Summary
우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.
Abstract
진핵생물 DNA 복제는 염색체 분리 전에 세포의 유전적 청사진이 올바르게 복제되도록 하는 고도로 조절된 과정입니다. DNA 합성 결함이 염색체 재배열의 기초가 됨에 따라 DNA 복제 모니터링은 게놈 불안정성의 기초를 이해하는 데 필수적이 되었습니다. 사카로마이세스 세레비지애 는 세포 주기 조절을 연구하는 고전적인 모델이지만 S기의 세포 분율 또는 S기 기간과 같은 주요 DNA 복제 매개변수는 여전히 결정하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 조작된 TK-hENT1 효모 세포에서 티미딘 유사체인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 짧고 독성이 없는 펄스를 사용한 다음 클릭 반응으로 검출하여 현미경 및 유세포분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 효모 돌연변이체의 S 단계 및 세포주기 진행에서 이전에 간과 된 결함을 식별 할 수 있으므로 게놈 안정성을 보장하는 데 필수적인 새로운 플레이어의 특성화를 허용합니다.
Introduction
유사분열 분열을 통한 게놈 안정성은 완전하고 동일한 염색체 세트를 생산된 두 세포 자손으로 전달함으로써 보장됩니다. 이것은 세포주기의 각 단계에서 주어진 시간에 발생하는 일련의 사건의 정확한 완료에 의존합니다. G 1에서 복제 원본은 Cdc61을 포함한 여러 라이센스 요소를 모집할 때 라이센스가 부여됩니다. S 단계에서 전체 게놈 복제는 여러 활성 복제 기점에서 시작되고 복제 공장2이라는 현미경으로 보이는 초점에 모이는 복제 기계에 의해 수행됩니다. M 단계에서, 복제 된 자매 염색분체는 유사 분열 방추에 부착되고 이중 배향되어 유사 분열 세포3의 반대 극으로 분리 될 수 있습니다. 각 단계의 조절, 적절한 완료 및 기간은 게놈 안정성을 보장하는 데 중요합니다. 실제로, 이러한 단계에서 조기 종료는 게놈 불안정성을 초래합니다. 예를 들어, 출아 효모 CDK 억제제 Sic1의 결실 또는 G1 사이클린의 과발현에 의해 유도된 더 짧은G1은 후속 S상 4,5,6을 변화시킬 것이다. 결과적으로, 복제 스트레스와 관련이 있든 없든 이러한 규제 완화는 염색체 파괴, 재 배열 및 잘못된 분리 4,5,6을 초래합니다. 따라서 S 단계의 지속 기간 및보다 광범위하게는 세포주기의 다른 단계의 지속 시간을 모니터링하는 것은 다른 돌연변이 체 및 다른 스트레스 조건에서 발생하는 결함을 식별하는 데 중요 할 수 있습니다.
세포 주기 단계 기간을 측정하는 전통적인 방법에는 간단한 DNA 함량 유세포분석(그림 1A)이 포함되며 집단을 1C 및 2C 피크에서 G1, S 및 G2 + M 상 분획으로 분리하는 데 사용되는 피팅 알고리즘(대부분의 세포분석 소프트웨어에서 사용 가능)에 의존합니다. 그런 다음 분수에 인구 배가 시간7을 곱합니다. 그러나 이 방법은 추정된 값만 제공하고 주어진 분획 내에서 균질한 세포 크기 분포가 필요하며 동기화된 배양에는 적용할 수 없습니다. 포유류 세포에서 S- 기 지속 시간을 연구하기 위해 EdU를 포함한 여러 티미 딘 유사체가 개발되어 널리 사용되었습니다. 세포 외 배지로부터의 흡수와 티미 딘 키나아제 (이하 TK라고 함)에 의한 인산화는 DNA 중합 효소가 DNA 합성 (복제, 재조합, 복구) 부위에 이들을 통합 할 수있게한다. 사카로마이세스 세레비지애 세포에서 TK 유전자의 부재를 우회하기 위해 효모 균주는 단순 포진 바이러스 TK8 및 인간 평형 뉴클레오시드 수송체(hENT1)9의 안정적이고 구성적인 발현을 허용하도록 설계되었습니다. 일단 DNA에 통합되면, EdU는 선택적 클릭 반응을 통해 검출되며, 이는 알킨 부분을 아지드-개질된 플루오로크롬10에 화학적으로 결합시킨다.
이 백서는 현미경 및 유세포 분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제 기간 및 역학뿐만 아니라 세포 주기의 다른 단계의 지속 시간을 정확하게 시각화하고 측정하기 위해 EdU를 사용하여 비동기 및 동기식 TK-hENT1 엔지니어링 세포에 대한 두 가지 최적화된 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.
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Protocol
1. S. 세레비시아에 세포 배양
참고: 사용된 효모 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.
알림: S상 지속 시간은 다양한 방법으로 모니터링할 수 있습니다. 다루어야 할 질문에 따라, 세포는G1 정지 후에 비동기적으로 또는 동기적으로 성장될 수 있다.
- 비동기적으로 성장하는 S. 세레비시아에 세포에서
참고: 이 방법을 사용하면 비동기적으로 증가하는 세포 집단에서 S 단계의 세포 백분율을 결정할 수 있습니다. 배가 시간을 결정함으로써 S 상 (및 다른 상)의 지속 시간을 외삽 할 수 있습니다.- S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 104 cells/mL)의 합성 완전(SC) 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반으로 30°C에서 밤새 배양합니다.
알림: 농도는 세포 카운터로 측정됩니다. 배가 시간을 효율적으로 계산하려면 아직 지수 단계에 있는 야간 배양(즉, 이상적으로는 2 × 107 cells/mL 미만)에서 배양을 접종하는 것이 좋습니다. 풍부한 배지(YPD)에서 세포를 성장시키는 것은 EdU 검출이 효율적이지 않기 때문에 권장되지 않습니다. - 다음날, 세포를 5 × 105 cells/mL의 최종 농도로 20 mL의 새로운 SC 배지에 희석한다.
- 세포를 120 rpm에서 수평 진탕과 함께 진탕수조에서 30°C에서 배양한다.
- 1 × 107 cells/mL에 도달할 때까지 매시간 세포 농도를 측정합니다.
참고: 이 단계에서는 시간 경과에 따른 세포 농도 증가를 그래픽으로 표현할 수 있습니다. 배가 시간을 계산하는 데 사용되는 공식은 표 2의 범례에 설명되어 있습니다. - 세포 농도가 약 2 × 10 6-5 × 106 cells/mL인 경우 EdU 라벨링을 위한 2단계와 병행하여 진행합니다.
- S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 104 cells/mL)의 합성 완전(SC) 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반으로 30°C에서 밤새 배양합니다.
- G1 동기화 된 S. 세레 비시 애 세포에서
참고: 이 방법을 사용하면 유세포 분석 및/또는 현미경 분석을 통해 S상이 시작되고 끝나는 시기를 결정할 수 있습니다.- S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 104 cells/mL)의 SC 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반과 함께 30°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 1.1.1단계 이후의 참고를 참조하십시오. - 다음날, 세포를 2 × 106-3 × 106 cells/mL의 최종 농도로 20mL의 새로운 SC 배지에 희석한다.
- 물에 희석한 1mg/mL α인자 40μL를 추가합니다.
- 세포를 30°C에서 1시간 동안 130rpm으로 오비탈 교반하면서 배양한다.
- 물에 희석한 1mg/mL α인자 40μL를 다시 추가합니다.
- 세포를 30°C에서 1시간 동안 130rpm으로 오비탈 교반하면서 배양한다.
- G1 정지를 모니터링하기 위해 광학 현미경으로 세포를 시각화합니다. 세포의 90 % 이상이 shmoo를 표시하고 나머지는 둥글고 싹이 트지 않은 세포 인 경우 진행하십시오.
참고: 사용된 배경에 따라 shmoo 시각화 전에 셀을 초음파 처리하는 것이 좋습니다. W303 배경의 경우 2-2의 진폭에서 매번 40초 동안 50x를 초음파 처리합니다. - 1,500 × g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포를 20mL의 SC 배지에 재현탁시킨다.
- 1.2.8-1.2.9단계를 한 번 반복합니다.
참고: α 인자는 이러한 단계로 씻겨 나가고 세포는 세포 주기에서 방출됩니다. 대안적으로, α-인자는 진공 펌프에 연결된 측-암 플라스크 상의 깔때기 세트를 사용하여 1.2μm 니트로셀룰로스 필터로 효모 세포를 여과함으로써 세척될 수 있다. - 5분마다 2x 세포 1mL를 수집하고 EdU 라벨링을 위해 2단계로 진행합니다.
알림: 두 튜브 중 하나의 셀에만 EdU를 사용하여 펄스 라벨을 붙입니다. 펄스 표지되지 않은 세포는 이변량 프로피듐 요오드화물(PI)-EdU 그래프에서 EdU 양성 세포와 EdU 음성 세포를 구별하는 데 사용됩니다. - 방출 후 30분 후에 물에 희석한 1mg/mL α인자 400μL를 추가합니다.
참고: 이 고용량의 α인자는 다음 세포 주기의 G1 단계에서 세포를 정지시키고 세포가 후속 S 단계로 다시 들어가는 것을 방지하는 데 필요합니다.
- S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 104 cells/mL)의 SC 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반과 함께 30°C에서 밤새 배양합니다.
2. EdU 라벨링
- 1mL의 세포 배양물을 1μL의 10mM EdU가 들어 있는 2.0mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다. 반전으로 잘 섞는다.
참고: PI-EdU 이변량 FACS에서 EdU 양성 세포와 EdU 양성 세포를 구별하려면 1μL의 DMSO가 포함된 2.0mL 미세원심 분리 튜브에 또 다른 1mL의 세포 배양물을 옮깁니다. - 진탕 수조에서 교반 하에 30°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
참고: 현미경으로 EdU 검출에는 3분이면 충분합니다. 유세포분석기에서 최적의 EdU 검출을 위해서는 5분이 필요합니다. - 100 μL의 100% 에탄올을 첨가하여 반응을 중지시킨다.
- 세포 크기 측정이 필요한 경우 100 μL의 20% 파라포름알데히드를 첨가하여 반응을 중지합니다.
참고: 유사분열 세포의 핵 구조를 클릭 반응 후 추가 분석을 위해 그대로 유지해야 하는 경우, 세포를 얼음 위에 두는 것보다 실온(RT)에서 2% 파라포름알데히드로 세포를 고정하는 것이 좋습니다. - 100 % 에탄올 100 μL를 첨가하기 전에 세포를 고정하기 위해 가변 속도 로커에서 20 틸트 / 분으로 가벼운 교반하에 RT에서 20 분 동안 세포를 그대로 두십시오.
- 세포 크기 측정이 필요한 경우 100 μL의 20% 파라포름알데히드를 첨가하여 반응을 중지합니다.
3. 세포 고정 및 투과화
- 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 진공 피펫을 사용하여 상청액을 제거한다.
- 세포 펠릿을 500μL의 70% 에탄올에 재현탁시킨다. 소용돌이로 잘 섞는다.
- 세포를 투과시키기 위해 가변 속도 로커에서 RT에서 ≥1 틸트 / 분으로 20 시간 동안 그대로 두십시오.
참고: SC 배지에서 성장한 세포는 미세 원심 분리 벽에 달라붙는 경향이 있으므로 펠릿이 잘 되지 않습니다. 에탄올을 첨가하면 펠릿이 개선되고 세포 손실이 감소합니다. 세포는 4°C에서 밤새 또는 -20°C에서 더 긴 기간 동안 저장될 수 있다. - 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포를 PBS 중 500 μL의 10% 에탄올로 2x 세척한다.
알림: 세척은 세포에서 통합되지 않은 EdU를 제거하는 데 중요합니다.
4. 클릭 잇 반응
- 세포분석용
- 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 0.1 mg/mL RNase A 및 0.2 mg/mL 프로테이나제 K를 함유하는 200 μL의 PBS에 펠릿을 재현탁시킨다.
- 가끔 흔들면서 50 ° C에서 1-2 시간 동안 배양합니다 (또는 37 ° C에서 밤새).
- 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포를 500 μL의 PBS로 세척한다.
- 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포 펠릿을 200μL의 PBS + 1% 소 혈청 알부민(BSA)에 재현탁합니다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
참고: 더 긴 시간은 필요하지 않으며 클릭 반응의 효율성에도 해롭습니다. - 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 펠릿을 300μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시킨다.
- 클릭 반응을 위해 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 200μL, Sytox Green 염색을 위해 다른 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 100μL의 두 튜브 사이에 세포를 분배합니다.
- 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 사이톡스 그린 염색용
참고: 고품질 DNA 함량 참조 프로필을 얻기 위해 Sytox Green 염색(클릭 제외)에 대한 부분 표본을 복용하는 것이 좋습니다. 실제로, 클릭 반응은 사이톡스 그린 및 PI 형광을 포함한 인터칼란트 형광을 강력하게 소멸시킵니다. 결과적으로 클릭 반응은 DNA 함량의 판독을 왜곡 할 수 있습니다.- 세포 펠릿을 100μL의 PBS에 재현탁시킨다.
- 10-30 μL (세포 농도에 따라 다름)를 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 0.5 μM Sytox Green의 300 μL를 포함하는 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다.
- 2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.
- 유세포 분석기에서 샘플을 처리 할 때까지 어둠 속에 두십시오.
참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
- 클릭 반응의 경우
- 시약을 다음 순서(튜브 1개당 수량)로 혼합하여 새로운 아지드 염료 완충액을 준비합니다: 36μL의 PBS, 2μL의 0.2MCuSO4, 0.2μL의 2mM Cy5 아지드, 2μL의 1M 아스코르브산.
참고: Azide Dye 버퍼의 마스터 믹스를 제조할 수 있습니다. 시약은 위에서 언급한 것과 동일한 순서로 혼합되어야 합니다. - 새로 만든 Azide 염료 혼합물 40μL로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 60 분 동안 배양하십시오.
- 마이크로 원심 분리기에서 10,000×g에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포를 PBS 중 300 μL의 10% 에탄올로 3x 세척한다.
알림: 세척은 모든 용해성 EdU-Cy5 아지드를 제거하는 데 중요합니다. - 세포를 PBS에서 50μg/mL PI의 100μL에 재현탁시킨다. 어둠 속에서 10 분 동안 그대로 두십시오.
- 10-30 μL의 세포 현탁액 (세포 농도에 따라 다름)을 50 mM Tris-HCl, pH 7.5의 300 μL를 함유하는 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다.
- 2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.
- 세포 분석기에서 샘플을 처리 할 때까지 어둠 속에 두십시오.
참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
- 시약을 다음 순서(튜브 1개당 수량)로 혼합하여 새로운 아지드 염료 완충액을 준비합니다: 36μL의 PBS, 2μL의 0.2MCuSO4, 0.2μL의 2mM Cy5 아지드, 2μL의 1M 아스코르브산.
- 488nm의 여기 청색 레이저와 530/30BP 필터를 사용하여 Sytox Green 샘플을 판독합니다. 일반적인 결과는 그림 1A 를 참조하십시오. 488nm의 여기 청색 레이저와 PI(x축)의 경우 615/20BP 필터, 640nm의 여기 적색 레이저 및 660/20BP 필터(y축)를 사용하여 점도표에서 이변량 PI-EdU 샘플을 읽습니다. 일반적인 결과는 그림 1B 를 참조하십시오.
참고: 그림 1C 는 EdU 음성 셀에 대한 일반적인 PI-EdU 이변량 FACS 결과를 나타냅니다. EdU 음성 세포와 EdU 양성 세포를 구별 할 수 있습니다.
- 현미경 분석용
- 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 펠릿을 200 μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시킨다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 36 μL의 PBS, 2 μL의 0.2 M CuSO4, 0.2 mM Dy-530 아지드의 0.2 μL, 1 M 아스코르브산의 2 μL의 순서로 시약을 혼합하여 새로운 Azide Dye 완충액을 준비합니다(한 튜브의 수량).
참고: Azide Dye 완충액의 마스터 혼합물은 앞서 언급한 순서대로 시약을 혼합하여 신선하게 준비할 수 있습니다. - 새로 만든 Azide 염료 버퍼 40μL로 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 60 분 동안 배양하십시오.
- 세포를 미세분리 기에서 10,000×g에서 2분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포를 PBS 중 300 μL의 10% 에탄올로 2x 세척한다.
알림: 세척은 모든 가용성 Dy-530 azide를 제거하는 데 중요합니다. - 마이크로 원심분리기에서 10,000 × g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포를 PBS에 0.5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)의 100μL에 재현탁시킨다. 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 그대로 두십시오.
- 마이크로 원심 분리기에서 10,000 ×g에서 2 분 동안 세포를 펠릿합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 300μL의 PBS로 세척하여 과도한 DAPI를 제거합니다.
- 세포를 미세원심분리 기에서 10,000×g에서 2분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
- 세포 농도에 따라 10-50 μL의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다.
- 2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.
참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다. - 1.7 μL의 세포를 유리 현미경 슬라이드 상에 피펫팅하고 깨끗한 커버슬립으로 덮는다.
- DAPI 및 TexasRed 또는 Cy3 필터를 사용하여 형광 현미경으로 즉시 관찰하십시오.
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Representative Results
S기 지속기간 및, 보다 광범위하게는G1 및G2+M의 지속기간을 결정하기 위해(프로토콜 단계 1.1), S. 세레비지애 W303 야생형 세포(WT, 표 1)를 SC 배지에서 7시간 동안 비동기적으로 성장시켰다. 매 시간마다, 세포 농도를 모니터링하여 배가 시간을 결정하였다(도 2B). 이들 성장 조건에서, 계산된 배가 시간은 25°C에서 120분 ± 13분이었다(표 2). 세포가 지수기(2 × 10 6-5 × 106 cells/mL)에 있을 때, 세포의 분취량을 5분 동안 EdU(10μM)로 펄스 라벨링하여 S 페이즈의 셀을 선별하고G1, S 및G2+M 페이즈에 있는 셀의 백분율을 결정하였다. 3개의 세포 집단이 이변량 EdU-PI 세포분석기 분석에서 관찰되었다(도 1B). EdU 음성 집단과 EdU 양성 집단의 구별은 세포가 EdU로 펄스 표지되지 않았지만 클릭 반응이 수행된 대조 실험을 사용하여 이루어졌습니다(그림 1C). PI 강도가 2배 다른 왼쪽 하단 및 오른쪽 하단 영역의 두 EdU 음성 모집단은 각각 G1 및 G2 + M에 해당합니다(그림 1B,C). 따라서 상위 집단 (강도 >1× 104-2 × 104)은 펄스 당시 S 단계에 있던 EdU 양성 세포에 해당합니다 (그림 1B). 따라서, 세포 집단의 5 %± 27 %는 G1 단계에, 29 %± 3 %는 S 기에 있었고, 44 %± 2 %는 G2 + M에있었습니다. 이러한 조건에서 배가 시간이 120분 ± 13분이었기 때문에,G1, S 및G2+M 페이즈가 25°C에서 각각 32분 ± 4분, 35분 ± 6분, 및 53분 ± 7분 지속되었다고 외삽하였다(표 2 및 표 3).
다음으로, 우리는 이 방법을 검증하고 지금까지 간과되었던 DNA 복제 결함이 있는 돌연변이를 식별할 만큼 충분히 민감하다는 것을 보여주는 것을 목표로 했습니다. 우리는 DNA 복제와 관련된 인자의 조정 가능한 기능 상실 대립 유전자가 이상적인 검증 제어가 될 것이라고 추론했습니다. 따라서 온도에 민감한 cdc6-1 돌연변이를 포함하는 효모 균주를 사용했습니다(표 1)11. Cdc6는 나중에 복제 기점으로 사용될 수 있는 ORC 결합 염색체 부위에서 복제 전 복합체(preRC)를 조립하기 위해 후기 M 및 G1에서 발현되는 필수 라이센스 인자입니다. 따라서 허용 온도에서 S상 지속 시간은 WT의 지속 시간과 동일해야 하는 반면, 제한 온도에서는 기원이 허가되지 않으므로 DNA 복제가 발생하지 않아야 합니다12. 그러나 반 허용 온도에서는 더 적은 수의 기원이 허가되었지만 세포 생존력을 부여하기에 충분합니다 (우리의 미공개 데이터; Barba Tena et al., 준비 중), 우리는 각 단계에 대해 다른 기간을 예상했다. 예상대로, 낙하 시험에 기초하여, cdc6-1 세포는 허용 온도 (즉, 25 °C, 그림 2A)에서 WT 세포와 동일하게 성장하여 동일한 배가 시간 (그림 2B 및 표 2)을 나타내지 만 34 ° C 이상에서 죽었다 (그림 2A). 흥미롭게도, 반허용 온도(즉, 28°C)에서, cdc6-1은 실행 가능하였다(28°C, 도 2A). 그러나, 배가 시간은 WT보다 길었고 (그림 2B 및 표 2), 각 단계의 지속 시간은 달랐다. 실제로 cdc6-1에서G1은 약간 더 짧았고(12분 ± 1분 대 16분 ± 2분), S 페이즈는 약간 연장되었으며(34분 ± 4분 vs. 29분 ± 5분), G2 + M 페이즈는 WT에 비해 유의하게 더 길었고(77분 ± 4분 vs. 45분 ± 3분), D 및 표 3). 놀랍게도 S 위상은 크게 확장되지 않았지만 EdU 신호의 평균 강도는 25% 감소했으며(그림 2C,D), 이는 더 적은 수의 원점에서 시작된 S 위상과 일치합니다. 또한, EdU 양성 WT 세포는 초기 (S1)와 후기 S (S2) 단계 사이에 균질하게 분포되어 있었지만 (그림 2C, 보충 그림 S1A, 초기 [S1] 및 후기 S [S2] 단계는 상부 게이트에서 수직 점선으로 구분 됨), EdU 양성 cdc6-1 세포의 65 %는 후기 S 기에 축적되었습니다 (그림 2D, 보충 그림 S1B). S와G2+M 집단 사이에는 명확한 구별조차 없었으며(도 2D), 이는 세포가G2기에 진입하기 전에 S기를 완료하기 위해 고군분투했음을 시사한다. 따라서, 이 방법은 S 단계 (기간 및/또는 분포) 및 세포 주기 단계 지속 시간에 결함이 있는 돌연변이체를 확인하는데 적합하고 민감하다.
세포가 DNA 복제를 시작하고 완료하는 시기를 결정하고 동기화된 세포를 사용하여 S상 기간을 추정하기 위해 보완적인 방법이 고안되었습니다(프로토콜 단계 1.2). 이를 위해,G1에서 동기화된 세포와 α-인자를 사용하여, 세포를 SC 배지에서 방출하고 5분마다 수집하였다. S 페이즈의 지속 시간은 Sytox Green 유세포분석기 프로파일 상에서 DNA 함량이 1C에서 2C로 변화한 시간에 기초하여 약 25분일 수 있다(도 3A). 그러나, 이러한 추정은 집단의 유의한 세포 분획이 FACS 프로파일에서 볼 수 있을 만큼 충분한 Sytox Green을 혼입한시기에 의존한다. 초기 및 후기 복제 이벤트는 이 방법으로 검색할 수 없습니다. S상이 언제 시작되고 끝나는지, 얼마나 오래 지속되는지를 정확하게 정의하기 위해, S상 세포를G1 방출 후 5분마다 5분 동안 EdU(10μM)로 펄스 라벨링할 때 세포의 분취량으로부터 선별하였다. 예상대로, 방출 후 처음 10분 이내에 모든 세포는 좌측 하단 영역에 있었다(즉,G1에서, 도 3B, 보충 도 S2에서). 방출 15분 후, EdU 양성 세포의 일부가 이미 검출되었으며(보충 그림 S2 및 보충 그림 S3의 처음 두 행, 각각 EdU 처리 및 EdU 없는 세포 비교), 이는 S 단계가 시작되었음을 나타냅니다(그림 3C). S 단계를 통한 진행은 이변량 PI-EdU 그래프에서 세포 구름이 먼저 위쪽으로 이동한 다음 오른쪽으로 이동하는 것으로 나타났습니다(그림 3D-F). 마지막으로, 방출 35 분 후, 세포의 분획은 EdU 음성이었지만 DNA의 양은 두 배였으며, 이는 해당 세포가 S 단계를 완료하고 G2 + M 단계에 있음을 나타냅니다 (그림 3G). 따라서 S 단계는 이러한 조건에서 20 분 동안 지속됩니다. 참고로, Sytox Green으로 검출된 DNA 함량의 오버레이와 함께 관찰된 높은 동시성에도 불구하고, 방출 후 40분 후에 전체 집단에서 S 단계가 끝났음을 시사하는 이변량 분석은 일부 세포가 방출 후 60분 후에 S 단계를 완료하고 방출 후 65분 후에 전체 집단에 대해 S 단계가 완료되었음을 보여주었습니다(그림 3H, I 및 보충 그림 S2).
또한 S 상 및 DNA 합성은 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다. 각각의 활성화 된 복제 기원으로부터, DNA 합성은 2 개의 테더 된 replisomes에 의해 수행되고, 복제 인자 및 / 또는 연산자 어레이의 태그 된 버전 및 형광 단백질 2,13에 융합 된 상응하는 리프레서를 이미징함으로써 현미경 검사가 뒤 따를 수있는 핵 복제 초점을 형성한다. 대안적으로, DNA 합성은 티미딘 유사체14,15를 사용하는 현미경에 의해 검출될 수 있다. 우리는 EdU를 사용하여 DNA 합성을 거치는 핵하 DNA 영역을 모니터링했습니다. 이를 위해, 비동기 WT 및 cdc6-1 세포를 28°C에서 3분 동안 EdU(10μM)로 펄스 표지하고, 클릭 반응 후에 이들을 이미지화하였다. 우리는 DNA 합성 속도와 3 분 EdU 펄스 동안 세포주기의 세포 진행에 따라 EdU 신호 강도의 변화를 감지 할 것으로 예상했습니다 (즉, S 단계에서 전체 3 분을 소비하는 세포는 펄스 동안 S 단계에 들어가거나 나가는 세포보다 더 강한 신호를 표시합니다). 따라서, WT S상 세포는 강도가 변하는 그들의 핵에 EdU 신호를 나타내었다(도 4A). S상 기간은 이 분석에서 쉽게 외삽할 수 있습니다. 실제로, 2 개의 생물학적 복제 (적어도 150 개의 세포가 계수 됨)로부터 WT 및 cdc6-1 세포의 3 % ± 3 % 및 38 %± 각각 EdU 양성이라는 것이 결정되었다. 이러한 성장 조건에서와 같이, WT 및 cdc6-1 세포에 대해 배가 시간은 각각 90분 및 123분이었고(표 2), S상이 각각 31분 및 47분 지속됨을 외삽하였다. 전자의 결과는 FACS 분석(표 3)에서 얻은 결과와 일치하며, 이는 현미경으로 EdU 양성 세포를 검출하면 S상 지속 시간을 결정할 수 있음을 나타냅니다. 참고로, 후자는 S와 G2 + M 집단 사이에 명확한 구분이 없었기 때문에 FACS 분석에서 외삽 된 S 상 기간보다 높습니다 (그림 2D). EdU 초점은 WT 세포에서 쉽게 관찰되었지만 (그림 4B) cdc6-1 세포에서는 더 어둡고 적었습니다 (그림 4C). WT와 cdc6-1 세포 사이의 EdU 신호 강도 차이가 S 단계의 단계에 의존할 가능성을 배제하기 위해, 강도는 동기화된 세포로부터 정량화되었다. 예상대로 평균 EdU 신호 강도는 cdc6-1 세포에서 3배 더 낮았으며(그림 4D), 이는 더 적은 복제 기점에서 시작된 DNA 복제와 일치합니다. EdU 신호는 핵으로 제한되어 강력한 DAPI 신호와 함께 국소화되었으며 핵 지역 또는 복제 공장의 DNA 복제 조직과 일치하는 구형 패턴으로 구성되었습니다. 중요하게도, EdU는 싹이 트지 않았거나 작은 싹이 난 세포에서만 검출되었고 큰 새싹이있는 세포에는 결코 존재하지 않았으며, 이는 WT 효모 세포가 유사 분열에 들어갈 때까지 복제를 마쳤음을 나타냅니다. 따라서 이 방법은 높은 공간 분해능에서 DNA 복제를 시각화하고 경미한 DNA 복제 결함을 검출하고 정량화하는 데 민감합니다.
그림 1: 대표적인 FACS 분석. (A) 25°C에서 성장한 WT 세포에 대한 대표적인 사이톡스 그린 FACS 분석. (B,C) 25°C에서 성장하고 EdU(10μM) 또는 1μL의 DMSO로 5분 동안 펄스 표지된 WT 세포에 대한 대표적인 EdU-PI 이변량 FACS 분석. 다각형은 두 분석에서 동일했습니다. C는 EdU 양성 세포로부터 EdU 음성을 기술하기 위해 사용되었다 (일반적으로, 한계는 강도 >1× 10 4-2 × 104로 설정된다). 상단 다각형 게이트는 EdU 양성 세포 (S- 상 분획)를 묘사했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 비동기 세포 집단에서G1, S, 및G2+M 세포 주기 단계에서의 세포의 분획. (A) WT 및 cdc6-1 균주는 풍부한 배지에서 연속 5배 희석으로 발견되었고 25°C, 28°C 또는 34°C에서 성장했습니다. (B) 인구 배가 시간. 비동기 WT 및 cdc6-1 세포를 25°C 또는 28°C에서 성장시키고, 세포 농도를 7시간 동안 매시간 측정하였다. (C,D) 28°C에서 성장한 WT 및 cdc6-1 세포의 EdU-PI 이변량 FACS 분석 및 EdU(10μM)로 5분 동안 펄스-표지하였다. 모집단 배가 시간에 S-상 분율을 곱하면 S상 기간이 제공됩니다. EdU 양성 및 EdU 음성 세포의 평균 강도는 해당 다각형에서 각 값의 강도의 평균으로 계산되었습니다. WT 및 cdc6-1 EdU 음성 세포 (각각 5,077 및 4,454)의 평균 강도는 1로 정규화되었습니다. WT 및 cdc6-1 EdU 양성 세포 (각각 52,604 및 36,141)의 평균 강도를 각 균주에 사용 된 정규화 인자로 나눴다. 얻어진 값은 각각 10.4와 8.1이었다 (즉, 본문에서 언급 한 바와 같이 25 % 감소). 약어 : WT = 야생형; EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; FACS = 형광-활성화 세포 분류; PI = 요오드화 프로피듐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 동기화된 세포에서 S상 지속 시간 결정. (A) 28°C에서 α인자 방출 후 WT 세포의 DNA 함량의 시간 경과 분석. 표시된 시간은 EdU 펄스의 지속 시간 (5 분)을 고려합니다. (나-나) EdU(10μM)로 5분 동안 펄스 표지된 동기화된 WT 세포에 대한 EdU-PI 이변량 FACS 분석을 수행하고G1 정지로부터 방출된 후 표시된 시간에 수집했습니다. 약어 : WT = 야생형; EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; FACS = 형광-활성화 세포 분류; PI = 요오드화 프로피듐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 현미경을 통한 EdU 검출 및 정량화. 비동기 WT 및 cdc6-1 균주를 28°C에서 2시간 동안 성장시킨 다음, EdU(10μM)로 3분 동안 펄스 표지하고 적절한 여기/방출 필터를 사용하여 광시야 현미경으로 이미징했습니다. (A) 표시된 대로 DIC로 시각화하고 DAPI 또는 EdU로 염색한 WT 및 cdc6-1에 대한 WT 및 (B,C) 개별 세포에 대한 광시야 현미경의 대표 이미지. (A)와 (B,C)의 스케일 바는 각각 10μm와 2μm입니다. (D)G1 정지로부터 방출된 후 30분 후에 28°C에서 성장한 동기식 WT 및 cdc6-1 세포에 대한 EdU 강도 측정. 그래프는 3개의 생물학적 복제물의 풀링을 나타냅니다(각 생물학적 복제물에서 최소 50개의 세포가 계수됨). 평균 ± SD가 그래프에 표시됩니다. WT와 cdc6-1 세포 사이의 쌍을 이루지 않은 양측 t- 검정은 **** (p < 0.0001)로 표시됩니다. 약어 : WT = 야생형; EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; DIC = 차동 간섭 대비; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌; AU = 임의의 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 유전자 형 | 그림과 표 | ||
| WT (E3087): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | 그림 1, 그림 2A, B, C, 그림 3, 그림 4A, B, D, SUPP 그림 1,2,3 표2,3 | ||
| CDC6-1 (E5956): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | 그림 2A, B, D, 그림 4 C, D, 공급 그림 1, 표 2,3 | ||
| TK+ (E1000): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) | 공급 그림 4 | ||
| TK+ hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | 공급 그림 4 | ||
| hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 | 공급 그림 4 | ||
| CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | 공급 그림 4 | ||
| W303-1A (E001): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 | 공급 그림 4 | ||
표 1: 이 연구에 사용된 균주 목록.
| 증권 시세 표시기 | CDC6-1 | |||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |
| 배가 시간(분) | 120 | 90 | 118 | 123 |
| 사우다코타 | ± 13 분 | ± 3분 | ± 10 분 | ± 6분 |
표 2: 25°C 및 28°C에서 성장한 WT 및 cdc6-1 균주의 평균 배가 시간. 배가 시간은 다음 공식을 사용하여 3 개의 생물학적 복제 (각 생물학적 복제에 대해 4 개의 기술 복제)로부터 계산되었습니다 : Δt × ln (2) / ln (Cf / Ci), 여기서 Cf 및 Ci는 각각 최종 및 초기 세포 농도에 해당하고, Δt는 Cf와 Ci가 측정되었을 때 tf와 ti 사이의 분 차이에 해당합니다. 각각.
| 증권 시세 표시기 | CDC6-1 | |||||||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |||||
| 퍼센트 | 기간 (분) |
퍼센트 | 기간 (분) |
퍼센트 | 기간 (분) |
퍼센트 | 기간 (분) |
|
| 깨1 | 27 | 32 | 18 | 16 | 13 | 16 | 10 | 12 |
| S | 29 | 35 | 32 | 29 | 28 | 34 | 28 | 34 |
| G2+M | 44 | 53 | 50 | 45 | 59 | 71 | 62 | 77 |
| SD G1 | ±5 | ±4 | ±3 | ±2 | ±2 | ±1 | ±1 | ±1 |
| 사우 스다코타 에스 | ±3 | ±6 | ±5 | ±5 | ±5 | ±7 | ±4 | ±4 |
| SD G2+M | ±2 | ±7 | ±4 | ±3 | ±4 | ±4 | ±6 | ±4 |
표 3: 25°C 및 28°C에서 성장한 WT 및 cdc6-1 세포에서G1, S, 및G2+M 페이즈의 평균 분획 및 지속기간. 세포의 분획은 3개의 생물학적 복제물(각각의 생물학적 복제물에 대해 2개의 기술적 복제물)로부터 결정되었다. 28°C에서 성장한 WT 및 cdc6-1 세포 사이의G1, S 및G2+M 기간의 차이는 통계적으로 유의하였다 (비쌍 양측 t-검정, p < 0.1).
보충 그림 S1: 28°C에서 성장한 WT 및 cdc6-1 세포에서 초기 및 후기 S 단계의 세포 분획. (A) 28°C에서 성장한 WT 세포 및 (B) 28°C에서 성장한 cdc6-1 세포에 대한 EdU-PI 이변량 FACS 분석에서 EdU 양성 세포의 분획에 각각 S1 및 S2라는 두 개의 동일한 다각형을 그려 두 개의 반으로 분할했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: EdU-PI 이변량 FACS로 시각화된 G1 정지로부터 방출된 후 EdU 펄스 표지된 세포의 세포 주기 진행. 세포의 분취량을 28°C에서 α인자 정지로부터 방출된 후 5분마다 10μM EdU로 5분 동안 그리고 지시된 바와 같이 80분까지 펄스 표지하였다. 약어: EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; FACS = 형광-활성화 세포 분류; PI = 요오드화 프로피듐. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: EdU-PI 이변량 FACS로 시각화된G1 정지로부터 방출된 후 DMSO 처리된 세포의 세포 주기 진행. 이것은 보충 그림 2와 동일하지만 세포를 1 μL DMSO (디메틸 설폭 사이드)로 5 분 동안 배양 하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S4 : TK hENT1 효모 세포에서의 BrdU 및 EdU 독성. 지시된 유전자형의 세포를 증가된 농도의 BrdU 또는 EdU를 함유하는 YPD 플레이트 상에서 5배 연속 희석액으로 발견하고, 30°C에서 40시간 동안 성장시켰다. 약어: DMSO = 디메틸 설폭사이드; BrdU = 브로모데옥시우리딘; 에듀=5-에티닐-2'-데옥시우리딘; TK = 티미딘 키나아제; hENT1 = 인간 평형 뉴 클레오 시드 수송 체. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
효모는 세포주기 연구의 주요 모델 유기체이지만 DNA 복제의 추적자로 사용되는 BrdU와 같은 외인성 뉴 클레오 사이드를 통합 할 수 없기 때문에 S 단계의 특성화는 오랫동안 방해 받아 왔습니다. 효모에 단순 포진 티미 딘 키나아제 (TK)의 높은 발현을 장착하고 인간 뉴 클레오 시드 수송 체 (hENT)를 첨가하면이 문제가 크게 해결되었습니다15,16. EdU는 항 BrdU 항체17과 달리 작은 형광 아지드 및 클릭 화학을 사용한 검출이 투과화된 효모 세포 및 FACS 분석에 적합하기 때문에 BrdU보다 더 다재다능합니다. 여기에서 우리는 이 TK-hENT1 균주에서 EdU 라벨링 및 검출 조건을 최적화하고 이전에 검출되지 않은 복제 결함을 FACS 또는 현미경으로 이 프로토콜을 사용하여 정량화할 수 있음을 보여주었습니다.
동일한 메커니즘을 방해 할 수있는 도구를 사용하여 생물학적 메커니즘을 연구하는 것은 생물학에서 일반적인 문제입니다. EdU는 알려진 세포 독성 효과가 있기 때문에 조작 된 TK-hENT1 균주에 대한 만성 노출에서 독성이없는 EdU 농도를 검색하여 10μM이 적절한 용량임을 발견했습니다. TK-hENT1 세포는 25μM EdU에서 증식하지 못하는 반면, TK 단독 또는 hENT1 단독 세포는 100μM EdU를 쉽게 견뎌냅니다(보충 그림 S4). 효모 세포는 BrdU보다 EdU에 훨씬 더 민감하지만, EdU 노출 후 두 번째 세포주기 후에 만 증식이 감소한다는 것을 발견했으며, 이는 세포 증식에 영향을 미치기 위해 두 가닥에 통합되어야 함을 시사합니다 (데이터는 표시되지 않음). 안전을 유지하기 위해 이 프로토콜 전체에서 10μM EdU를 사용했으며 짧은 펄스(현미경의 경우 3분, FACS의 경우 5분)만 사용했으며 이 최적화된 프로토콜을 사용하여 우수한 검출에 적합하다는 것을 발견했습니다.
DNA 복제의 미묘한 결함은 염색체 재배열에 강한 영향을 미칠 수 있습니다4. 따라서 이러한 미묘한 결함을 검출 할 수있는 기술과 프로토콜의 개발은 염색체 이상의 원인을 밝히는 데 중요합니다. 여기에서 우리는 이 최적화된 EdU 통합 및 검출 프로토콜이 신호 강도의 최대 3배 감소를 측정할 수 있음을 보여주며(그림 2 및 그림 4), 이는 28°C에서 성장한 온도에 민감한 cdc6-1 세포에서 DNA 합성 속도가 감소함을 나타내며, 이는 아직 플레이트 생존율 분석에서 결함이 없음을 보여줍니다(그림 2A ). 따라서 이 EdU 통합 및 정량화 프로토콜은 복제 결함이 초기에 의심되지 않는 다른 돌연변이를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 추가로, 유사분열 DNA 합성 (MiDAS), 감수 분열 재조합 의존성 DNA 합성, 또는 다른 장기관 DNA 합성을 검출하는 것이 유용할 수 있다.
한 가지 단점은 EdU 검출이 고정된 세포에서만 수행될 수 있어 이미징에 사용되는 레이저 빔의 높은 광독성으로 고통받는 PCNA-GFP 또는 DNA 복제의 기타 형광 판독과 같은 실시간 분석을 배제한다는 것입니다. 합성 배지에서 세포를 성장시키는 것은 YPD 잔류물이 클릭 반응을 상당히 억제하는 것으로 보이기 때문에 최상의 검출에 중요합니다. 흥미롭게도 동기화된 집단에 대한 이변량 EdU-PI FACS 분석을 사용하여 S상 세포를 선별하면 단일 세포에서 S기의 지속 시간을 20분으로 추정할 수 있습니다(그림 3, 보충 그림 S2 및 보충 그림 S3). 그러나 α인자 방출 후 동기화가 기존의 Sytox Green FACS 분석(그림 3A)에서와 같이 거의 완벽에 가깝게 나타나는 경우에도 이변량 EdU-PI FACS 분석에서 세포가 상대적으로 비동기적으로 S 단계에 진입한다는 것이 분명해집니다(그림 3B-I).
여기에서는 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 동기 및 비동기 세포에 대한 유세포 분석 및 현미경을 사용하여 S상 지속 시간을 결정하는 세 가지 방법을 설명합니다. 집단 수준에서 비동기 WT 세포에서 결정된 평균 S- 상 지속 시간은 각각 29 분 및 31 분에서 유세포 분석과 현미경을 사용하여 유사하지만, 동기화 된 단일 세포 기반 접근법은 지속 시간이 20 분만큼 짧을 수 있음을 보여줍니다 (그림 2, 그림 3, 그림 4 및 표 3 ). 이러한 값 간의 불일치는 놀랍지 만 쉽게 설명 할 수 있습니다. 실제로, 우리의 단일 세포 기반 접근 방식을 사용하면 S- 단계 기간은 가장 초기 이벤트 (즉, S 단계에 들어오고 나가는 첫 번째 세포, 그림 3C, G)를 기반으로 결정되었지만 S 단계가 집단 내의 모든 세포에서 20 분 동안 지속된다는 것을 의미하지는 않습니다. 이러한 데이터는 세포 사이의 S- 단계 기간에 일정 수준의 이질성이 있다는 예기치 않은 개념을 뒷받침합니다.
개선 된 프로토콜 또는 새로운 기술은 오랜 교리 나 새로운 아이디어를 전복시킬 수 있습니다. 이러한 데이터가 도전하는 세 가지가 있습니다. 첫째, DNA 합성은 S. cerevisiae에서 새싹 출현과 함께 이루어진다고 믿어집니다. 도 4A-C는 EdU 염색이 3분의 표지 지연에도 불구하고, 출아되지 않은 세포와 작은 싹이 트기 세포에서 가장 강하다는 것을 보여주며, 이는 앞서도 16에 도시된 바와 같이, S 단계가 출아 전에 명확하게 시작됨을 나타낸다. 둘째, 효모 세포는 DNA 합성과 동시에 유사분열 방추를 형성하는G2 상을 가지고 있지 않은 것으로 보고됩니다. FACS(그림 3, 보충 그림 S2 및 보충 그림 S3) 또는 현미경(그림 4)에 의한 민감한 EdU 검출과 결합된 매우 짧은 펄스를 통해 단일 셀에서 S 단계가 언제 시작되고 끝나는지 정확하게 결정할 수 있습니다. 그렇게 함으로써 우리는 벌크 DNA 합성이 α인자 방출 후 40분 후에 완료되는 반면(그림 3, 보충 그림 S2 및 보충 그림 S3), 짧은 유사분열 방추는 20분 후에만 형성된다는 것을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 우리는 효모 세포가 G2 단계를 가지고 있다고 결론지었습니다. 셋째, 효모 세포의 최대 30 %가 아나 페이즈-텔로 페이즈18에서 DNA 합성을 완료하는 것이 최근에 제안되었습니다. 이 최적화 된 프로토콜을 사용하여 아나 페이즈 / 텔로 페이즈 스핀들 (데이터는 표시되지 않음)을 표시하는 세포에서 EdU 통합을 감지하지 못했지만이 두 번째 DNA 합성 물결이 사용 된 검출 임계 값 미만임을 배제 할 수 없습니다. 강한 신호/잡음비를 감안할 때 후자의 옵션은 가능성이 낮다고 생각합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 재정 지원을 위해 JDDBT와 Agence Nationale pour la Recherche (ANR) 및 Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC)를 J.d.DBT에 대한 박사 학위 펠로우십과 ANR(Agence Nationale pour la Recherche)로 인정하고자 합니다(보조금 ANR-18-CE12-0018-01). 세포 분석 및 현미경 검사는 Montpellier MRI BioCampus 이미징 시설에서 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100--812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
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