Summary
我们描述了两种互补的方案,以使用EdU(一种胸苷类似物)准确确定 酿酒酵母 的S期持续时间,该EdU在 体内 掺入并通过显微镜和流式细胞术使用Click化学进行检测。它可以轻松表征突变体中DNA复制的持续时间和被忽视的复制缺陷。
Abstract
真核DNA复制是一个高度调控的过程,可确保在染色体分离之前正确复制细胞的遗传蓝图。由于DNA合成缺陷是染色体重排的基础,因此监测DNA复制已成为了解基因组不稳定基础的关键。 酿酒酵母 是研究细胞周期调控的经典模型,但关键的DNA复制参数,如S期或S期持续时间的细胞比例,仍然难以确定。该协议在工程TK-hENT1酵母细胞中使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)(胸苷类似物)的短且无毒脉冲,然后通过Click反应进行检测,以允许通过显微镜和流式细胞术在单细胞和群体水平上以高空间和时间分辨率可视化和定量DNA复制。该方法可以识别酵母突变体的S期和细胞周期进程中以前被忽视的缺陷,从而允许表征对确保基因组稳定性至关重要的新参与者。
Introduction
通过有丝分裂的基因组稳定性是通过将一组完整且相等的染色体传递给两个产生的细胞后代来确保的。这依赖于在细胞周期的每个阶段的给定时间内发生的一系列事件的准确完成。在 G 1 中,复制来源是在招募几个许可因素(包括 Cdc61)后获得许可的。在S阶段,全基因组复制从多个活跃的复制起源开始,并由复制机器执行,这些机器聚集在显微镜下可见的灶中,称为复制工厂2。在M期,重复的姐妹染色单体附着并双向定向在有丝分裂纺锤体上,以允许它们分离到有丝分裂细胞3的相对极点。每个阶段的调控、正确完成和持续时间是确保基因组稳定性的关键。事实上,过早退出这些阶段中的任何一个都会导致基因组不稳定。例如,由出芽酵母CDK抑制剂Sic1缺失或G 1细胞周期蛋白过表达诱导的较短的G1将改变随后的S期4,5,6。因此,这些失调,无论是否与复制应激相关,都会导致染色体断裂、重排和错误分离4,5,6。因此,监测S期的持续时间以及更广泛地说,监测细胞周期其他阶段的持续时间对于识别不同突变体和不同应激条件下发生的缺陷可能至关重要。
测量细胞周期阶段持续时间的传统方法包括简单的DNA含量流式细胞术(图1A),并依赖于拟合算法(大多数细胞术软件中可用),用于将群体从1C和2C峰分离为G1,S和G2 + M相级分。然后将分数乘以总体倍增时间7。然而,该方法仅给出估计值,需要在给定级分内均匀的细胞大小分布,并且不适用于同步培养。为了研究哺乳动物细胞中的S期持续时间,已经开发并广泛使用了几种胸苷类似物,包括EdU。它们从细胞外培养基中摄取并被胸苷激酶(以下简称TK)磷酸化,使它们可用于DNA聚合酶,以将它们掺入DNA合成位点(复制,重组,修复)。为了绕过 酿酒 酵母细胞中TK基因的缺失,酵母菌株已被设计为允许单纯疱疹病毒TK8 和人平衡核苷转运蛋白(hENT1)9的稳定和组成性表达。一旦掺入 DNA 中,EdU 就会通过 选择性 Click 反应进行检测,该反应将其炔烃部分化学偶联到叠氮化物修饰的荧光染料10。
本文提供了两种优化的综合协议,用于使用 EdU 对异步和同步 TK-hENT1 工程细胞进行脉冲标记,以便通过显微镜和流式细胞术精确可视化和测量 DNA 复制持续时间和动态,以及细胞周期其他阶段的持续时间,在单细胞和群体水平上具有高空间和时间分辨率。
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Protocol
1. 酿酒酵母 细胞培养
注意:使用的酵母菌株列于表1中
注意:可以通过不同的方式监控 S 阶段持续时间。根据要解决的问题,细胞可以在G1 停滞后异步或同步生长。
- 来自异步生长的 酿酒酵母 细胞
注意:该方法允许确定异步生长的细胞群中S期细胞的百分比。通过确定倍增时间,可以推断S期(和其他相)的持续时间。- 将 酿酒酵母细胞 接种在10mL合成完全(SC)培养基中,以低细胞浓度(5×104 细胞/ mL)在30°C下以130rpm的轨道搅拌进行过夜培养。
注意:浓度是用细胞计数器测量的。为了有效地计算倍增时间,建议从仍处于指数期(即理想情况下低于2×107 个细胞/mL)的过夜培养物中接种培养物。不建议在富培养基(YPD)中生长细胞,因为EdU检测效率不高。 - 第二天,将细胞稀释在 20 mL 新鲜 SC 培养基中,终浓度为 5 ×10 5 个细胞/mL。
- 在30°C的振荡水浴中培养细胞,以120rpm的水平振荡。
- 每小时测量一次细胞浓度,直到达到 1 × 107 个细胞/mL。
注意:此步骤允许使细胞浓度随时间增加的图形表示。用于计算倍增时间的公式在 表2的图例中进行了解释。 - 当细胞浓度约为 2 × 106-5 × 106 细胞 /mL 时,并行进行 EdU 标记的步骤 2。
- 将 酿酒酵母细胞 接种在10mL合成完全(SC)培养基中,以低细胞浓度(5×104 细胞/ mL)在30°C下以130rpm的轨道搅拌进行过夜培养。
- 来自G1同步酿 酒酵母 细胞
注意:该方法允许通过流式细胞术和/或显微镜分析确定S期何时开始和结束。- 以低细胞浓度(5×104细胞/ mL)接种酿酒酵母细胞在10mLSC培养基中,在30°C下以130rpm的轨道搅拌进行过夜培养。
注意:请参阅步骤 1.1.1 之后的注释。 - 第二天,将细胞稀释在 20 mL 新鲜 SC 培养基中,终浓度为 2 × 10 6-3 ×10 6 个细胞/mL。
- 加入 40 μL 在水中稀释的 1 mg/mL α因子。
- 在30°C下以130rpm的轨道搅拌培养细胞1小时。
- 再次加入 40 μL 在水中稀释的 1 mg/mL α因子。
- 在30°C下以130rpm的轨道搅拌培养细胞1小时。
- 在光学显微镜下可视化细胞以监测G1 停滞。如果超过 90% 的单元格显示 shmoo,而其他单元格是圆形的、未发芽的单元格,则继续。
注意:根据使用的背景,建议在shmoo可视化之前对细胞进行超声处理。对于 W303 背景,超声处理 2 倍,每次 2 秒,振幅为 40-50。 - 以1,500× g离心3分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 将细胞重悬于 20 mL SC 培养基中。
- 重复步骤 1.2.8-1.2.9 一次。
注意:α因子通过这些步骤被冲走,细胞在细胞周期中释放。或者,可以通过使用1.2μm硝酸纤维素过滤器过滤酵母细胞来冲洗α因子,该滤斗设置在连接到真空泵的侧臂烧瓶上。 - 每 5 分钟收集 1 mL 细胞 2 次,然后继续执行步骤 2 进行 EdU 标记。
注意:仅用EdU对两个管中的一个的细胞进行脉冲标记。非脉冲标记的细胞用于区分双变量碘化丙啶(PI)-EdU图上的EdU阳性和EdU阴性细胞。 - 释放 30 分钟后加入 400 μL 1 mg/mL 用水稀释的 α 因子。
注意:需要这种高剂量的α因子来阻止下一个细胞周期的G1 期的细胞,并防止细胞重新进入随后的S期。
- 以低细胞浓度(5×104细胞/ mL)接种酿酒酵母细胞在10mLSC培养基中,在30°C下以130rpm的轨道搅拌进行过夜培养。
2. 教育标签
- 将 1 mL 细胞培养物转移到含有 1 μL 10 mM EdU 的 2.0 mL 微量离心管中。通过倒置混合均匀。
注意:为了区分 PI-EdU 双变量 FACS 上的 EdU 阳性细胞和 EdU 阴性细胞,请将另外 1 mL 细胞培养物转移到含有 1 μL DMSO 的 2.0 mL 微量离心管中。 - 在振荡水浴中搅拌下在30°C孵育3-5分钟。
注意:三分钟足以用显微镜进行EdU检测;在流式细胞仪上获得最佳EdU检测需要5分钟。 - 加入 100 μL 100% 乙醇停止反应。
- 如果需要测量细胞大小,则加入 100 μL 20% 多聚甲醛停止反应。
注意:如果要保持有丝分裂细胞的核结构完整,以便在Click反应后进行进一步分析,我们建议在室温(RT)下用2%多聚甲醛固定细胞,而不是将细胞放在冰上,因为后者会导致微管解聚。 - 在加入 100 μL 100% 乙醇之前,在变速摇杆上以 20 次倾斜/分钟的速度在变速摇杆上温和搅拌下将细胞在室温下放置 20 分钟,以固定细胞。
- 如果需要测量细胞大小,则加入 100 μL 20% 多聚甲醛停止反应。
3. 细胞固定和透化
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。使用真空移液器除去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 500 μL 70% 乙醇中。通过涡旋充分混合。
- 在变速摇臂上以 20 次倾斜/分钟在室温下放置 ≥ 小时以透化细胞。
注意:在SC培养基中生长的细胞不能很好地沉淀,因为它们倾向于粘附在微量离心机壁上。添加乙醇可改善造粒并减少细胞损失。细胞可以在4°C下储存过夜或在-20°C下储存更长时间。 - 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 用 500 μL 10% 乙醇在 PBS 中洗涤细胞 2 倍。
注意:洗涤对于从细胞中去除未掺入的EdU至关重要。
4. 点击反应
- 用于细胞术分析
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 将沉淀重悬于含有 0.1 mg/mL RNase A 和 0.2 mg/mL 蛋白酶 K 的 200 μL PBS 中。
- 在50°C下孵育1-2小时,偶尔摇动(或在37°C下过夜)。
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 用 500 μL PBS 洗涤细胞。
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS + 1% 牛血清白蛋白 (BSA) 中。在室温下孵育30分钟。
注意:更长的时间是不必要的,甚至不利于点击反应的效率。 - 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 将沉淀重悬于 300 μL PBS + 1% BSA 中。
- 将细胞分布在两个管之间:200 μL 在 1.5 mL 微量离心管中用于 Click 反应,100 μL 在另一个 1.5 mL 微量离心管中用于 Sytox Green 染色。
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 用于赛托克斯绿染色
注意:我们强烈建议等分试样进行Sytox Green染色(无Click),以获得高质量的DNA含量参考谱。事实上,Click反应强烈淬灭插层荧光,包括Sytox Green和PI荧光。因此,咔嗒反应会扭曲DNA含量的读取。- 将细胞沉淀重悬于 100 μL PBS 中。
- 将 10-30 μL(取决于细胞浓度)转移到含有 300 μL 50 mM Tris-HCl、pH 7.5 和 0.5 μM Sytox Green 的流式细胞仪管中。
- 超声处理2x,每次2秒,振幅为40-50。
- 在黑暗中放置,直到在流式细胞仪上处理样品。
注意:细胞可以在此阶段在4°C下保存几天。
- 对于点击反应
- 通过按以下顺序混合试剂(一管的数量)制备新鲜叠氮化物染料缓冲液:36 μL PBS、2 μL 0.2 M CuSO4、0.2 μL 2 mM Cy5 叠氮化物和 2 μL 1 M 抗坏血酸。
注意:可以制备叠氮化物染料缓冲液的预混液。试剂必须按照与上述相同的顺序混合。 - 用 40 μL 新鲜制作的叠氮化物染料混合物重悬细胞沉淀。在室温下在黑暗中孵育60分钟。
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 用 300 μL 10% 乙醇在 PBS 中洗涤细胞 3 倍。
注意:洗涤液对于消除所有可溶性EdU-Cy5叠氮化物至关重要。 - 将细胞重悬于 PBS 中的 100 μL 50 μg/mL PI 中。在黑暗中放置10分钟。
- 将 10-30 μL 细胞悬液(取决于细胞浓度)转移到含有 300 μL 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)的流式细胞仪管中。
- 超声处理2x,每次2秒,振幅为40-50。
- 在黑暗中放置,直到在细胞仪上处理样品。
注意:细胞可以在此阶段在4°C下保存几天。
- 通过按以下顺序混合试剂(一管的数量)制备新鲜叠氮化物染料缓冲液:36 μL PBS、2 μL 0.2 M CuSO4、0.2 μL 2 mM Cy5 叠氮化物和 2 μL 1 M 抗坏血酸。
- 使用 488 nm 的激发蓝色激光和 530/30 BP 滤光片读取 Sytox Green 样品。典型结果见 图1A 。使用 488 nm 的激发蓝色激光和 PI(x 轴)的 615/20 BP 滤光片和 640 nm 的激发红色激光和 660/20 BP 滤光片(y 轴)在点图上读取双变量 PI-EdU 样品。典型结果见 图1B 。
注意: 图1C 表示EdU阴性细胞的典型PI-EdU双变量FACS结果。它允许区分EdU阴性细胞和EdU阳性细胞。
- 用于显微镜分析
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 将沉淀重悬于 200 μL PBS + 1% BSA 中。在室温下孵育30分钟。
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 通过按以下顺序混合试剂(一管的数量)制备新鲜叠氮化物染料缓冲液:36 μL PBS、2 μL 0.2 M CuSO4、0.2 μL 2 mM Dy-530 叠氮化物、2 μL 1 M 抗坏血酸。
注意:叠氮化物染料缓冲液的预混液可以通过按上述顺序混合试剂来新鲜制备。 - 用 40 μL 新鲜制作的叠氮化物染料缓冲液重悬沉淀。在室温下在黑暗中孵育60分钟。
- 在微量离心机中以10,000 ×g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 用 300 μL 10% 乙醇在 PBS 中洗涤细胞 2 倍。
注意:洗涤对于消除所有可溶性Dy-530叠氮化物至关重要。 - 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 将细胞重悬于 PBS 中的 100 μL 0.5 μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 中。在室温下在黑暗中放置30分钟。
- 在微量离心机中以10,000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 用 300 μL PBS 洗涤以去除多余的 DAPI。
- 在微量离心机中以10,000 ×g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
- 根据细胞浓度,用 10-50 μL PBS 重悬沉淀。
- 超声处理2x,每次2秒,振幅为40-50。
注意:细胞可以在此阶段在4°C下保存几天。 - 将 1.7 μL 细胞移液到玻璃显微镜载玻片上,并用干净的盖玻片盖住。
- 立即在带有DAPI和TexasRed或Cy3滤光片的荧光显微镜下观察。
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Representative Results
为了确定S期持续时间,更广泛地说,G 1和G2 + M的持续时间(方案步骤1.1),酿酒酵母W303野生型细胞(WT,表1)在SC培养基中异步生长7小时。每小时监测一次细胞浓度以确定倍增时间(图2B)。在这些生长条件下,计算的倍增时间为25°C下的120分钟±13分钟(表2)。当细胞处于指数期(2× 106-5×106细胞/ mL)时,用EdU(10μM)脉冲标记等分细胞5分钟,以挑选出S期的细胞并确定G1,S和G2 + M期的细胞百分比。在双变量EdU-PI细胞仪分析中观察到三个细胞群(图1B)。使用对照实验对EdU阴性和EdU阳性群体进行区分,其中细胞未用EdU脉冲标记,但进行了Click反应(图1C)。PI强度相差两倍的左下角和右下角区域的两个EdU阴性群体分别对应于G1和G2 + M(图1B,C)。因此,上层群体(强度为>1×104-2×104)对应于脉冲时处于S期的EdU阳性细胞(图1B)。因此,27%±5%的细胞群处于G1期,29%±3%处于S期,44%±2%处于G2 + M期。由于在这些条件下的倍增时间为120分钟±13分钟,我们推断G1,S和G 2 + M相在25°C下分别持续了32分钟±4分钟,35分钟±6分钟和53分钟±7分钟(表2和表3)。
接下来,我们旨在验证这种方法,并证明它足够灵敏,可以识别迄今为止一直被忽视的DNA复制缺陷的突变体。我们认为,DNA复制中涉及的因子的可调功能丧失等位基因将是理想的验证对照。因此,我们使用含有对温度敏感的cdc6-1突变体的酵母菌株(表1)11。Cdc6 是一种重要的许可因子,在晚期 M 和G 1 中表达,用于在 ORC 结合的染色体位点上组装复制前复合物 (preRC),这些复合物以后可能用作复制起源。因此,在允许温度下,其S相持续时间应与WT相同,而在限制温度下,不应发生DNA复制,因为没有来源获得许可12。然而,在半允许的温度下,许可的起源较少,但足以赋予细胞活力(我们未发表的数据;Barba Tena等人,正在准备中),我们预计每个阶段的持续时间不同。正如预期的那样,基于跌落测试,cdc6-1细胞在允许温度(即25°C,图2A)下生长与WT细胞相同,显示出相同的倍增时间(图2B和表2),但在34°C或更高温度下死亡(图2A)。感兴趣的是,在半允许温度(即28°C)下,cdc6-1是可行的(28°C,图2A)。然而,倍增时间比WT长(图2B和表2),并且每个阶段的持续时间不同。事实上,在cdc6-1中,G 1 略短(1 分钟±1 分钟± 16 分钟),而 S 期略微延长(34 分钟± 4 分钟± 5 分钟),G2 + M 期明显更长(77 分钟± 4 分钟± 3 分钟)(图 2C,D 和表 3)。令人惊讶的是,S期并没有延长太多,但EdU信号的平均强度降低了25%(图2C,D),这与从较少来源开始的S期一致。此外,虽然EdU阳性WT细胞均匀分布在早期(S1)和晚期S期(S2)之间(图2C,补充图S1A,早期[S1]和晚期S期[S2]期,在上门用垂直虚线分隔),但65%的EdU阳性cdc6-1细胞在S期晚期积累(图2D,补充图S1B)。 S和G 2 + M群体之间甚至没有明显的区别(图2D),这表明细胞在进入G2期之前努力完成S期。因此,该方法适合且敏感地识别在S期(持续时间和/或分布)和细胞周期阶段持续时间中具有缺陷的突变体。
设计了一种互补的方法来确定细胞何时开始和完成其DNA复制,并使用同步细胞估计S期持续时间(协议步骤1.2)。为此,使用α因子与G1中的同步细胞,在SC培养基中释放细胞并每5分钟收集一次。根据Sytox Green流式细胞仪图上DNA含量从1C变为2C的时间,S期的持续时间可能约为25分钟(图3A)。然而,这种估计取决于群体中的重要细胞部分何时掺入了足够的Sytox Green以在FACS谱中看到。此方法无法检测到早期和晚期复制事件。为了准确定义S期何时开始和结束以及持续多长时间,在G1释放后每5分钟用EdU(10μM)脉冲标记5分钟时,从等分细胞中挑出S期细胞。正如预期的那样,在释放后的前10分钟内,所有细胞都在左下角区域(即,在G1,图3B,补充图S2中)。释放十五分钟后,已经检测到一小部分EdU阳性细胞(分别比较补充图S2和补充图S3中的前两行,分别是EdU处理和无EdU的细胞),表明S期已经开始(图3C)。在双变量PI-EdU图中,细胞云首先向上移动,然后向右移动,可以看到通过S期的进展(图3D-F)。最后,在释放后35分钟,一小部分细胞为EdU阴性,但DNA量是其两倍,表明这些细胞已完成S期并且处于G2 + M期(图3G)。因此,在这些条件下,S期持续20分钟。值得注意的是,尽管观察到与Sytox Green检测到的DNA含量叠加的高度同步,表明释放后40分钟整个群体的S期结束,但双变量分析显示,一些细胞在释放后60分钟完成S期,并且释放后65分钟整个群体的S期完成(图3H,I和补充图S2)。
此外,S期和DNA合成可以通过显微镜监测。从每个激活的复制起源,DNA合成由两个拴系的爬酶体进行,形成核复制焦点,随后可以通过成像复制因子和/或操作员阵列的标记版本及其相应的阻遏因子融合到荧光蛋白2,13。或者,可以使用胸苷类似物14,15通过显微镜检测DNA合成。我们使用EdU来监测经历DNA合成的亚核DNA区域。为此,我们在28°C下用EdU(10μM)脉冲标记异步WT和cdc6-1细胞3分钟,并在Click反应后对其进行成像。我们期望根据DNA合成速率和3分钟EdU脉冲期间细胞周期中的细胞进展来检测EdU信号强度的变化(即,在S期花费整整3分钟的细胞将显示比脉冲期间进入或退出S期的细胞更强的信号)。因此,WT S期细胞在其细胞核中显示出强度不同的EdU信号(图4A)。S相持续时间可以很容易地从该分析中推断出来。事实上,从两个生物学重复(至少计数150个细胞)确定,34%±3%和38%±3%的WT和cdc6-1细胞分别为EdU阳性。在这些生长条件下,WT和cdc6-1细胞的倍增时间分别为90分钟和123分钟(表2),我们推断S期分别持续了31分钟和47分钟。前者的结果与我们的FACS分析结果一致(表3),表明通过显微镜检测EdU阳性细胞可以确定S期持续时间。值得注意的是,后者高于从我们的FACS分析中推断的S期持续时间,因为S和G2 + M群体之间没有明显的区别(图2D)。在WT细胞中很容易观察到EdU病灶(图4B),但在cdc6-1细胞中更暗,更少(图4C)。为了排除WT和cdc6-1细胞之间的EdU信号强度差异取决于S期步长的可能性,从同步细胞中量化强度。正如预期的那样,cdc6-1细胞中的平均EdU信号强度降低了三倍(图4D),与从较少的复制起源开始的DNA复制一致。EdU信号仅限于细胞核,与强DAPI信号共定位,并以球状模式组织,与核区域或复制工厂中的DNA复制组织一致。重要的是,EdU仅在未出芽或小芽细胞中检测到,从未存在于具有大芽的细胞中,这表明WT酵母细胞在进入有丝分裂时已经完成复制。因此,该方法对于以高空间分辨率可视化DNA复制以及检测和量化轻度DNA复制缺陷非常敏感。
图1:具有代表性的FACS分析。 (A)在25°C下生长的WT细胞的代表性Sytox Green FACS分析。 (B,C)代表性EdU-PI双变量FACS分析,用于在25°C下生长的WT细胞,并用EdU(10μM)或1μLDMSO脉冲标记5分钟。两个分析中的多边形相同。C用于将EdU阴性与EdU阳性细胞区分开来(通常,极限设置为强度>1×10 4-2×104)。顶部多边形门描绘了 EdU 阳性细胞(S 期分数)。请点击此处查看此图的大图。
图 2:异步细胞群中 G 1、S 和 G2 + M 细胞周期阶段的细胞比例。 (A)WT和cdc6-1菌株在富培养基上以连续五倍稀释度点样,并在25°C,28°C或34°C下生长。 (B)种群倍增时间。在25°C或28°C下生长异步WT和cdc6-1细胞,每小时测量细胞浓度7小时。 (C,D)EdU-PI双变量FACS分析在28°C下生长的WT和cdc6-1细胞,并用EdU(10μM)脉冲标记5分钟。将总体倍增时间乘以 S 相分数得到 S 相持续时间。将 EdU 阳性和 EdU 阴性像元的平均强度计算为相应多边形中每个值的强度平均值。WT和cdc6-1 EdU阴性细胞的平均强度(分别为5,077和4,454)归一化为1。WT和cdc6-1 EdU阳性细胞的平均强度(分别为52,604和36,141)除以用于每种菌株的归一化因子。获得的值分别为10.4和8.1(即减少25%,如文中所述)。缩写:WT = 野生类型;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;FACS = 荧光激活细胞分选;PI = 碘化丙啶。请点击此处查看此图的大图。
图3:同步电池上S相持续时间的测定。 (A)28°C下α因子释放后WT细胞DNA含量的时间过程分析。 指示的时间考虑了EdU脉冲的持续时间(5分钟)。(B-I)EdU-PI双变量FACS分析同步WT细胞,用EdU(10μM)脉冲标记5分钟,并在G1停滞释放后的指定时间收集。缩写:WT = 野生类型;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;FACS = 荧光激活细胞分选;PI = 碘化丙啶。请点击此处查看此图的大图。
图 4:通过显微镜进行 EdU 检测和定量。将异步WT和cdc6-1菌株在28°C下生长2小时,然后用EdU(10μM)脉冲标记3分钟,并使用适当的激发/发射滤光片通过宽场显微镜成像。(A)来自WT和(B,C)WT和cdc6-1的单个细胞的广角显微镜的代表性图像,由DIC可视化并用DAPI或EdU染色,如图所示。(A)和(B,C)中的比例尺分别为10μm和2μm。(D)从G 1停滞释放后30分钟在28°C下生长的同步WT和cdc6-1细胞的EdU强度测量。该图表示三个生物重复的汇集(每个生物重复中至少计数50个细胞)。平均±标差显示在图表上。WT和cdc6-1细胞之间的未配对双尾t检验由****(p < 0.0001)表示。缩写:WT = 野生类型;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;DIC = 微分干涉对比;DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚;A.U. = 任意单位。请点击此处查看此图的大图。
名字 | 基因型 | 数字和表格 | ||
WT (E3087): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | 图1, 图2A,B,C, 图3, 图4A,B,D, SUPP 图1,2,3 表2,3 | ||
CDC6-1 (E5956): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | 图2A,B,D,图4 C,D,增补图1,表2,3 | ||
TK+ (E1000): | 垫a, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) | 参考图4 | ||
TK+ hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | 参考图4 | ||
hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 | 参考图4 | ||
疾病预防控制中心6-1 TK+ hENT+ (E3968): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | 参考图4 | ||
W303-1A (E001): | 马塔, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 | 参考图4 |
表1:本研究中使用的菌株列表。
文晔 | 疾病预防控制中心6-1 | |||
25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |
倍增时间(分钟) | 120 | 90 | 118 | 123 |
标清 | ± 13分钟 | ± 3分钟 | ± 10分钟 | ± 6分钟 |
表2:在25°C和28°C下生长的WT和 cdc6-1 菌株的平均倍增时间。 倍增时间从三个生物重复(每个生物重复四个技术重复)使用以下公式计算:Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci),其中 Cf 和 Ci 分别对应于最终和初始细胞浓度,Δt 对应于测量 Cf 和 Ci 时 tf 和 ti 之间的分钟差, 分别。
文晔 | 疾病预防控制中心6-1 | |||||||
25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |||||
百分之 | 期间 (分钟) |
百分之 | 期间 (分钟) |
百分之 | 期间 (分钟) |
百分之 | 期间 (分钟) |
|
G1 | 27 | 32 | 18 | 16 | 13 | 16 | 10 | 12 |
S | 29 | 35 | 32 | 29 | 28 | 34 | 28 | 34 |
G2+M | 44 | 53 | 50 | 45 | 59 | 71 | 62 | 77 |
SD G1 | ±5 | ±4 | ±3 | ±2 | ±2 | ±1 | ±1 | ±1 |
SD S | ±3 | ±6 | ±5 | ±5 | ±5 | ±7 | ±4 | ±4 |
标清G 2+M | ±2 | ±7 | ±4 | ±3 | ±4 | ±4 | ±6 | ±4 |
表3:在25°C和28°C下生长的WT和cdc6-1细胞中细胞的平均分数和G1,S和G2 + M相的持续时间。 细胞的分数是从三个生物学重复中确定的(每个生物重复的两个技术重复)。在28°C下生长的WT和cdc6-1细胞之间的G 1,S和G2 + M持续时间的差异具有统计学意义(未配对的双尾t检验,p <0.1)。
补充图S1:WT和 cdc6-1 细胞在28°C下生长的早期和晚期S期的细胞分数。 在EdU阳性细胞的分数中,分别在EdU阳性细胞的分数中绘制两个相同的多边形,分别命名为S1和S2,以将其分成两半,用于(A)在28°C下生长的WT细胞和(B)在28°C下生长的 cdc6-1 细胞。 请点击这里下载此文件。
补充图S2:EdU-PI双变量FACS可视化的从G1 停滞释放后EdU脉冲标记细胞的细胞周期进程。 如图所示,在28°C下从α因子停滞释放后,每5分钟用10μM EdU脉冲标记细胞5分钟,直到80分钟。缩写:EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;FACS = 荧光激活细胞分选;PI = 碘化丙啶。 请点击此处下载此文件。
补充图S3:由EdU-PI双变量FACS可视化的G1停滞释放后DMSO处理的细胞的细胞周期进程。这与补充图2相同,但将细胞用1μL DMSO(二甲基亚砜)孵育5分钟。请点击此处下载此文件。
补充图S4:TK hENT1酵母细胞中的BrdU和EdU毒性。 在含有增加浓度的BrdU或EdU的YPD平板上以五倍连续稀释液点样指示基因型的细胞,并在30°C下生长40小时。 缩写:DMSO = 二甲基亚砜;BrdU = 溴脱氧尿苷;Edu = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;TK = 胸苷激酶;hENT1 = 人平衡核苷转运蛋白。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
酵母是细胞周期研究的主要模式生物,但其S期的表征长期以来一直受到阻碍,因为它无法结合外源性核苷,如BrdU,其用作DNA复制的示踪剂。为酵母配备高表达的单纯疱疹胸苷激酶(TK)并添加人核苷转运蛋白(hENT)在很大程度上解决了这个问题15,16。与抗BrdU抗体不同,EdU比BrdU更通用,因为它使用小荧光叠氮化物和Click化学进行检测,适用于透化的酵母细胞和FACS分析17。在这里,我们优化了该TK-hENT1菌株中EdU标记和检测的条件,并表明可以使用该协议通过FACS或显微镜量化以前未检测到的复制缺陷。
使用可能干扰相同机制的工具研究生物机制是生物学中的常见问题。由于EdU具有已知的细胞毒性作用,我们搜索了在长期暴露于工程TK-hENT1菌株时无毒的EdU浓度,发现10μM是合适的剂量。TK-hENT1细胞在25μM EdU时无法增殖,而TK单独或hENT1单独细胞很容易承受100μM EdU(补充图S4)。尽管酵母细胞对EdU的敏感性比BrdU高得多,但我们发现增殖仅在EdU暴露后的第二个细胞周期后下降,这表明需要将其掺入两条链上以影响细胞增殖(数据未显示)。为了保持安全,我们在整个协议中使用了10μM EdU,仅使用短脉冲(显微镜为3分钟;FACS为5分钟),并发现这适合使用这种优化的方案进行良好的检测。
DNA复制中的细微缺陷可能对染色体重排产生强烈影响4。因此,开发能够检测这些细微缺陷的技术和方案是揭示染色体畸变病因的关键。在这里,我们表明这种优化的EdU掺入和检测方案可以测量信号强度降低多达三倍(图2和图4),表明在28°C下生长的温度敏感cdc6-1细胞中的DNA合成速率降低,到目前为止,板活力测定没有缺陷(图2A).因此,这种EdU掺入和定量方案可用于筛选最初未怀疑复制缺陷的其他突变体。此外,检测有丝分裂 DNA 合成 (MiDAS)、减数分裂重组依赖性 DNA 合成或其他长束 DNA 合成可能有用。
一个缺点是EdU检测只能在固定细胞上进行,从而排除了PCNA-GFP或其他DNA复制荧光读数那样的实时分析,后者本身受到用于成像的激光束的高光毒性的影响。在合成培养基中生长细胞对于最佳检测至关重要,因为YPD残留物似乎可以显着淬灭Click反应。有趣的是,使用同步群体的双变量EdU-PI FACS分析挑出S期细胞,可以估计单个细胞中S期的持续时间为20分钟(图3,补充图S2和补充图S3)。然而,即使当α因子释放后的同步性看起来与经典的Sytox Green FACS分析(图3A)一样近乎完美时,从双变量EdU-PI FACS分析中可以清楚地看出,细胞相对异步地进入S期(图3B-I)。
在这里,我们描述了三种方法,用于在单细胞和群体水平上使用流式细胞术和显微镜在同步和异步细胞上确定S期持续时间。使用流式细胞术和显微镜在群体水平上确定的异步WT细胞中确定的平均S期持续时间相似,分别为29分钟和31分钟,而我们基于同步单细胞的方法表明持续时间可以短至20分钟(图2,图3,图4和表3 ).这些值之间的差异令人惊讶,但可以很容易地解释。事实上,使用我们基于单细胞的方法,S期持续时间是根据最早的事件(即,第一个进入和退出S期的细胞,图3C,G)确定的,但这并不意味着S期在群体中的每个细胞中持续20分钟。这些数据将支持一个意想不到的观点,即细胞之间的S期持续时间存在一定程度的异质性。
改进的协议或新技术可以推翻长期存在的教条或新颖的想法。这些数据面临三个挑战。首先,人们认为DNA合成与酿酒酵母的芽出现是伴随的。图4A-C显示,尽管有3分钟的标记滞后,但EdU染色在未出芽和小出芽细胞中最强,表明S期在出芽之前明显开始,如前所示16。其次,据报道酵母细胞没有G2期,有丝分裂纺锤体与DNA合成同时形成。非常短的脉冲与通过FACS(图3,补充图S2和补充图S3)或显微镜(图4)进行的灵敏EdU检测相结合,可以精确确定S期在单个细胞中的开始和结束时间。通过这样做,我们发现批量DNA合成在α因子释放后40分钟完成(图3,补充图S2和补充图S3),而短的有丝分裂纺锤体仅在20分钟后形成16(数据未显示)。我们得出结论,酵母细胞具有G2相。第三,最近有人提出,高达30%的酵母细胞在后期-端相18中完成DNA合成。使用这种优化的方案,我们没有检测到显示期/端相纺锤体的细胞中的EdU掺入(数据未显示),但我们不能排除第二波DNA合成低于使用的检测阈值。鉴于强大的信噪比,我们认为后一种选择不太可能。
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Disclosures
提交人声明,他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者希望感谢国家研究局(ANR)和癌症研究协会(ARC)向JDD提供博士奖学金,并感谢国家研究机构(ANR)的财政支持(赠款ANR-18-CE12-0018-01)。细胞术和显微镜检查在蒙彼利埃MRI BioCampus成像设施中进行。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
α-factor | Genescript | RP01002 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100--812-E | |
Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
Rnase | SIGMA | R5000 | |
Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
Equipment | |||
Cell counter | OLS | CASY | |
Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
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