЕ: PNPE был нанесен на датчик SiO2 для измерения мягкости.- Очистите кварцевый сенсорный чип SiO2 с помощью УФ-озоновой обработки в течение 10 мин, дважды промойте 5 мл этанола (75% v/v) и высушитеN2. Установите пустой кварцевый сенсорный чип SiO2 в проточную ячейку.
- Включите компьютер и активируйте контроль температуры в правом нижнем углу программного обеспечения, чтобы убедиться, что установленная температура примерно на 1 °C ниже комнатной температуры.
- Нажмите кнопку «Приобретение » на панели инструментов и выберите «Измерение настройки» для поиска 1, 3, 5, 7, 9 и 11 октав чипа в используемом канале. Нажмите кнопку «Получение » на панели инструментов и выберите «Начать измерение».
- Исправьте базовую линию с помощью air, а когда базовая линия будет сбалансирована, выберите Остановить и сохраните файл как пустой.
- Очистите чип и отложите 10 мкг/мл PNPE на чипе. Вкратце, включите спин-коатер и установите рабочий параметр. Подключите трубу N2 к отжимному коатеру, отрегулируйте фракционирование газового баллона до 0,4 кПа и поместите чистый чип на присоску отжимного коатера. Добавьте 100 мкл PNPE по каплям в центр датчика SiO2 и закройте верхнюю крышку спин-коатера, чтобы завершить покрытие.
- Установите чип с покрытием PNPE в проточную ячейку. Повторите шаги 2.7.3-2.7.4 и сохраните файл как PNPE. Откройте как пустой, так и PNPE-файлы и нажмите кнопку Stitch, чтобы получить соответствующие данные рассеивания (ΔD).
3. Изолировать и культивировать БМДК 28
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты и образцы помещены на лед, так как это положительно влияет на активность клеток. Для поддержания стерильности выполняйте все шаги на сверхчистой скамейке с использованием стерильной посуды.
- Усыпляют мышей C57BL/6 (самки, 6-8 недель) путем вдыханияCO2 и замачивают их в этаноле 70% (v/v) для кратковременной стерилизации.
- После замачивания на 3-5 мин переведите мышей на супер чистую скамейку. Удалите мышцы ног с помощью ножниц из нержавеющей стали, чтобы обнажить бедренную и большеберцовую кости, а затем отделите бедренную и большеберцовую кости.
- Наполните чашку Петри 70% (v/v) этанолом и замочите в ней чистые кости на 5-10 с для завершения внешней стерилизации. Очистите все кости и поместите их в стерильную трубку со льдом вокруг них.
- Обрежьте бедренную и большеберцовую кости близко к суставу ножницами. Вставьте иглу шприца в кость, чтобы промыть костный мозг в центрифужную трубку с использованием предварительно охлажденной среды RPMI (1640).
- Смойте два или три раза, пока кость не станет полностью белой. Пипеткой в костный мозг несколько раз отделить все комочки. Отфильтруйте ячейки в центрифужную трубку объемом 15 мл с помощью сита диаметром 40 мкм.
- Центрифуга при 4 °C и 500 х г в течение 5 мин. Откажитесь от надосадочного вещества и добавьте 2 мл лизата эритроцитов в осадок в течение 4 мин.
- После промывки два или три раза повторно суспендировать клетки в 2 мл полной среды (1 % пенициллин-стрептомицин, 10 % фетальная бычья сыворотка, 20 нг / мл IL-4 и 10 нг / мл GM-CSF). Затем разбавьте 10 мкл клеток в 1 мл PBS и вставьте чип портативного автоматизированного счетчика клеток в разбавление клеток для подсчета клеток. Наконец, семена клеток плотностью 1 х 106 клеток/мл в 10 мм культуральную чашку с полной средой.
- Культивируйте клетки в клеточном инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Меняйте среду каждые 2 дня. На 7 день переведите клетки в трубку 50 мл и центрифугу при 450 х г в течение 5 мин для сбора клеток.
4. Получение биомиметических внеклеточных везикул (bEV)
- Соберите мини-экструдер последовательно в соответствии с инструкциями производителя. Перед использованием убедитесь, что корпус шприца не треснул. Убедитесь, что все уплотнительные кольца находятся в хорошем состоянии перед каждым экспериментом и быстро заменяйте изношенные или поврежденные. Изношенные или поврежденные уплотнительные кольца могут привести к внезапному сбросу давления при работе экструдера.
- Многократно аспирируйте БМДК и переносите их в центрифужную трубку. Собирают клетки центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Давление на клеточные суспензии через 10 мкм, 5 мкм и 1 мкм поликарбонатные мембраны в течение 30 проходов с помощью мини-экструдера29.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения однородности размера bEV суспензии BMDC проталкивались через 10 мкм, 5 мкм и 1 мкм поликарбонатные мембраны в течение 30 проходов. Кроме того, во время работы обязательно прикладывайте силу равномерно и поддерживайте направление силы вдоль оси шприца. - Центрифугируйте объединенные супернатанты в течение 5 мин при 1000 х г и 4 °C для удаления ячеек. Соберите супернатант и центрифугируйте его при 3000 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы удалить оставшиеся клетки и клеточный мусор.
- Соберите супернатант и центрифугируйте его при 100 000 х г в течение 90 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановите bEV в 2 мл HEPES-буферного физиологического раствора (HBS). Очищают bEV путем фильтрации через мембрану 0,45 мкм и хранят очищенные bEV при −80 °C.
5. bEV придерживаются PNPE
ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик SiO2 был модифицирован методом спин-покрытия.
- Датчик SiO2 модифицирован поли-L-лизином (ФАПЧ).
- Очистите кварцевый сенсорный чип SiO2 с помощью обработки УФ-озоном в течение 10 минут, дважды промойте этанолом и высушитеN2.
- Включите отжимной коатер, нажав кнопку питания , нажмите кнопку Control и установите время и скорость покрытия. Начальная скорость вращения составляет 400 об/мин, которая неуклонно увеличивается до 5000 об/мин.
- Подключите трубу N2 к отжимному коатеру и отрегулируйте фракционирование газового баллона до 0,4 кПа. Поместите чистый чип на присоску отжима. Добавьте 100 мкл ФАПЧ по каплям к центру датчика SiO2 и закройте верхнюю крышку спин-коатера.
- Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать нанесение покрытия на образец и остановить машину после завершения. Выключите вакуумный насос, отключите кнопки питания и управления и извлеките модифицированный ФАПЧ датчик SiO2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нажатием кнопки Пуск убедитесь, что установлены время и скорость нанесения покрытия. Кроме того, убедитесь, что датчик SiO2 расположен в центре присоски. Убедитесь, что крышка закрыта перед запуском процесса, чтобы предотвратить несчастные случаи.
- Определение адгезии bEV к PNPE
- Включите компьютер, электронный блок, перистальтический насос и активируйте контроль температуры в правом нижнем углу программного обеспечения, чтобы убедиться, что установленная температура примерно на 1 °C ниже комнатной температуры.
- Поместите модифицированные ФАПЧ датчики SiO2 в проточную ячейку в соответствии с инструкциями по эксплуатации и подключите измерительную линию между проточной ячейкой и проточным насосом. Поместите проточную ячейку внутрь системы проточного модуля и промойте их сверхчистой водой перед началом экспериментов.
- Нажмите на панель инструментов «Приобретение » и выберите «Измерение настройки» для поиска 1, 3, 5, 7, 9 и 11 октав чипа в используемом канале. Чтобы скорректировать базовую линию, нажмите «Начать измерение», чтобы позволить воздуху поступать в модуль потока до тех пор, пока воздушная базовая линия не станет гладкой. Впоследствии проточите деионизированную воду в течение 10-15 мин, чтобы восстановить исходное равновесие раствора.
- Перекачивайте приготовленный раствор PNPE в проточный модуль со скоростью потока 50 мкл/мин для достижения равновесной адсорбции на датчике SiO2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: ΔF больше не изменяется при повторной закачке PNPE в проточный модуль, что указывает на то, что поверхность датчиков SiO2 полностью покрыта PNPE. - Перекачивайте приготовленный раствор bEV в проточный модуль со скоростью потока 50 мкл/мин для отслеживания процесса адгезии bEV к поверхности PNPE.
6. CLSM анализ поглощения антигена
- Кокультура PNPE-OVA с БМДК
- Инкубируйте БМДК с 1640 полными средами (1% пенициллин-стрептомицин, 10% фетальной бычьей сыворотки, 20 нг/мл IL-4 и 10 нг/мл GM-CSF) в течение 7 дней, а затем посеяли их в небольшие конфокальные лазерные чашки при 1 х 106 на лунку на ночь при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 .
- Смешайте 0,5 мл меченой Cy5 OVA (400 мкг/мл) с 0,5 мл PNPE в течение 1 ч и удалите жидкий антиген центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин для разработки рецептуры вакцины. После повторной суспензии с 200 мкл деионизированной воды добавляют 10 мкл состава (10 мкг/мл OVA) в небольшие конфокальные лазерные тарелки под суперчистым стендом и совместно культивируют с БМДК в течение 6 ч.
- Актиновое цитоскелетное пятно
- Удалите культуральную жидкость из клеток и дважды промыть их предварительно нагретым фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS; pH 7,4).
- Зафиксируйте клетки 4% раствором формальдегида в ПБС в течение 10 мин при комнатной температуре. Во время фиксации избегайте фиксаторов, содержащих метанол, которые могут разрушить актин.
- Промывайте ячейки PBS два или три раза при комнатной температуре в течение 10 мин каждая. Пермеабилизируют клетки 100 мкл 0,5% раствора Тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть ячейки с PBS два или три раза при комнатной температуре в течение 10 мин каждая еще раз.
- Накройте ячейки на стеклянной тарелке небольших конфокальных лазерных тарелок 200 мкл флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-конъюгированного рабочего раствора фаллоидина и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Чтобы уменьшить фоновый сигнал, добавляют 1% бычий сывороточный альбумин в FITC-конъюгированный рабочий раствор фаллоидина. Кроме того, накройте крышку небольших конфокальных лазерных тарелок во время инкубации, чтобы предотвратить испарение раствора.
- Промывайте ячейки PBS трижды в течение 5 минут каждая. Повторно окрашивайте ядра 200 мкл раствора DAPI (концентрация: 100 нМ) в течение примерно 30 с.
- Анализ изображений
- Включите аппаратное обеспечение конфокального микроскопа последовательно, включая лазер, конфокальный, микроскоп и компьютер. Щелкните программное обеспечение NIS-Elements AR 5.20.00 и выберите Nikon Confocal , чтобы войти в систему тестирования.
- В системе конфокального микроскопа включите различные блоки в указанном порядке. Сначала настройте каналы FITC, DAPI и Cy5 и настройте соответствующие HV и смещение. Затем выберите масляную линзу 100x и положите каплю кедрового масла сверху. Поместите небольшие конфокальные лазерные тарелки, содержащие окрашенные БМДК, на ступень микроскопа.
- Нажмите кнопку Сканировать . Под флуоресцентным микроскопом найдите интересующие клетки, перемещая ось X, ось Y и ось Z. Настройте интенсивность лазера, размер изображения и другие параметры, чтобы обеспечить сканирование высококачественных конфокальных изображений. Наконец, нажмите кнопку «Захват» и сохраните изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для получения PNPE использовалась простая одношаговая сонификация. Во-первых, мы подготовили однородные PNP для использования в качестве твердого стабилизатора (рисунок 1A). Морфология PNP наблюдалась через SEM, показывая, что они в основном однородны и сферические (рисунок 1B). Гидродинамический размер и дзета-потенциал составов были обнаружены с помощью DLS. Диаметр PNP составлял 187,7 ± 3,5 нм, а дзета-потенциал составлял -16,4 ± 0,4 мВ (рисунок 1C и дополнительная таблица 1). Для приготовления PNPE смесь раствора PNP (0,4%, мас./об.) и сквалена просто обрабатывали ультразвуком при 100 вт в течение 5 мин (рисунок 1D). После оптимизации непрерывной фазы полученный ПНПЭ внутренне состоял из сквалена и внешне адсорбировался ПИАПами (дополнительный рисунок 1). Оптический микроскоп использовался для наблюдения капель эмульсии, а анализатор размера частиц Mastersizer использовался для определения распределения размеров. PNPE демонстрирует не меньше частиц, чтобы предотвратить слияние эмульсий и больше частиц для избытка в непрерывной фазе, которые вызывают более крупные агрегаты (рисунок 1E). Как показано на рисунке 1F и дополнительной таблице 1, размер эмульсии составлял 2100 ± 300 нм, а дзета-потенциал составлял -27,1 ± 0,5 мВ, что указывает на то, что частицы агрегировались на границе раздела нефть/вода. Чтобы наблюдать клеточное поглощение антигена, Cy5-лабледную OVA адсорбировали на PNPE. Начнем с того, что 500 мкл PNPE смешивали с 500 мкл Cy5-меченой OVA при комнатной температуре в течение 1 ч. Абсорбция антигенов на составах была проверена с использованием анализа BCA. Из-за высокой удельной площади поверхности и гидрофобности более 70,6% жидких антигенов адсорбировались на PNPE в течение 1 ч, что указывает на значительный потенциал для загрузки больших количеств антигенов за короткое время. В качестве контрольной группы также были охарактеризованы PMP и SSE. PMP были сопоставимы по размеру (1987 ± 310 нм) с PNPE. SSE представляла собой отрицательно заряженную эмульсию (-15,9 ± 0,8 мВ) диаметром 147,2 ± 0,5 нм. Кроме того, эффективность загрузки PMP и SSE составила всего 25,6% ± 0,6% и 23,4% ± 0,2% соответственно из-за ограниченной адсорбции антигенами (Дополнительная таблица 1). Кроме того, для оценки стабильности PNPE подготовленные PNPE хранили при 4 °C и 25 °C соответственно. Размер и дзета-потенциал запасного раствора определяли на 0-6 день (разведение 1:50). Как показано на дополнительном рисунке 2, капли оставались похожими по размеру и дзета-потенциалу при хранении при 4 °C и 25 °C, что свидетельствует о более высокой стабильности PNPE для доставки антигенов. Затем QCM-D был использован для измерения гибкости PNPE. Как показано на рисунке 1G, в результате своей жесткой структуры PMP демонстрировали более низкую диссипацию (ΔD). В то же время PNPE имел значительно более высокий ΔD, демонстрируя свою отличную вязкоупругость и гибкость, что может быть одной из причин улучшения прикрепления и поглощения клеток.
Чтобы проверить сродство PNPE к мембране BMDC, bEV были использованы для замены неповрежденных ячеек из-за их подходящего размера для точного обнаружения QCM-D. В этом процессе зрелые БМДК собирали и последовательно экструдировали через поликарбонатные мембранные фильтры, которые содержали размеры пор 10, 5 и 1 мкм для получения наноразмерных везикул. Полученные bEV собирали и очищали с помощью ультрацентрифугирования и повторно суспендировали в буферном физиологическом растворе HEPES (рисунок 2A). Затем была изучена морфология отрицательно окрашенных bEV с использованием просвечивающей электронной микроскопии (TEM). Анализ отслеживания наночастиц (NTA) был использован для проверки размера bEV. Результаты показали, что bEV были закрытыми липидно-бислойными везикулярными формами, а распределение было однородным (рисунок 2B). NTA показала, что распределение по размерам bEV с пиковым диаметром очищенных bEV составляло 131 нм (рисунок 2C). Таким образом, мы пришли к выводу, что bEV являются типичной мембранной структурой с равномерным распределением, что позволило повысить точность анализа QCM-D в качестве замены БМДК.
Затем адгезия bEV к PNPE отслеживалась с помощью QCM-D. Во-первых, датчик QCM-D SiO2 был модифицирован ФАПЧ для придания положительного заряда для последующей фиксации PNPE на поверхности и имитации биоинтерфазного процесса. За этим немедленно последовало добавление раствора bEV в камеру для выяснения взаимодействия между PNPE и bEV (рисунок 3A). Как показано на рисунке 3B, немедленное снижение частоты (ΔF) указывало на быстрое сцепление bEV с PNPE после встречи. Кроме того, ΔF уменьшался с увеличением концентрации bEV, отражая концентрационно-зависимый эффект. PNPE имеет плотно упакованную поверхность для поддержки места посадки; кроме того, он демонстрировал динамические изменения кривизны и латеральную диффузию для мощного клеточного контакта, что привело к высокому сродству к BMDC. Напротив, PMP и SSE были слабо связаны с bEV даже при высокой концентрации (80 мкг/мл), что, вероятно, было результатом отсутствия контактов с иммунными клетками (рисунок 3C).
После подтверждения процесса адгезии к BMDC, PNPE был использован для доставки антигена к BMDC. Для непосредственной визуализации профилей интернализации антигенов in vitro меченую Cy5 OVA смешивали с PMP, SSE и PNPE для лечения BMDC соответственно. Через 6 ч после лечения CLSM проводили для анализа клеточного поглощения Cy5-меченой OVA в BMDC. Как показано на рисунке 4A, флуоресцентный сигнал Cy5-OVA показал, что общее количество антигена, интернализованного в клетки, значительно выше в группе, получавшей PNPE, по сравнению с группой, получавшей PMP и SSE. Кроме того, был проведен количественный анализ клеточного поглощения, показавший значительно более высокую относительную интенсивность флуоресценции у BMDC, обработанных PNPE, чем у тех, кто получал PMP и SSE (p < 0,001), что подтвердило приведенное выше наблюдение (рисунок 4B). Полученные результаты показали, что PNPE способствует интернализации антигена и эффективно доставляет антиген внутриклеточным путем. Следовательно, эффективность поглощения антигенов была положительно связана с сродством системы доставки к клеткам-мишеням, и PNPE эффективно увеличивал поглощение антигена клетками через многоуровневый контакт с клеточной мембраной.
Рисунок 1: Характеристика стабилизированной наночастицами эмульсии Пикеринга PLGA. (A) Схема экспериментальной процедуры, используемой для получения наночастиц PLGA (PNP). (B) Сканирующая электронная микроскопия (SEM) изображений PNP. Шкала бар = 200 нм. (C) Распределение PNP по размерам. (D) Схема экспериментальной процедуры, используемой для получения стабилизированной наночастицами эмульсии Пикеринга (PNPE). (E) Оптические микроснимки PNPE. Шкала = 20 мкм. (F) Распределение по размерам PNPE. (G) Микровес кристаллов кварца с анализом мониторинга диссипации (QCM-D) на мягкость PNPE, микрочастиц PLGA (PMP) и стабилизированной сурфактантами эмульсии (SSE) путем обнаружения диссипации (ΔD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика биомиметических внеклеточных везикул. (А) Схема экспериментальной процедуры, применяемой для получения биомиметических внеклеточных везикул (bEV). (B) Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕА) изображений bEV. Шкала = 200 нм. (C) Распределение по размерам bEV, измеренное с использованием анализа отслеживания наночастиц (NTA) (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сродство PNPE к bEV анализируется с использованием QCM-D. (A) Схема модификации поверхности ФАПЧ через покрытие PNPE. (B) Изменения частоты (ΔF) PNPE после столкновения с различными концентрациями bEV. (C) Сравнение изменений ΔF в микрочастицах PLGA (PMP), стабилизированной поверхностно-активной эмульсии (SSE) и PNPE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Поглощение антигенов. (А) Репрезентативная диаграмма клеточного поглощения антигенов. Шкала bar = 20 мкм. (B) Относительная интенсивность флуоресценции клеточного поглощения антигенов. График отображает среднее ± SEM из трех независимых экспериментов. Односторонняя ANOVA использовалась для анализа значимости наблюдаемых различий. p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Оптимизация непрерывной фазы. (A) Оптические микроснимки PNPE, построенные различными непрерывными фазами. Шкала bar = 20 мкм. (B) Размеры эмульсий были обнаружены после приготовления. Результаты были выражены как среднее ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Стабильность PNPE. Размер (А) и дзета-потенциал (В) ПИВПЭ после 0, 3 и 6 суток хранения при указанных температурах. Данные были продемонстрированы как среднее ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Характеристики составов. PNP, PNPE и SSE были подготовлены в соответствии с указанным протоколом. Распределение по размерам и дзета-потенциал определяли с помощью динамического анализатора рассеяния света (DLS) или анализатора размера частиц Mastersizer. Эффективность загрузки оценивалась с помощью анализа BCA. Данные были продемонстрированы как среднее ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию масла/воды PLGA в качестве системы доставки для усиленной интернализации антигена. Подготовленный PNPE обладал плотно упакованной поверхностью для поддержки места посадки и уникальной мягкостью и текучестью для мощного клеточного контакта с мембраной иммунных клеток. Кроме того, интерфейс масло-вода обеспечивал высокую нагрузку антигенов, а амфифильный PLGA придавал PNPE высокую стабильность для транспортировки антигенов к иммунным клеткам. PNPE может быстро прилипать к поверхности клеток, что указывает на то, что стабилизированная наночастицами эмульсия PLGA имеет сильное сродство к клеточной мембране для клеточного поглощения. Кроме того, PNPE имеет высокий профиль безопасности, потому что как сквален, так и PLGA являются одобренными Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) ингредиентами30, которые, как ожидается, будут использовать безопасный перенос в клинику.
Молекулярная масса PLGA и тип непрерывных и дисперсных фаз влияли на свойства PNPE, включая стабильность и гидрофобность. В этом исследовании в качестве стабилизатора были выбраны наночастицы PLGA с молекулярной массой 17 кДа, а в качестве дисперсной фазы — сквален, что привело к повышению стабильности. Кроме того, деионизированная вода в виде непрерывной фазы упростила состав состава. При этом условии PNPE позволял эффективно собирать антигены и способствовал доставке антигенов к иммунным клеткам. Кроме того, для приготовления PNPE был использован метод одноступенчатой обработки ультразвуком, который устранил утомительный процесс и избежал возможности загрязнения. Важно отметить, что система доставки, состоящая из PNP и сквалена, должна иметь равномерную силу, в противном случае эмульсия не образуется или подготовленный PNPE не является однородным по размеру.
В то время как изучение сродства системы доставки к клеткам было чрезвычайной проблемой, выполняемой in vivo, исследования in vitro могли помочь прояснить процесс, связанный с клеточной адгезией и интернализацией. В последнее время этой проблеме уделяется большое внимание в биомедицинской сфере. Значительные усилия были предприняты для того, чтобы пролить свет на сродство частиц к клеткам с помощью проточной цитометрии и анализа CLSM31,32. Хотя эти методы обеспечивают среднее считывание на клеточном уровне, специфические динамические процессы связывания между клетками и системами доставки нелегко контролировать. Напротив, QCM в первую очередь зависит от чувствительного пьезоэлектрического кристалла, который ΔF изменяется с массой. Способность обнаруживать мельчайшие изменения массы позволяет QCM-D контролировать целевые молекулярные взаимодействия. Методика может быть использована для мониторинга событий в реальном времени, что позволяет изучать сродство ПНПЭ с БМДК в различных условиях33.
Адгезию к PNPE исследовали с использованием bEV вместо интактных клеток. Как хорошо контролируемые простые APC, bEV, как полагают, наследуют большинство характеристик родительских клеток. В целом, внеклеточные везикулы с небольшими и однородными размерами частиц лучше работают в анализах адгезии. Таким образом, bEV получали путем экструзии через поликарбонатные фильтры с размерами пор 10, 5 и 1 мкм34. Диаметр и выход bEV можно контролировать, регулируя количество экструзий и размер пор поликарбонатных мембран. Рекомендуется сделать 30 проходов через поликарбонатные мембраны. Однако этот способ также имел одно ограничение в том, что часть мембраны может быть перевернута, в результате чего белки на поверхности постоянного тока инкапсулируются в bEV, что несколько снижает сродство к эмульсиям.
Было показано, что модификация поверхностей датчиков SiO2 с использованием положительно заряженных белков была пригодна для последующего покрытия PNPE. Описанная реализация ФАПЧ (полипептида поликации) в качестве промежуточного слоя между поверхностями датчиков SiO2 и PNPE оказалась улучшением для метода быстрого нанесения покрытия. Изменения массы, вызванные каким-либо событием, например, неспецифическими адсорбциями любого компонента из потока раствора на датчике SiO2 , могут повлиять на точность экспериментальных результатов35. Поэтому необходимо было обеспечить, чтобы ФАПЧ сохраняли стабильное качество на стружке после спинового покрытия, а их поверхность была полностью покрыта PNPE, чтобы избежать погрешности измерения, вызванной неспецифической адсорбцией. В то же время, когда ΔF больше не изменялся при контакте с подвижной фазой, содержащей PNPE, поверхность чипа считалась полностью покрытой. Это гарантировало, что обнаруженные сигналы генерируются путем адгезии bEV к PNPE. Мы продемонстрировали, что QCM-D является хорошим методом для демонстрации адгезии bEV к PNPE в режиме реального времени, отражая высокое сродство PNPE к БТР. К сожалению, этот метод не смог отразить взаимодействие между отдельными клетками и системой доставки. Поэтому более точное определение потребует дальнейшего проектирования протокола и оптимизации процедуры измерения.
После анализа высокого сродства PNPE к bEV была дополнительно проверена усиленная интернализация. Мы продемонстрировали, что мощное клеточное поглощение антигенов коррелирует с высоким сродством PNPE. PNPE обладал многоуровневой структурой для эффективной загрузки антигенов и гибкостью для многоуровневого контакта с клеточной мембраной для улучшения доставки. Поэтому рационально разработанная эмульсия Пикеринга стимулировала клеточную интернализацию и внутриклеточные пути через надежное взаимодействие с клеточной мембраной. Продемонстрировав эти преимущества, PNPE может пролить свет на разработку новых, безопасных и эффективных систем доставки антигенов для улучшения вакцин.
Этот протокол успешно продемонстрировал высокое сродство PNPE к фосфолипидному бислою иммунных клеток и последующую внутриклеточную доставку антигена к иммунным клеткам in vitro. Поэтому различные типы антигенов из разных патогенов могут быть доставлены и охарактеризованы с использованием предлагаемого протокола для обеспечения защиты от инфекционных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Проектом, поддержанным Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), От 0 до 1 Оригинальный инновационный проект Программы фундаментальных передовых научных исследований Китайской академии наук (ZDBS-LY-SLH040), Фондом инновационных исследовательских групп Национального фонда естественных наук Китая (грант No 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
