Summary
Verimli adjuvanları rasyonel olarak tasarlamak için, poli-laktik-ko-glikolik asit nanopartikül-stabilize Pickering emülsiyonu (PNPE) geliştirdik. PNPE, güçlü hücresel temas için benzersiz yumuşaklığa ve hidrofobik bir arayüze sahipti ve yüksek içerikli antijen yüklemesi sundu, dağıtım sisteminin antijen sunan hücrelere hücresel afinitesini artırdı ve antijenlerin verimli bir şekilde içselleştirilmesini sağladı.
Abstract
Mikro-/nanopartiküllerin hücresel afinitesi, ilaç dağıtımı ve immün yanıt için gerekli olan hücresel tanıma, hücresel alım ve aktivasyonun ön koşuludur. Bu çalışma, katı parçacıkların yükünün, boyutunun ve şeklinin hücre afinitesi üzerindeki etkilerinin genellikle göz önünde bulundurulduğu gözleminden kaynaklanmıştır, ancak yumuşaklığın, dinamik yeniden yapılanma fenomeninin ve karmaşık arayüz etkileşiminin hücresel afinitedeki temel rolünü nadiren fark ediyoruz. Burada, katı formların eksikliklerinin üstesinden gelen ve patojenlerin esnekliğini ve akışkanlığını simüle eden poli-laktik-ko-glikolik asit (PLGA) nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonu (PNPE) geliştirdik. PNPE'nin hücre yüzeylerine afinitesini test etmek ve bağışıklık hücreleri tarafından daha sonra içselleştirilmesini detaylandırmak için bir yöntem oluşturulmuştur. PNPE'nin biyo-mimetik hücre dışı veziküllere (bEV'ler) olan afinitesi - kemik iliği dendritik hücrelerinin (BMDC'ler) yerini alır - hücre emülsiyon yapışmasının gerçek zamanlı izlenmesine izin veren dağılım izlemeli (QCM-D) bir kuvars kristali mikro dengesi kullanılarak belirlendi. Daha sonra, PNPE antijeni (ovalbümin, OVA) vermek için kullanıldı ve BMDC'ler tarafından antijenlerin alımı konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak gözlendi. Temsili sonuçlar, PNPE'nin bEV'lerle karşılaştığında frekansı (ΔF) hemen azalttığını ve PNPE'nin BMDC'lere hızlı yapışmasını ve yüksek afinitesini gösterdiğini gösterdi. PNPE, PLGA mikropartiküllerinden (PMP'ler) ve AddaVax adjuvanından (yüzey aktif madde stabilize nano-emülsiyon [SSE] olarak belirtilen) hücre zarına önemli ölçüde daha güçlü bağlanma gösterdi. Ayrıca, dinamik eğrilik değişiklikleri ve lateral difüzyonlar yoluyla immünositlere hücresel afinitenin artması nedeniyle, antijen alımı daha sonra PMP'ler ve SSE ile karşılaştırıldığında artmıştır. Bu protokol, yüksek hücre afinitesi ve etkili antijen içselleştirmesi ile yeni formülasyonlar tasarlamak için içgörüler sağlar ve etkili aşıların geliştirilmesi için bir platform sağlar.
Introduction
Epidemik, kronik ve bulaşıcı hastalıklarla mücadele etmek için, profilaktik ve terapötik aşılar için etkili adjuvanlar geliştirmek zorunludur 1,2. İdeal olarak, adjuvanlar mükemmel güvenlik ve immün aktivasyona sahip olmalıdır 3,4,5. Antijen sunan hücreler (APC'ler) tarafından antijenlerin etkin alımı ve işlenmesinin, aşağı akış sinyal kaskadlarında ve immün yanıtın başlatılmasında önemli bir aşama olduğu düşünülmektedir 6,7,8. Bu nedenle, bağışıklık hücrelerinin antijenlerle etkileşim mekanizmasını net bir şekilde anlamak ve içselleştirmeyi arttırmak için adjuvanlar tasarlamak, aşıların etkinliğini artırmak için etkili stratejilerdir.
Benzersiz özelliklere sahip mikro-/ nanopartiküller daha önce antijenlerin hücresel alımına ve patojenle ilişkili moleküler modellerle hücresel etkileşime aracılık etmek için antijen dağıtım sistemleri olarak araştırılmıştır 9,10. Hücrelerle temas ettikten sonra, dağıtım sistemleri hücre dışı matris ve hücre zarı ile etkileşime girmeye başlar, bu da içselleştirmeye ve ardından hücresel tepkilere yol açar11,12. Önceki çalışmalar, parçacıkların içselleştirilmesinin hücre zarı-parçacık yapışması13, ardından hücre zarının esnek deformasyonu ve reseptörün yüzey zarına difüzyonu14,15 yoluyla gerçekleştiğini ortaya koymuştur. Bu koşullar altında, dağıtım sisteminin özellikleri, APC'lere olan yakınlığa bağlıdır ve bu da daha sonra16,17 alım miktarını etkiler.
Gelişmiş bağışıklık tepkisi için dağıtım sisteminin tasarımı hakkında fikir edinmek için, parçacıkların özellikleri ile hücresel alım arasındaki ilişkinin araştırılmasına kapsamlı çabalar odaklanmıştır. Bu çalışma, çeşitli yüklere, boyutlara ve şekillere sahip katı mikro-/ nanopartiküllerin genellikle bu ışıkta incelendiği, akışkanlığın antijen içselleştirmedeki rolünün nadiren araştırıldığı gözleminden kaynaklanmıştır18,19. Aslında, yapışma sırasında, yumuşak parçacıklar, katı parçacıklar20,21 tarafından zorlukla çoğaltılabilen çok değerli etkileşimler için temas alanını arttırmak için dinamik eğrilik değişiklikleri ve yanal difüzyonlar gösterdi. Ek olarak, hücre zarları alım bölgesinde fosfolipid çift katmanlıdır (sfengolipidler veya kolesterol) ve hidrofobik maddeler lipitlerin konformasyonel entropisini değiştirebilir ve hücresel alım için gereken enerji miktarını azaltabilir22,23. Bu nedenle, hareketliliği arttırmak ve dağıtım sisteminin hidrofobikliğini teşvik etmek, bağışıklık tepkisini arttırmak için antijen içselleştirmesini güçlendirmek için etkili bir strateji olabilir.
İki karışmaz sıvı arasındaki arayüzde bir araya getirilen katı parçacıklar tarafından stabilize edilen Pickering emülsiyonu, biyolojik alanda yaygın olarak kullanılmaktadır24,25. Aslında, yağ / su arayüzündeki toplayıcı parçacıklar, çok seviyeli dağıtım sistemi-hücresel etkileşimleri teşvik eden çok seviyeli yapıların formülasyonunu belirler ve ilaç dağıtımında çok fonksiyonlu fizyokimyasal özellikleri daha da indükler. Deforme olmaları ve lateral hareketlilikleri nedeniyle, Pickering emülsiyonlarının immünositlerle çok değerli hücresel etkileşime girmesi ve membran proteinleri tarafından tanınması bekleniyordu26. Ek olarak, Pickering emülsiyonlarındaki yağlı misel çekirdekleri tamamen katı parçacıklarla kaplı olmadığından, Pickering emülsiyonları, yağ/su arayüzündeki parçacıklar arasında farklı boyutlarda boşluklara sahiptir ve bu da daha yüksek hidrofobikliğe neden olur. Bu nedenle, Pickering emülsiyonlarının APC'lere olan afinitesini araştırmak ve verimli adjuvanlar geliştirmek için sonraki içselleştirmeyi detaylandırmak çok önemlidir.
Bu düşüncelere dayanarak, PNPE'nin BMDC'lere ve hücresel içselleştirmeye olan yakınlığı konusunda değerli bilgiler edinmeye yardımcı olan bir akışkanlık aşısı dağıtım sistemi olarak PLGA nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonunu (PNPE) tasarladık. Biyo-mimetik hücre dışı veziküllerin (bEV'ler; BMDC'lerin değiştirilmesi) PNPE'ye gerçek zamanlı yapışması, dağılım izlemeli (QCM-D) bir kuvars kristali mikro terazisi kullanılarak etiketsiz bir yöntemle izlendi . PNPE'nin BMDC'lere afinitesinin karakterizasyonunu takiben, antijen alımını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanıldı. Sonuç, PNPE'nin BMDC'lere daha yüksek afinitesini ve antijenin verimli bir şekilde içselleştirilmesini göstermiştir. PNPE'nin APC'lere daha yüksek afinite göstereceğini ve bu da immün yanıtları arttırmak için antijenlerin içselleştirilmesini daha iyi uyarabileceğini tahmin ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm yöntemler, Çin Bilimler Akademisi Proses Mühendisliği Enstitüsü tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yönetmeliği ve Hayvanların Etik İncelemesi Kılavuzu'na (Çin, GB/T35892-2018) sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.
1. PLGA nanopartiküllerinin hazırlanması ve karakterizasyonu
- PLGA nanopartiküllerinin (PNP'ler) hazırlanması
- 90 °C'de 120 mL deiyonize suya 0,5 g polivinil alkol (PVA) ekleyin ve PVA çözeltisini hazırlamak için tamamen çözünene kadar karıştırın. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra çözeltiyi buzdolabında (4 °C) saklayın.
- Yağ fazı olarak hizmet etmek için 10 mL aseton ve etanol karışımına (4: 1 oranı) 100 mg PLGA ekleyin.
- Duman davlumbazının altına 20 mL PVA sulu çözelti yerleştirin ve 400 rpm / dak'da manyetik olarak karıştırın. Bir şırınga pompası kullanarak PVA çözeltisine damla damla 5 mL yağ fazı ekleyin. Daha sonra, organik çözücüler tamamen buharlaşana kadar karışımı duman davlumbazında karıştırın.
NOT: Yağ fazındaki parçacıkların konsantrasyonundaki artışla birlikte, su fazı çözeltisi yavaş yavaş berrak ve şeffaf bir açık mavimsi-beyaz veya süt beyazına dönüşür. - Organik çözücülerin uçuculaşmasından sonra (2-3 saat), karışımı 15.000 x g'da santrifüj edin. Son yıkama suyu berrak ve şeffaf olana kadar üç veya daha fazla kez yıkayın.
NOT: Bu adımın amacı, esas olarak, Pickering emülsiyon preparatını etkilemesini önlemek için partikül yüzeyindeki artık PVA'yı yıkamaktır. - Yıkanmış PNP'leri 2 mL deiyonize suda tekrar askıya alın ve karışımı -80 °C'de 24 saat boyunca dondurun. Daha sonra parçacıkları bir liyofilizatörde 48-72 saat dondurarak kurutun. Hazırlanan PNP'ler beyaz sürülüdür.
- PNP'lerin karakterizasyonu
- PNP'lerin boyutunu ve zeta potansiyelini karakterize etmek için, seyreltici çözelti elde etmek ve seyreltici çözeltiyi bir DTS1070 hücresine aktarmak için 1 mL deiyonize suya 10 μL PNP ekleyin. Bilgisayarı ve dinamik ışık saçılma analizörünü (DLS) açın, ardından DTS1070 hücresini DLS sistemine yerleştirin.
- Zeta Boyut Yazılımı'na tıklayın ve belirleme prosedürünü ayarlamak için yeni bir ölçüm dosyası oluşturun. Ardından, partikül boyutunu ve zeta potansiyel dağılımını elde etmek için belirleme prosedürünü başlatın.
- PNP'lerin morfolojisini gözlemlemek için, 0,1 mL PNP çözeltisini (40 kez seyreltilmiş) 5 cm x 5 cm'lik bir kalay folyo levha üzerine eşit olarak yayın ve suyun gece boyunca iyi havalandırılmış bir duman davlumbazında doğal olarak buharlaşmasına izin verin.
- Kalay folyonun küçük bir kısmını kesin ve numune tablasına iletken bantla sabitleyin. 120 s için 10 mA akımda altınla püskürtün. Daha sonra taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak numunenin yüzey morfolojisini gözlemleyin.
2. PNPE'nin hazırlanması ve karakterizasyonu
- PNPE'yi hazırlamak için, dondurularak kurutulmuş PNP'leri deiyonize suya 4 mg / mL konsantrasyonda (sulu faz) ekleyin ve ardından yağ fazı olarak skualen ekleyin. PNPE'yi bir su banyosu sonikatöründe 5 W'ta 100 dakika boyunca tek adımlı sonikasyon yoluyla hazırlayın. Yağ-su faz oranı 1:9'dur.
- Hazırlanan PNPE'nin karakterizasyonu
- Mastersizer 2000 yazılımını ve lazeri sırayla açın. Önceden ayarlanmış programı açmak ve örnek adını ayarlamak için Ölçü'ye tıklayın. Numunenin arka planını ölçmeye başlamak için Başlat'a tıklayın, ardından bir damlalık kullanarak, emülsiyonun parçacık boyutunu paralel olarak üç kez ölçmek için lazer partikül boyutu analizörünün numune tankına 1 mL PNPE ekleyin.
- 20 μL PNPE'yi 1 mL deiyonize suda seyreltin. Emülsiyonun 20 μL'sini slayta bırakın. 40x büyütmede optik mikroskopi kullanarak emülsiyonun morfolojisini ve homojenliğini gözlemleyin ve fotoğraflar elde edin.
- Antijen yükleme verimliliği
- 200 μg ovalbümin (OVA) 500 mL deiyonize suda çözün. Daha sonra 500 mL hazırlanmış PNPE ile karıştırın ve oda sıcaklığında 1 saat çalkalayın. Akışkan antijeni 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleme ile çıkarın.
- Bisinkoninik asit (BCA) tahlilleri27 kullanarak akışkan antijen konsantrasyonlarını belirleyin. Antijen yükleme verimliliğini hesaplamak için formül aşağıdaki gibidir:
Antijen yükleme verimliliği =
Kontrol grubu olarak kullanılan SSE'nin antijen yükleme verimliliğini belirlemek için aynı yöntemi kullanın.
- PNPE'nin kararlılığı
- Hazırlanan PNPE'nin 6 mL'sini altı eşit porsiyona bölün ve her biri sırasıyla 4 ° C ve 25 ° C'de üç parça saklayın. 20 μL depolanan PNPE'yi 0, 3 ve 6. günlerde 1 mL deiyonize suya (1:50) seyreltin. Ardından, farklı sıcaklıklarda tutulan PNPE stok çözümlerinin boyutunu ve zeta potansiyelini ölçün.
NOT: Farklı depolama sıcaklıkları, farklı sıcaklıkların PNPE'nin kararlılığı üzerindeki etkisini karşılaştırmak üzere ayarlanmıştır, bu da depolama koşulunu yüksek stabilite ve uzun raf ömrü için optimize edebilir.
- Hazırlanan PNPE'nin 6 mL'sini altı eşit porsiyona bölün ve her biri sırasıyla 4 ° C ve 25 ° C'de üç parça saklayın. 20 μL depolanan PNPE'yi 0, 3 ve 6. günlerde 1 mL deiyonize suya (1:50) seyreltin. Ardından, farklı sıcaklıklarda tutulan PNPE stok çözümlerinin boyutunu ve zeta potansiyelini ölçün.
- PLGA mikropartiküllerinin (PMP'ler) hazırlanması
- 500 mg PLGA'yı yağ fazı olarak 5 mL diklorometan içinde çözün ve daha sonra yağ/su karışımını elde etmek için% 1.5 PVA içeren 50 mL harici sulu faza dökün. Kaba emülsiyonlar elde etmek için bir homojenizatör kullanarak karışımı 3000 rpm'de 1 dakika homojenize edin.
- Membran emülsifikasyonu ile mikrosferlerin PLGA partikül boyutunun (kaba emülsiyonlarla belirlenen) homojenliğini koruyun. Membran tüpüne 5,2 μm'lik bir membran takın. Basıncı 800 kPa'ya ayarlayın ve sabit tutun.
- Egzoz valfini ve besleme valfini açın ve kaba emülsiyonları numune tankına ekledikten sonra, egzoz valfini ve besleme valfini kapatın, boşaltma valfini ve giriş valfini açın ve film sonrası emülsiyonu 200 mL'lik bir beherde alın. Ön çift emülsiyonlar elde etmek için işlemi üç kez tekrarlayın.
- Mikrosferleri iyileştirmek için diklorometanı oda sıcaklığında buharlaştırmak için çift öncesi emülsiyonları karıştırın. Mikrosferleri deiyonize su kullanarak 7741 x g'de 3 dakika beş kez yıkayın. -80 ° C'de bir dondurucuda önceden dondurulur ve son olarak kurutulmuş mikrosferler elde etmek için dondurarak kurutun.
- PMP'lerin karakterizasyonu
- Mastersizer 2000 yazılımını ve lazeri sırayla açın. Önceden ayarlanmış programı açmak ve örnek adını ayarlamak için Ölçü'ye tıklayın. Numunenin arka planını ölçmeye başlamak için Başlat'a tıklayın. Daha sonra, lazer partikül boyutu analizörünün numune ekleme tankına damlalıklı 1 mL PMP ekleyin ve mikropartiküllerin partikül boyutunu paralel olarak üç kez ölçün.
- Yumuşaklık analizi
NOT: PNPE, yumuşaklığı ölçmek için SiO2 sensörü üzerine kaplanmıştır.- SiO2 kuvars sensör çipini UV-ozon işlemiyle 10 dakika boyunca temizleyin, 5 mL etanol (%75 v/v) ile iki kez durulayın veN2 ile kurulayın. Boş SiO2 kuvars sensör çipini akış hücresine takın.
- Bilgisayarı açın ve ayarlanan sıcaklığın oda sıcaklığının yaklaşık 1 °C altında olmasını sağlamak için yazılımın sağ alt köşesindeki sıcaklık kontrolünü etkinleştirin.
- Araç çubuğundaki Edinme düğmesine tıklayın ve kullanılan kanalda çipin 1, 3, 5, 7, 9 ve 11 oktavlarını aramak için Kurulum Ölçümü'nü seçin. Araç çubuğundaki Edinme düğmesine tıklayın ve Ölçümü Başlat'ı seçin.
- Taban çizgisini hava ile düzeltin ve taban çizgisi dengelendiğinde Durdur'u seçin ve dosyayı boş olarak kaydedin.
- Çipi temizleyin ve çip üzerindeki 10 μg/mL PNPE spin kaplamasını yapın. Kısaca, sıkma kaplayıcısını açın ve çalışma parametresini ayarlayın. N2 borusunu sıkma kaplayıcısına bağlayın, gaz silindirinin fraksiyonasyonunu 0,4 kPa'ya ayarlayın ve temiz talaş sıkma kaplayıcısının vantuzuna yerleştirin. SiO2 sensörünün ortasına damla damla 100 μL PNPE ekleyin ve kaplamayı tamamlamak için spin kaplayıcının üst kapağını kapatın.
- PNPE kaplı çipi akış hücresine takın. 2.7.3-2.7.4 arasındaki adımları yineleyin ve dosyayı PNPE olarak kaydedin. Hem boş hem de PNPE dosyalarını açın ve ilgili dağılım verilerini (ΔD) elde etmek için Dikiş düğmesine tıklayın.
3. İzolat ve kültür BMDC'leri 28
NOT: Tüm reaktiflerin ve numunelerin buz üzerine yerleştirildiğinden emin olun, çünkü bunun hücre aktivitesi üzerinde olumlu bir etkisi vardır. Steriliteyi korumak için, steril kaplar kullanarak ultra temiz bir tezgahta tüm adımları gerçekleştirin.
- C57BL / 6 (dişi, 6-8 haftalık) fareleri CO2 inhalasyonu yoluyla ötenazi yapın ve kısa bir sterilizasyon için% 70 (v / v) etanol içine batırın.
- 3-5 dakika bekletildikten sonra, fareleri süper temiz bir tezgaha aktarın. Femur ve tibiayı açığa çıkarmak için paslanmaz çelik makas kullanarak bacak kaslarını çıkarın ve ardından femur ve tibiayı ayırın.
- Bir Petri kabını% 70 (v / v) etanol ile doldurun ve harici sterilizasyonu tamamlamak için temiz kemikleri 5-10 s bekletin. Tüm kemikleri temizleyin ve etraflarında buz bulunan steril bir tüpe yerleştirin.
- Femur ve tibiayı makas kullanarak eklem yakınında kesin. Önceden soğutulmuş RPMI ortamı (1640) kullanarak kemik iliğini bir santrifüj tüpüne yıkamak için şırınga iğnesini kemiğe yerleştirin.
- Kemik tamamen beyaz olana kadar iki veya üç kez durulayın. Tüm kümeleri ayırmak için kemik iliğini birkaç kez pipetleyin. 40 μm çapında bir elek kullanarak hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin.
- 5 dakika boyunca 4 °C ve 500 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve 4 dakika boyunca tortuya 2 mL eritrosit lizat ekleyin.
- İki veya üç kez yıkadıktan sonra, hücreleri 2 mL tam ortamda (% 1 penisilin-streptomisin,% 10 fetal sığır serumu, 20 ng / mL IL-4 ve 10 ng / mL GM-CSF) tekrar askıya alın. Ardından, 10 μL hücreleri 1 mL PBS'ye seyreltin ve elde taşınan otomatik hücre sayacının çipini hücre sayımı için hücre seyreltmesine yerleştirin. Son olarak, 1 x 106 hücre / mL yoğunluğundaki tohum hücrelerini, tam bir ortama sahip 10 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin.
- Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile bir hücre inkübatöründe kültürleyin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. 7. günde, hücreleri 50 mL tüpe aktarın ve hücreleri toplamak için 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.
4. Biyo-mimetik hücre dışı veziküllerin (bEV'ler) hazırlanması
- Mini ekstrüderi üreticinin talimatlarına göre sırayla monte edin. Kullanmadan önce şırınga muhafazasının çatlamadığından emin olun. Her deneyden önce tüm O-ringlerin iyi durumda olduğundan emin olun ve aşınmış veya hasar görmüş olanları derhal değiştirin. Aşınmış veya hasar görmüş O-ringler, ekstrüderi çalıştırırken ani basınç salınımına neden olabilir.
- BMDC'leri tekrar tekrar aspire edin ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleme ile toplayın. Mini ekstrüder29'u kullanarak hücre süspansiyonlarını 10 μm, 5 μm ve 1 μm polikarbonat membranlardan 30 geçiş için basınçlandırın.
NOT: bEV boyut homojenliğini sağlamak için, BMDC süspansiyonları 30 geçiş için 10 μm, 5 μm ve 1 μm polikarbonat membranlardan geçirilmiştir. Ek olarak, çalışma sırasında, kuvveti eşit şekilde uyguladığınızdan ve şırınganın ekseni boyunca kuvvet yönünü koruduğunuzdan emin olun. - Hücreleri çıkarmak için havuzlanmış süpernatantları 1000 x g ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı toplayın ve kalan hücreleri ve hücre kalıntılarını çıkarmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı toplayın ve 4 ° C'de 90 dakika boyunca 100.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve bEV'leri 2 mL HEPES tamponlu salin (HBS) içinde yeniden askıya alın. bEV'leri 0,45 μm'lik bir membrandan filtreleme yoluyla saflaştırın ve saflaştırılmış bEV'leri -80 ° C'de saklayın.
5. bEV'ler PNPE'ye uyar
NOT: SiO2 sensörü , spin kaplama yöntemiyle değiştirilmiştir.
- SiO2 sensörü poli-L-lizin (PLL) ile modifiye edilmiştir.
- SiO2 kuvars sensör çipini UV-ozon işlemi kullanarak 10 dakika boyunca temizleyin, etanol ile iki kez durulayın veN2 ile kurulayın.
- Güç düğmesine basarak döndürme kaplayıcısını açın, Kontrol düğmesine basın ve kaplama süresini ve hızını ayarlayın. İlk dönüş hızı 400 rpm'dir ve bu da sürekli olarak 5000 rpm'ye yükseltilir.
- N2 borusunu spin kaplayıcıya bağlayın ve gaz silindirinin fraksiyonasyonunu 0,4 kPa'ya ayarlayın. Temiz çipi spin kaplayıcının vantuzuna yerleştirin. SiO2 sensörünün ortasına damla yönünde 100 μL PLL ekleyin ve sıkma kaplayıcısının üst kapağını kapatın.
- Numuneyi kaplamaya başlamak ve bittiğinde makineyi durdurmak için Başlat düğmesine basın. Vakum pompasını kapatın, Güç ve Kontrol düğmelerini kapatın ve PLL'de modifiye edilmiş SiO2 sensörünü çıkarın.
NOT: Başlat'a basmadan önce, kaplama süresinin ve hızının ayarlandığından emin olun. Ek olarak, SiO2 sensörünün vantuz ortasına yerleştirildiğinden emin olun. Kazaları önlemek için işlemi çalıştırmadan önce kapağın kapalı olduğundan emin olun.
- bEV'lerin PNPE'ye yapışmasının belirlenmesi
- Bilgisayarı, elektronik üniteyi, peristaltik pompayı açın ve ayarlanan sıcaklığın oda sıcaklığının yaklaşık 1 ° C altında olmasını sağlamak için yazılımda sağ alttaki sıcaklık kontrolünü etkinleştirin.
- PLL'de modifiye edilmiş SiO2 sensörlerini çalıştırma talimatlarına göre akış hücresine yerleştirin ve ölçüm hattını akış hücresi ile akış pompası arasına bağlayın. Akış hücresini akış modülü sisteminin içine yerleştirin ve deneylere başlamadan önce ultra saf suyla durulayın.
- Edinme araç çubuğuna tıklayın ve kullanılan kanalda çipin 1, 3, 5, 7, 9 ve 11 oktavını aramak için Kurulum Ölçümü'nü seçin. Taban çizgisini düzeltmek için, hava taban çizgisi pürüzsüz olana kadar havanın akış modülüne girmesine izin vermek için Ölçümü Başlat'a tıklayın. Daha sonra, çözelti temel dengesini tekrar sağlamak için 10-15 dakika boyunca deiyonize su akışı sağlayın.
- SiO2 sensöründe denge adsorpsiyonu elde etmek için hazırlanan PNPE çözeltisini akış modülüne 50 μL/dak akış hızında pompalayın.
NOT: PNPE tekrar akış modülüne pompalandığında ΔF artık değişmez, bu da SiO2 sensörlerinin yüzeyinin tamamen PNPE ile kaplandığını gösterir. - PNPE yüzeyine bEV yapışma sürecini izlemek için hazırlanan bEV'ler çözeltisini akış modülüne 50 μL/dak akış hızında pompalayın.
6. Antijen alımının CLSM analizi
- BMDC'ler ile ortak kültür PNPE-OVA
- BMDC'leri 7 gün boyunca 1640 tam ortam (% 1 penisilin-streptomisin,% 10 fetal sığır serumu,% 10 fetal sığır serumu, 20 ng / mL IL-4 ve 10 ng / mL GM-CSF) ile inkübe edin ve daha sonra% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca kuyu başına 1 x 106'da küçük konfokal lazer kaplarına tohumlayın.
- 0,5 mL Cy5 etiketli OVA'yı (400 μg/mL) 1 saat boyunca 0,5 mL PNPE ile karıştırın ve aşı formülasyonu geliştirmek için 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleme yaparak akışkan antijeni çıkarın. 200 μL deiyonize su ile yeniden süspansiyondan sonra, süper temiz bir tezgah altında küçük konfokal lazer kaplarına 10 μL formülasyon (10 μg / mL OVA) ekleyin ve 6 saat boyunca BMDC'lerle ortak kültür.
- Aktin sitoiskelet boyası
- Kültür sıvısını hücrelerden çıkarın ve önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4) ile iki kez yıkayın.
- Hücreleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de% 4 formaldehit çözeltisi ile sabitleyin. Fiksasyon sırasında, aktin'i tahrip edebilecek metanol içeren fiksatörlerden kaçının.
- Hücreleri PBS ile oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca iki veya üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 μL% 0.5 Triton X-100 çözeltisi ile geçirgenleştirin. Hücreleri PBS ile oda sıcaklığında iki veya üç kez 10 dakika boyunca tekrar yıkayın.
- Küçük konfokal lazer çanakların cam tabanlı kabındaki hücreleri 200 μL floresein izotiyosiyanat (FITC) konjuge falloidin çalışma çözeltisi ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Arka plan sinyalini azaltmak için, FITC-konjuge falloidin çalışma çözeltisine% 1 sığır serum albümini ekleyin. Ek olarak, çözeltinin buharlaşmasını önlemek için inkübasyon sırasında küçük konfokal lazer bulaşıklarının kapağını örtün.
- Hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Çekirdekleri yaklaşık 30 s boyunca 200 μL DAPI çözeltisi (konsantrasyon: 100 nM) ile yeniden boyayın.
- Görüntü analizi
- Lazer, konfokal, mikroskop ve bilgisayar dahil olmak üzere konfokal mikroskop donanımını sırayla açın. NIS-Elements AR 5.20.00 yazılımına tıklayın ve test sistemine girmek için Nikon Confocal öğesini seçin.
- Konfokal mikroskop sisteminde, çeşitli birimleri belirtilen sırayla açın. İlk olarak, FITC, DAPI ve Cy5 kanallarını ayarlayın ve ilgili YG ve ofseti ayarlayın. Ardından, 100x yağ lensini seçin ve üstüne bir damla sedir yağı koyun. Lekeli BMDC'ler içeren küçük konfokal lazer kaplarını mikroskop aşamasına yerleştirin.
- Scan ( Tara ) düğmesini tıklatın. Bir floresan mikroskobu altında, X eksenini, Y eksenini ve Z eksenini hareket ettirerek ilgilenilen hücreleri bulun. Yüksek kaliteli konfokal görüntülerin taranmasını sağlamak için lazer yoğunluğunu, görüntü boyutunu ve diğer parametreleri ayarlayın. Son olarak, tıklayın Yakala düğmesine basın ve görüntüleri kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PNPE elde etmek için basit bir tek adımlı sonifikasyon kullanıldı. İlk olarak, katı stabilizatör olarak kullanılmak üzere üniform PNP'ler hazırladık (Şekil 1A). PNP'lerin morfolojisi SEM ile gözlendi ve çoğunlukla tekdüze ve küresel olduklarını gösterdi (Şekil 1B). Formülasyonların hidrodinamik boyutu ve zeta potansiyeli DLS ile tespit edildi. PNP'lerin çapı 187.7 ± 3.5 nm ve zeta potansiyeli -16.4 ± 0.4 mV idi (Şekil 1C ve Ek Tablo 1). PNPE'yi hazırlamak için, PNP çözeltisi (% 0.4, w / v) ve skualen karışımı 5 dakika boyunca 100 w'da basitçe sonikleştirildi (Şekil 1D). Sürekli fazın optimizasyonundan sonra, elde edilen PNPE dahili olarak skualenden oluşmuş ve PNP'lerle harici olarak adsorbe edilmiştir (Ek Şekil 1). Emülsiyon damlacıklarını gözlemlemek için optik mikroskop kullanıldı ve boyut dağılımını belirlemek için Mastersizer parçacık boyutu analizörü kullanıldı. PNPE, emülsiyonların birleşmesini önlemek için daha az parçacık sergilemedi ve daha büyük agregalara neden olan sürekli fazda daha fazla parçacık fazlalığı göstermedi (Şekil 1E). Şekil 1F ve Ek Tablo 1'de gösterildiği gibi, emülsiyon boyutu 2100 ± 300 nm ve zeta potansiyeli -27.1 ± 0.5 mV idi, bu da parçacıkların yağ/su arayüzünde toplandığını gösteriyordu. Antijenin hücresel alımını gözlemlemek için, PNPE üzerinde Cy5-labled OVA adsorbe edildi. Başlangıç olarak, 500 μL PNPE, 1 saat boyunca oda sıcaklığında 500 μL Cy5 etiketli OVA ile karıştırıldı. Formülasyonlar üzerindeki antijenlerin emilimi BCA testi kullanılarak test edildi. Yüksek spesifik yüzey alanı ve hidrofobikliği nedeniyle, akışkan antijenlerin% 70.6'sından fazlası PNPE üzerinde 1 saat içinde adsorbe edildi ve bu da kısa sürede büyük miktarlarda antijen yüklemek için önemli bir potansiyel olduğunu gösterdi. Kontrol grubu olarak PMP'ler ve SSE de karakterize edildi. PMP'lerin büyüklüğü PNPE ile karşılaştırılabilir (1987 ± 310 nm). SSE, çap büyüklüğü 147.2 ± 0.5 nm olan negatif yüklü emülsiyon (-15.9 ± 0.8 mV) idi. Ek olarak, PMP'lerin ve SSE'lerin yükleme verimliliği, antijenlerle sınırlı adsorpsiyon nedeniyle sırasıyla% 25.6 ±% 0.6 ve% 23.4 ±% 0.2 idi (Ek Tablo 1). Ek olarak, PNPE'nin stabilitesini değerlendirmek için, hazırlanan PNPE sırasıyla 4 ° C ve 25 ° C'de saklandı. Stok çözeltisinin boyutu ve zeta potansiyeli 0-6. günlerde (1:50 seyreltme) belirlendi. Ek Şekil 2'de gösterildiği gibi, damlacıklar 4 ° C ve 25 ° C'de depolama sırasında boyut ve zeta potansiyeli bakımından benzer kalmıştır, bu da antijenlerin verilmesi için PNPE'nin daha yüksek stabilitesini göstermiştir. Daha sonra PNPE'nin esnekliğini ölçmek için QCM-D kullanıldı. Şekil 1G'de gösterildiği gibi, sert yapısının bir sonucu olarak, PMP'ler daha düşük dağılım (ΔD) sergilemiştir. Aynı zamanda, PNPE, mükemmel viskoelastisitesini ve esnekliğini gösteren, önemli ölçüde daha yüksek bir ΔD'ye sahipti, bu da gelişmiş hücre bağlantısı ve alımının nedenlerinden biri olabilir.
PNPE'nin BMDC'lerin membranına afinitesini doğrulamak için, bEV'ler, doğru QCM-D tespiti için uygun boyutları nedeniyle bozulmamış hücrelerin yerini almak için kullanıldı. Bu süreçte, olgun BMDC'ler hasat edildi ve hazırlanan nano boyutlu veziküllere 10, 5 ve 1 μm gözenek boyutları içeren polikarbonat membran filtrelerden seri olarak ekstrüde edildi. Elde edilen bEV'ler ultrasantrifüjleme yoluyla toplanıp saflaştırıldı ve HEPES tamponlu salininde yeniden askıya alındı (Şekil 2A). Negatif lekeli bEV'lerin morfolojisi daha sonra transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak araştırıldı. bEV'lerin boyutunu test etmek için bir nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanıldı. Sonuçlar, bEV'lerin kapalı lipid-çift katmanlı veziküler formlar olduğunu ve dağılımın homojen olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 2B). NTA, saflaştırılmış bEV'lerin tepe çapına sahip bEV'lerin boyut dağılımının 131 nm olduğunu göstermiştir (Şekil 2C). Bu nedenle, bEV'lerin, BMDC'lerin yerine QCM-D testinde daha fazla doğruluk sağlayan düzgün dağılıma sahip tipik bir membran yapısı olduğu sonucuna vardık.
Daha sonra, bEV'lerin PNPE'ye yapışması QCM-D kullanılarak izlendi. İlk olarak, QCM-D SiO2 sensörü, PNPE'yi yüzeyde sabitlemek ve biyo-interfaz işlemini simüle etmek için pozitif bir yük vermek üzere PLL ile değiştirildi. Hemen ardından PNPE ve bEV'ler arasındaki etkileşimi aydınlatmak için bEV çözeltisi odaya eklenerek takip edildi (Şekil 3A). Şekil 3B'de gösterildiği gibi, frekanstaki ani düşüş (ΔF), bEV'lerin karşılaşmadan sonra PNPE'ye hızlı bir şekilde yapıştığını göstermiştir. Dahası, ΔF, konsantrasyona bağlı bir etkiyi yansıtan bEV konsantrasyonunun artmasıyla azalmıştır. PNPE, iniş noktasını desteklemek için yoğun bir şekilde paketlenmiş bir yüzeye sahiptir; ayrıca, güçlü hücresel temas için dinamik eğrilik değişiklikleri ve yanal difüzyon sergiledi ve BMDC'lere yüksek afinite ile sonuçlandı. Buna karşılık, PMP'ler ve SSE, muhtemelen bağışıklık hücreleri ile temas bölgelerinin eksikliğinden kaynaklanan yüksek konsantrasyonda (80 μg / mL) bile bEV'lere zayıf bir şekilde bağlanmıştır (Şekil 3C).
BMDC'lere yapışma sürecini doğruladıktan sonra, PNPE, BMDC'lere antijen vermek için kullanıldı. Antijen içselleştirme profillerini in vitro olarak doğrudan görselleştirmek için, Cy5 etiketli OVA, BMDC'lerle tedavi etmek için sırasıyla PMP'ler, SSE ve PNPE ile karıştırıldı. Tedavi sonrası 6 saat sonra, BMDC'lerde Cy5 etiketli OVA'nın hücresel alımını analiz etmek için CLSM yapıldı. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, Cy5-OVA floresan sinyali, hücrelere içselleştirilen toplam antijen miktarının, PNPE ile tedavi edilen grupta, PMP'ler ve SSE ile tedavi edilen gruba kıyasla anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermiştir. Hücresel alımın kantitatif analizi daha da gerçekleştirilmiş olup, PNPE ile tedavi edilen BMDC'lerde, PMP'ler ve SSE (p < 0.001) ile tedavi edilenlere göre anlamlı derecede daha yüksek bir göreceli floresan yoğunluğu göstermiştir ve bu da yukarıdaki gözlemi doğrulamıştır (Şekil 4B). Elde edilen sonuçlar, PNPE'nin antijen içselleştirmesini desteklediğini ve antijeni hücre içi olarak etkili bir şekilde verdiğini göstermiştir. Sonuç olarak, antijenlerin alım etkinliği, hedeflenen hücrelere dağıtım sistemi afinitesi ile pozitif ilişkiliydi ve PNPE, hücre zarı ile çok seviyeli temas yoluyla antijen hücresel alımını etkili bir şekilde arttırdı.
Şekil 1: PLGA nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonunun karakterizasyonu. (A) PLGA nanopartiküllerinin (PNP'ler) hazırlanmasında kullanılan deneysel prosedürün şeması. (B) PNP'lerin taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri. Ölçek çubuğu = 200 nm. (C) PNP'lerin boyut dağılımı. (D) Nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonunun (PNPE) hazırlanmasında kullanılan deneysel prosedürün şeması. (E) PNPE'nin optik mikrografları. Ölçek çubuğu = 20 μm. (F) PNPE'nin boyut dağılımı. (G) PNPE, PLGA mikropartikülleri (PMP'ler) ve dağılım (ΔD) tespiti yoluyla yüzey aktif madde stabilize emülsiyonun (SSE) yumuşaklığı üzerine dağılım izleme (QCM-D) analizi ile kuvars kristali mikro terazisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Biyo-mimetik hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu. (A) Biyo-mimetik hücre dışı veziküllerin (bEV'ler) hazırlanmasında kullanılan deneysel prosedürün şeması. (B) bEV'lerin transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri. Ölçek çubuğu = 200 nm. (C) Nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanılarak ölçülen bEV'lerin boyut dağılımı (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PNPE'nin QCM-D kullanılarak analiz edilen bEV'lere afinitesi . (A) PLL yüzeyinin PNPE kaplama yoluyla modifikasyonunun şeması. (B) Farklı bEV konsantrasyonlarıyla karşılaştıktan sonra PNPE'nin frekansındaki (ΔF) değişiklikler. (C) PLGA mikropartiküllerinde (PMP'ler), yüzey aktif madde stabilize emülsiyonunda (SSE) ve PNPE'de ΔF'deki değişikliklerin karşılaştırılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Antijenlerin alımı . (A) Antijenlerin hücresel alımının temsili diyagramı. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Antijenlerin hücresel alımının göreceli yoğunlukta floresansı. Grafik, üç bağımsız deneyden ortalama ± SEM'i göstermektedir. Gözlemlenen farklılıkların önemini analiz etmek için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır. p < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Sürekli fazın optimizasyonu. (A) Farklı sürekli fazlar tarafından inşa edilen PNPE'nin optik mikrografları. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Emülsiyonların boyutları preparattan sonra tespit edildi. Sonuçlar ortalama ± SEM (n=3) olarak ifade edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: PNPE'nin kararlılığı. Belirtilen sıcaklıklarda 0, 3 ve 6 günlük depolamadan sonra PNPE'nin boyutu (A) ve zeta potansiyeli (B). Veriler ortalama ± SEM (n=3) olarak gösterilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Formülasyonların karakterizasyonları. PNP'ler, PNPE ve SSE belirtilen protokole göre hazırlandı. Boyut dağılımları ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılma analizörü (DLS) veya Mastersizer partikül boyutu analizörü tarafından belirlendi. Yükleme verimliliği BCA testi kullanılarak değerlendirildi. Veriler ortalama ± SEM (n=3) olarak gösterilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelişmiş antijen içselleştirme için bir dağıtım sistemi olarak PLGA nanopartikül stabilize yağ / su emülsiyonunu geliştirdik. Hazırlanan PNPE, iniş noktasını desteklemek için yoğun bir şekilde paketlenmiş bir yüzeye ve bağışıklık hücresi zarı ile güçlü hücresel temas için benzersiz yumuşaklık ve akışkanlığa sahipti. Ayrıca, yağ / su arayüzü yüksek içerikli antijen yüklemesi sundu ve amfifilik PLGA, antijenlerin bağışıklık hücrelerine taşınması için PNPE'ye yüksek stabilite sağladı. PNPE, hücrelerin yüzeyine hızla yapışabilir, bu da PLGA nanopartikül stabilize emülsiyonunun hücresel alım için hücre zarına güçlü bir afiniteye sahip olduğunu gösterir. Ayrıca, PNPE yüksek bir güvenlik profiline sahipti çünkü hem skualen hem de PLGA, kliniğe güvenli transferden yararlanması beklenen Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı bileşenler30'dur.
PLGA'nın moleküler ağırlığı ve sürekli ve dağınık fazların tipi, stabilite ve hidrofobiklik dahil olmak üzere PNPE özelliklerini etkiledi. Bu araştırmada, stabilizatör olarak 17 kDa moleküler ağırlıklı PLGA nanopartikülleri ve dispersiyon fazı olarak skualen seçilerek stabilitenin artması sağlanmıştır. Ek olarak, sürekli bir faz olarak deiyonize su, formülasyonun bileşimini basitleştirdi. Bu koşul altında, PNPE antijenlerin etkili bir şekilde monte edilmesine izin verdi ve antijenlerin bağışıklık hücrelerine verilmesini teşvik etti. Ayrıca, sıkıcı süreci ortadan kaldıran ve kontaminasyon olasılığını önleyen PNPE'yi hazırlamak için tek adımlı sonikasyon yöntemi kullanılmıştır. PNP'lerden ve skualenden oluşan dağıtım sisteminin eşit bir kuvvet olması gerektiğine dikkat etmek önemlidir, aksi takdirde emülsiyon oluşmaz veya hazırlanan PNPE'nin boyutu eşit değildir.
Dağıtım sisteminin hücrelere olan afinitesini incelemek, in vivo olarak gerçekleştirilen olağanüstü bir zorluk olsa da, in vitro çalışmalar hücresel yapışma ve içselleştirme ile ilgili süreci aydınlatmaya yardımcı olabilir. Son zamanlarda, bu sorun biyomedikal alanda çok dikkat çekmiştir. Akış sitometrisi ve CLSM analizi31,32 kullanılarak parçacıkların hücrelere afinitesine ışık tutmak için önemli çabalar sarf edilmiştir. Bu yöntemler hücresel düzeyde ortalama bir okuma sağlarken, hücreler ve dağıtım sistemleri arasındaki spesifik dinamik bağlanma süreçleri kolayca izlenmez. Buna karşılık, QCM öncelikle ΔF'nin kütle ile değiştiği hassas bir piezoelektrik kristale bağlıdır. Dakika kütle değişikliklerini tespit etme yeteneği, QCM-D'nin hedeflenen moleküler etkileşimleri izlemesini sağlar. Bu teknik, gerçek zamanlı olayları izlemek için kullanılabilir ve PNPE'nin farklı koşullar altında BMDC'lerle afinitesinin incelenmesine izin verir33.
PNPE'ye yapışma, sağlam hücreler yerine bEV'ler kullanılarak araştırıldı. İyi kontrol edilen basit APC'ler olarak, bEV'lerin ana hücrelerin özelliklerinin çoğunu miras aldığına inanılmaktadır. Genel olarak, küçük ve homojen parçacık boyutlarına sahip hücre dışı veziküller, yapışma tahlillerinde daha iyi performans gösterir. Böylece, bEV'ler 10, 5 ve 1 μm gözenek boyutları34 olan polikarbonat filtrelerden ekstrüzyon yoluyla hazırlandı. bEV'lerin çapı ve verimi, ekstrüzyon sayısını ve polikarbonat membranların gözenek boyutunu düzenleyerek kontrol edilebilir. Polikarbonat membranlardan 30 geçiş yapılması önerilir. Bununla birlikte, bu yöntemin aynı zamanda membranın bir kısmının ters çevrilebileceği ve DC yüzeyindeki proteinlerin bEV'lerde kapsüllenmesine neden olan ve emülsiyonlara olan afiniteyi biraz azaltan bir sınırlaması vardı.
Pozitif yüklü proteinler kullanılarak SiO2 sensör yüzeylerinin modifikasyonunun sonraki PNPE kaplaması için uygun olduğu gösterilmiştir. SiO2 sensör yüzeyleri ile PNPE arasındaki ara tabaka olarak PLL (Polikatyon polipeptit) uygulamasının hızlı kaplama yöntemi için bir gelişme olduğu kanıtlanmıştır. Herhangi bir olayın neden olduğu kütledeki değişiklikler, örneğin,SiO2 sensöründeki çözelti akışından herhangi bir bileşenin spesifik olmayan adsorpsiyonları, deneysel sonuçların doğruluğunu etkileyebilir35. Bu nedenle, spin kaplamadan sonra PLL'nin çip üzerinde tutarlı bir kaliteyi koruduğundan emin olmak gerekiyordu ve spesifik olmayan adsorpsiyonun neden olduğu ölçüm hatasını önlemek için yüzeyleri tamamen PNPE ile kaplanacaktı. Aynı zamanda, PNPE içeren mobil faz ile temas sırasında ΔF artık değişmediğinde, çip yüzeyinin tamamen kapalı olduğu düşünülüyordu. Bu, tespit edilen sinyallerin bEV'lerin PNPE'ye yapışmasıyla üretilmesini sağladı. QCM-D'nin, bEV'lerin PNPE'ye yapışmasını gerçek zamanlı olarak göstermek için iyi bir yöntem olduğunu ve PNPE'nin APC'lere olan yüksek afinitesini yansıttığını gösterdik. Ne yazık ki, bu yöntem bireysel hücreler ve dağıtım sistemi arasındaki etkileşimi yansıtamadı. Bu nedenle, daha doğru bir belirleme, protokolün daha fazla tasarlanmasını ve ölçüm prosedürünün optimizasyonunu gerektirecektir.
PNPE'nin bEV'lere olan yüksek afinitesini test ettikten sonra, gelişmiş içselleştirme daha da doğrulandı. Antijenlerin güçlü hücresel alımının PNPE'nin yüksek afinitesi ile ilişkili olduğunu gösterdik. PNPE, antijenlerin etkili bir şekilde yüklenmesi için çok seviyeli yapıya ve teslimatı artırmak için hücre zarı ile çok seviyeli temas için esnekliğe sahipti. Bu nedenle, rasyonel olarak tasarlanmış Pickering emülsiyonu, hücre zarı ile sağlam etkileşim yoluyla hücresel içselleştirmeyi ve hücre içi yolları uyardı. Bu avantajları gösteren PNPE, aşıları geliştirmek için yeni, güvenli ve etkili antijen dağıtım sistemlerinin geliştirilmesine ışık tutabilir.
Bu protokol, PNPE'nin immün hücrelerin fosfolipid çift katmanına yüksek afinitesini ve daha sonra antijenin in vitro immün hücrelere hücre içi iletimini başarıyla göstermiştir. Bu nedenle, farklı patojenlerden çeşitli antijen tipleri, bulaşıcı hastalıklara karşı koruma sağlamak için önerilen protokol kullanılarak verilebilir ve karakterize edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), Çin Bilimler Akademisi Temel Sınır Bilimsel Araştırma Programı (ZDBS-LY-SLH040), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Yenilikçi Araştırma Grupları Vakfı (Hibe No. 21821005) tarafından desteklenen Proje tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
