Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

We beschrijven twee complementaire protocollen om de S-faseduur in S. cerevisiae nauwkeurig te bepalen met behulp van EdU, een thymidine-analoog, dat in vivo is opgenomen en gedetecteerd met behulp van Click-chemie door microscopie en flowcytometrie. Het zorgt voor de eenvoudige karakterisering van de duur van DNA-replicatie en over het hoofd geziene replicatiedefecten in mutanten.

Abstract

Eukaryote DNA-replicatie is een sterk gereguleerd proces dat ervoor zorgt dat de genetische blauwdruk van een cel correct wordt gedupliceerd voorafgaand aan chromosoomsegregatie. Aangezien DNA-synthesedefecten ten grondslag liggen aan chromosoomherschikkingen, is het monitoren van DNA-replicatie essentieel geworden om de basis van genoominstabiliteit te begrijpen. Saccharomyces cerevisiae is een klassiek model om celcyclusregulatie te bestuderen, maar belangrijke DNA-replicatieparameters, zoals de fractie van cellen in de S-fase of de S-faseduur, zijn nog steeds moeilijk te bepalen. Dit protocol maakt gebruik van korte en niet-toxische pulsen van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), een thymidine-analoog, in gemanipuleerde TK-hENT1-gistcellen, gevolgd door de detectie door Click-reactie om de visualisatie en kwantificering van DNA-replicatie met hoge ruimtelijke en temporele resolutie op zowel het eencellige als het populatieniveau door microscopie en flowcytometrie mogelijk te maken. Deze methode kan eerder over het hoofd geziene defecten in de S-fase en celcyclusprogressie van gistmutanten identificeren, waardoor de karakterisering van nieuwe spelers mogelijk wordt die essentieel zijn voor het waarborgen van genoomstabiliteit.

Introduction

Genoomstabiliteit door mitotische deling wordt verzekerd door de overdracht van een volledige en gelijke set chromosomen naar de twee geproduceerde celoudergenen. Dit is afhankelijk van de nauwkeurige voltooiing van een reeks gebeurtenissen die zich in een bepaalde tijd in elke fase van de celcyclus voordoen. In G1 wordt de replicatieoorsprong in licentie gegeven bij de werving van verschillende licentiefactoren, waaronder Cdc61. In de S-fase wordt duplicatie van het hele genoom geïnitieerd vanuit meerdere actieve replicatieoorzaken en uitgevoerd door replicatiemachines die zich verzamelen in microscopisch zichtbare foci genaamd replicatiefabrieken2. In de M-fase worden gedupliceerde zusterchromatiden bevestigd en gebioriënteerd op de mitotische spil om hun segregatie naar de tegenovergestelde polen van de mitotische celmogelijk te maken 3. De regulatie, de juiste voltooiing en de duur van elke fase zijn de sleutel tot genoomstabiliteit. Inderdaad, voortijdige exit uit een van deze fasen leidt tot genoominstabiliteit. Bijvoorbeeld, een kortere G1 geïnduceerd door deletie van de ontluikende gist CDK-remmer Sic1 of door de overexpressie van G1 cyclinen zal de daaropvolgende S-fase 4,5,6 veranderen. Bijgevolg resulteren deze deregulaties, al dan niet geassocieerd met replicatiestress, in chromosoombreuken, herschikkingen en missegregatie 4,5,6. Daarom kan het monitoren van de duur van de S-fase en, meer in het algemeen, de duur van de andere fasen van de celcyclus cruciaal zijn om de defecten te identificeren die optreden in verschillende mutanten en in verschillende stressvolle omstandigheden.

Een traditionele methode voor het meten van de duur van de celcyclusfase omvat eenvoudige DNA-inhoudsstroomcytometrie (figuur 1A) en vertrouwt op een passend algoritme (beschikbaar in de meeste cytometriesoftware) dat wordt gebruikt om de populatie te scheiden in G1-, S- en G2 + M-fasefracties van de 1C- en 2C-pieken. De fracties worden vervolgens vermenigvuldigd met de populatie verdubbelingstijd7. Deze methode geeft echter alleen geschatte waarden, vereist een homogene celgrootteverdeling binnen een bepaalde fractie en is niet van toepassing op gesynchroniseerde culturen. Om de S-faseduur in zoogdiercellen te bestuderen, zijn verschillende thymidine-analogen ontwikkeld en op grote schaal gebruikt, waaronder EdU. Hun opname uit het extracellulaire medium en fosforylering door thymidinekinase (hierna TK genoemd) maken ze beschikbaar voor DNA-polymerasen om ze op te nemen op plaatsen van DNA-synthese (replicatie, recombinatie, reparatie). Om de afwezigheid van het TK-gen in Saccharomyces cerevisiae-cellen te omzeilen, zijn giststammen ontworpen om stabiele en constitutieve expressie van het herpes simplex-virus TK8 en de humane equilibratieve nucleosidetransporter (hENT1) 9 mogelijk te maken. Eenmaal opgenomen in DNA, wordt EdU gedetecteerd via de selectieve Click-reactie, die zijn alkyngroep chemisch koppelt aan azide-gemodificeerde fluorochelen10.

Dit artikel biedt twee geoptimaliseerde uitgebreide protocollen om asynchrone en synchrone TK-hENT1-engineered cellen met EdU te pulseren om de duur en dynamiek van DNA-replicatie nauwkeurig te visualiseren en te meten, evenals de duur van de andere fasen van de celcyclus, met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie op zowel het eencellige als het populatieniveau door microscopie en flowcytometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S. cerevisiae celkweek

OPMERKING: De gebruikte giststammen zijn vermeld in tabel 1

OPMERKING: De duur van de S-fase kan op verschillende manieren worden bewaakt. Afhankelijk van de te beantwoorden vraag kunnen de cellen asynchroon of synchroon worden gekweekt na G1-arrestatie .

  1. Van asynchroon groeiende S. cerevisiae cellen
    OPMERKING: Deze methode maakt het mogelijk om het percentage cellen in de S-fase in een asynchroon groeiende celpopulatie te bepalen. Door de verdubbelingstijd te bepalen, kan de duur van de S-fase (en de andere fasen) worden geëxtrapoleerd.
    1. Ent S. cerevisiae cellen in 10 ml synthetisch compleet (SC) medium bij een lage celconcentratie (5 × 104 cellen/ml) voor een nachtkweek bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm.
      OPMERKING: De concentratie wordt gemeten met een celteller. Om de verdubbelingstijden efficiënt te berekenen, wordt aanbevolen om de cultuur te enten uit een nachtcultuur die zich nog in de exponentiële fase bevindt (d.w.z. idealiter minder dan 2 × 107 cellen / ml). Het kweken van cellen in rich medium (YPD) wordt niet aanbevolen, omdat EdU-detectie niet efficiënt is.
    2. Verdun de volgende dag de cellen in 20 ml vers SC-medium in de uiteindelijke concentratie van 5 × 105 cellen / ml.
    3. Kweek de cellen bij 30 °C in een schuddend waterbad met horizontaal schudden bij 120 rpm.
    4. Meet de celconcentratie elk uur totdat deze 1 × 107 cellen / ml bereikt.
      OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk om een grafische weergave te maken van de toename van de celconcentratie in de loop van de tijd. De formule die wordt gebruikt om de verdubbelingstijden te berekenen, wordt uitgelegd in de legenda van tabel 2.
    5. Ga parallel aan stap 2 voor EdU-etikettering wanneer de celconcentratie ongeveer 2 × 106-5 is × 106 cellen / ml.
  2. Van G1-gesynchroniseerde S. cerevisiae cellen
    OPMERKING: Deze methode maakt het mogelijk om te bepalen wanneer de S-fase begint en eindigt door middel van flowcytometrie en/of microscopieanalyses.
    1. Ent S. cerevisiae cellen in 10 ml SC-medium bij een lage celconcentratie (5 × 104 cellen/ml) voor een nachtkweek bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm.
      OPMERKING: Zie de opmerkingen na stap 1.1.1.
    2. Verdun de volgende dag de cellen in 20 ml vers SC-medium in een eindconcentratie van 2 × 106-3 × 106 cellen / ml.
    3. Voeg 40 μL 1 mg/ml α-factor verdund in water toe.
    4. Kweek de cellen bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm gedurende 1 uur.
    5. Voeg opnieuw 40 μL van 1 mg/ml α-factor verdund in water.
    6. Kweek de cellen bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm gedurende 1 uur.
    7. Visualiseer de cellen onder een lichtmicroscoop om de G1-arrestatie te controleren. Ga verder als meer dan 90% van de cellen een shmoo weergeven en de andere afgeronde, niet-gepofte cellen zijn.
      OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte achtergrond, wordt het aanbevolen om de cellen te soniceren voordat shmoo-visualisatie plaatsvindt. Voor de W303-achtergrond, soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
    8. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1.500 × g. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    9. Resuspendeer de cellen in 20 ml SC-medium.
    10. Herhaal stap 1.2.8-1.2.9 eenmaal.
      OPMERKING: De α-factor wordt weggespoeld met deze stappen en de cellen worden vrijgegeven in de celcyclus. Als alternatief kan de α-factor worden weggespoeld door de gistcellen te filteren met een nitrocellulosefilter van 1,2 μm met behulp van een trechter op een zijarmkolf die is aangesloten op een vacuümpomp.
    11. Verzamel 1 ml cellen 2x per 5 minuten en ga verder met stap 2 voor EdU-etikettering.
      OPMERKING: Pulseer de cellen van slechts één van de twee buizen met EdU. De niet-pulsgelabelde cellen worden gebruikt om EdU-positieve van EdU-negatieve cellen te onderscheiden op een bivariate propidiumjodide (PI)-EdU-grafiek.
    12. Voeg 400 μL 1 mg/ml α-factor verdund in water 30 minuten na het vrijkomen toe.
      OPMERKING: Deze hoge dosis α-factor is nodig om de cellen in de G1-fase van de volgende celcyclus te stoppen en om te voorkomen dat de cellen opnieuw de volgende S-fase binnengaan.

2. EdU-etikettering

  1. Breng 1 ml celkweek over naar een microfugebuis van 2,0 ml met 1 μL 10 mM EdU. Meng goed door inversie.
    OPMERKING: Om de EdU-positieve cellen te onderscheiden van de EdU-negatieve cellen op een PI-EdU bivariate FACS, breng je nog eens 1 ml celcultuur over naar een 2,0 ml microfugebuis met 1 μL DMSO.
  2. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij 30 °C onder roeren in een schuddend waterbad.
    OPMERKING: Drie minuten zijn voldoende voor EdU-detectie met een microscoop; 5 minuten zijn nodig voor optimale EdU-detectie op een flowcytometer.
  3. Stop de reactie met de toevoeging van 100 μL 100% ethanol.
    1. Stop de reactie met de toevoeging van 100 μL 20% paraformaldehyde als meting van de celgrootte vereist is.
      OPMERKING: Als de nucleaire architectuur van de mitotische cellen intact moet blijven voor verdere analyses na de Click-reactie, raden we aan cellen te fixeren met 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur (RT) in plaats van de cellen in ijs te zetten, omdat de laatste microtubuli-depolymerisatie veroorzaakt.
    2. Laat de cellen gedurende 20 minuten op RT onder milde agitatie op een rocker met variabele snelheid op 20 tilts/min om de cellen te fixeren voordat de cellen worden toegevoegd voor de toevoeging van 100 μL 100% ethanol.

3. Celfixatie en permeabilisatie

  1. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Verwijder het supernatant met een vacuümpipet.
  2. Resuspendeer de celpellet in 500 μL van 70% ethanol. Meng goed door te vortexen.
  3. Laat ≥1 uur op RT bij 20 tilts/min op een rocker met variabele snelheid om de cellen te permeabiliseren.
    OPMERKING: Cellen gekweekt in SC-medium pelleteren niet goed omdat ze de neiging hebben om aan de microfuge-wanden te kleven. De toevoeging van ethanol verbetert de pelletering en vermindert het celverlies. De cellen kunnen 's nachts bij 4 °C of voor langere perioden bij −20 °C worden bewaard.
  4. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
  5. Was de cellen 2x met 500 μL 10% ethanol in PBS.
    OPMERKING: De wasbeurten zijn cruciaal om niet-geïncorporeerde EdU uit de cellen te verwijderen.

4. Klik-erop reactie

  1. Voor cytometrie analyse
    1. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    2. Resuspendeer de pellet in 200 μL PBS met 0,1 mg/ml RNase A en 0,2 mg/ml proteïnase K.
    3. Incubeer gedurende 1-2 uur bij 50 °C met af en toe schudden (of een nacht bij 37 °C).
    4. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    5. Was de cellen met 500 μL PBS.
    6. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    7. Resuspendeer de celpellet in 200 μL PBS + 1% runderserumalbumine (BSA). Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
      OPMERKING: Langere tijden zijn niet nodig en zijn zelfs schadelijk voor de efficiëntie van klikreacties.
    8. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    9. Resuspendeer de pellet in 300 μL PBS + 1% BSA.
    10. Verdeel de cellen over twee buizen: 200 μL in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor de Klikreactie en 100 μL in een andere microcentrifugebuis van 1,5 ml voor Sytox Green-kleuring.
    11. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    12. Voor Sytox Green kleuring
      OPMERKING: We raden ten zeerste aan om een aliquot te nemen voor Sytox Green-kleuring (zonder klik) om referentieprofielen voor DNA-inhoud van hoge kwaliteit te verkrijgen. Inderdaad, de Click-reactie dooft de intercalante fluorescentie sterk, inclusief de Sytox Green- en PI-fluorescentie. Bijgevolg kan de Click-reactie de lezing van het DNA-gehalte verstoren.
      1. Resuspendeer de celpellet in 100 μL PBS.
      2. Breng 10-30 μL (afhankelijk van de celconcentratie) over naar een flowcytometerbuis met 300 μL van 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 en 0,5 μM Sytox Green.
      3. Soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
      4. Laat in het donker totdat u de monsters op een flowcytometer verwerkt.
        OPMERKING: De cellen kunnen in dit stadium enkele dagen bij 4 °C worden gehouden.
    13. Voor de klikreactie
      1. Bereid verse Azide Dye buffer door de reagentia in de volgende volgorde (hoeveelheid voor één buis) te mengen: 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5 Azide en 2 μL 1 M ascorbinezuur.
        OPMERKING: Het is mogelijk om een hoofdmix van de Azide Dye-buffer te bereiden. De reagentia moeten in dezelfde volgorde worden gemengd als hierboven vermeld.
      2. Resuspendeer de celpellet met 40 μL vers gemaakte Azide Dye mix. Incubeer bij RT in het donker gedurende 60 min.
      3. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
      4. Was de cellen 3x met 300 μL 10% ethanol in PBS.
        OPMERKING: De wasbeurten zijn cruciaal om alle oplosbare EdU-Cy5 azide te elimineren.
      5. Resuspendeer de cellen in 100 μL van 50 μg/ml PI in PBS. Laat 10 minuten in het donker staan.
      6. Breng 10-30 μL van de celsuspensie (afhankelijk van de celconcentratie) over naar een flowcytometerbuis met 300 μL van 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
      7. Soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
      8. Laat in het donker totdat u de monsters op een cytometer verwerkt.
        OPMERKING: De cellen kunnen in dit stadium enkele dagen bij 4 °C worden gehouden.
    14. Lees de Sytox Green-monsters met behulp van een excitatieblauwe laser bij 488 nm en een 530/30 BP-filter. Zie figuur 1A voor typische resultaten. Lees de bivariate PI-EdU-monsters op een dot plot met behulp van een excitatieblauwe laser bij 488 nm en een 615/20 BP-filter voor de PI (x-as) en een excitatie rode laser bij 640 nm en een 660/20 BP-filter (y-as). Zie figuur 1B voor typische resultaten.
      OPMERKING: Figuur 1C vertegenwoordigt het typische PI-EdU bivariate FACS-resultaat voor EdU-negatieve cellen. Het maakt de discriminatie van de EdU-negatieve cellen van de EdU-positieve cellen mogelijk.
  2. Voor microscopie-analyse
    1. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    2. Resuspendeer de pellet in 200 μL PBS + 1% BSA. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    3. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    4. Bereid verse Azide Dye buffer door de reagentia te mengen in de volgende volgorde (hoeveelheid voor één buis): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530 azide, 2 μL 1 M ascorbinezuur.
      OPMERKING: Een hoofdmix van de Azide Dye-buffer kan vers worden bereid door de reagentia in de bovengenoemde volgorde te mengen.
    5. Resuspendeer de pellet met 40 μL vers gemaakte Azide Dye buffer. Incubeer bij RT in het donker gedurende 60 min.
    6. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    7. Was de cellen 2x met 300 μL 10% ethanol in PBS.
      OPMERKING: De wasbeurten zijn cruciaal om alle oplosbare Dy-530 azide te elimineren.
    8. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    9. Resuspensie van de cellen in 100 μL van 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in PBS. Laat 30 minuten in het donker op kamertemperatuur.
    10. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    11. Wassen met 300 μL PBS om overtollige DAPI te verwijderen.
    12. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    13. Resuspendeer de pellet met 10-50 μL PBS, afhankelijk van de celconcentratie.
    14. Soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
      OPMERKING: De cellen kunnen in dit stadium enkele dagen bij 4 °C worden gehouden.
    15. Pipetteer 1,7 μL van de cellen op een glazen microscoopglaasje en dek af met een schone coverslip.
    16. Onmiddellijk waarnemen onder een fluorescentiemicroscoop met DAPI- en TexasRed- of Cy3-filters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de S-faseduur en, meer in het algemeen, de duur van G1 en G2 + M (protocol stap 1.1) te bepalen, werden S. cerevisiae W303 wild-type cellen (WT, tabel 1) asynchroon gekweekt in SC-medium gedurende 7 uur. Elk uur werd de celconcentratie gemonitord om de verdubbelingstijd te bepalen (figuur 2B). In deze groeiomstandigheden was de berekende verdubbelingstijd 120 min ± 13 min bij 25 °C (tabel 2). Toen de cellen zich in de exponentiële fase bevonden (2 × 106-5 × 106 cellen / ml), werd een aliquot cellen gedurende 5 minuten gepulseerd met EdU (10 μM) om de cellen in de S-fase te selecteren en het percentage cellen te bepalen dat zich in de fasen G1, S en G2 + M bevond. Drie populaties van cellen werden waargenomen in een bivariate EdU-PI cytometeranalyse (figuur 1B). De discriminatie tussen de EdU-negatieve en EdU-positieve populaties werd gemaakt met behulp van een controle-experiment waarbij de cellen niet werden gepulseerd met EdU, maar de Klikreactie werd uitgevoerd (Figuur 1C). De twee EdU-negatieve populaties in de gebieden linksonder en rechtsonder die verschilden in PI-intensiteit, kwamen tweevoudig overeen met respectievelijk G1 en G2 + M (figuur 1B, C). Daarom kwam de bovenste populatie (met een intensiteit >1× 104-2 × 104) overeen met de EdU-positieve cellen die zich op het moment van de puls in de S-fase bevonden (figuur 1B). Vandaar dat 27% ± 5% van de celpopulatie zich in de G1-fase bevond, 29% ± 3% in de S-fase en 44% ± 2% in G2 + M. Omdat de verdubbelingstijd in deze omstandigheden 120 min ± 13 min was, extrapoleerden we dat de G1-, S- en G2 + M-fasen respectievelijk 32 minuten ± 4 min, 35 min ± 6 min en 53 min ± 7 min duurden bij 25 °C (tabel 2 en tabel 3).

Vervolgens wilden we deze methode valideren en aantonen dat deze gevoelig genoeg is om mutanten met DNA-replicatiedefecten te identificeren die tot nu toe over het hoofd zijn gezien. We redeneerden dat instelbare functieverlies-allelen van de factoren die betrokken zijn bij DNA-replicatie ideale validatiecontroles zouden zijn. Daarom gebruikten we een giststam met een temperatuurgevoelige cdc6-1 mutant (tabel 1)11. Cdc6 is een essentiële licentiefactor die wordt uitgedrukt in late M en G1 om prereplicatiecomplexen (preRC) op ORC-gebonden chromosoomsites samen te stellen die later als replicatieoorsprong kunnen worden gebruikt. Daarom moet bij een permissieve temperatuur de S-faseduur hetzelfde zijn als die van de WT, terwijl bij een beperkende temperatuur geen DNA-replicatie mag plaatsvinden omdat er geen oorsprong is gelicentieerd12. Echter, bij een semi-permissieve temperatuur, waar minder oorsprongen zijn gelicentieerd, maar er zijn er genoeg om cel levensvatbaarheid te verlenen (onze ongepubliceerde gegevens; Barba Tena et al., in voorbereiding), verwachtten we verschillende duurtijden voor elke fase. Zoals verwacht groeiden de cdc6-1-cellen op basis van valtests hetzelfde als WT-cellen bij een permissieve temperatuur (d.w.z. 25 °C, figuur 2A), met dezelfde verdubbelingstijd (figuur 2B en tabel 2), maar waren dood bij of boven 34 °C (figuur 2A). Van belang was bij een semi-permissieve temperatuur (d.w.z. 28 °C) cdc6-1 levensvatbaar (28 °C, figuur 2A). De verdubbelingstijd was echter langer dan voor WT (figuur 2B en tabel 2) en de duur van elke fase was anders. Inderdaad, in cdc6-1 was G1 iets korter (12 min ± 1 min vs. 16 min ± 2 min), terwijl de S-fase iets langer was (34 min ± 4 min vs. 29 min ± 5 min), en de G2 + M-fase was significant langer (77 min ± 4 min vs. 45 min ± 3 min) in vergelijking met WT (Figuur 2C, D en tabel 3). De S-fase werd verrassend genoeg niet erg uitgebreid, maar de gemiddelde intensiteit van het EdU-signaal werd met 25% verminderd (figuur 2C, D), wat consistent is met een S-fase geïnitieerd vanuit minder oorsprong. Bovendien, terwijl de EdU-positieve WT-cellen homogeen verdeeld waren tussen de vroege (S1) en late S (S2) fasen (figuur 2C, aanvullende figuur S1A, vroege [S1] en late S [S2] fasen afgebakend met een verticale stippellijn in de bovenste poort), hoopte 65% van de EdU-positieve cdc6-1-cellen zich op in de late S-fase (figuur 2D, aanvullende figuur S1B). Er was zelfs geen duidelijk onderscheid tussen de S- en G2 + M-populaties (figuur 2D), wat suggereert dat de cellen moeite hadden om de S-fase te voltooien voordat ze de G2-fase binnengingen . Daarom is deze methode geschikt en gevoelig om mutanten te identificeren met defecten in de S-fase (duur en/of distributie) en in de celcyclusfaseduur.

Een complementaire methode werd bedacht om te bepalen wanneer cellen hun DNA-replicatie starten en beëindigen en de S-faseduur te schatten met behulp van gesynchroniseerde cellen (protocol stap 1.2). Hiertoe werden cellen met behulp van α-factor met gesynchroniseerde cellen in G1 vrijgegeven in SC-medium en elke 5 minuten verzameld. De duur van de S-fase kan ongeveer 25 minuten zijn op basis van het tijdstip waarop het DNA-gehalte veranderde van 1C naar 2C op het Sytox Green flowcytometerprofiel (figuur 3A). Deze schatting hangt echter af van wanneer een significante celfractie van de populatie voldoende Sytox Green heeft opgenomen om in het FACS-profiel te worden gezien. De vroege en late replicatiegebeurtenissen kunnen met deze methode niet worden gedetecteerd. Om nauwkeurig te definiëren wanneer de S-fase begint en eindigt en hoe lang deze duurt, werden S-fasecellen uit een aliquot van cellen geselecteerd bij pulslabeling met EdU (10 μM) gedurende 5 minuten elke 5 minuten na de G1-release. Zoals verwacht bevonden alle cellen zich binnen de eerste 10 minuten na de afgifte in het gebied linksonder (d.w.z. in G1, figuur 3B, aanvullende figuur S2). Vijftien minuten na de afgifte werd al een fractie van EdU-positieve cellen gedetecteerd (vergelijk de eerste twee rijen in supplementale figuur S2 en aanvullende figuur S3, respectievelijk EdU-behandelde en EdU-vrije cellen), wat aangeeft dat de S-fase was begonnen (figuur 3C). De progressie door de S-fase werd gezien door de celwolk die eerst naar boven en vervolgens naar rechts bewoog in de bivariate PI-EdU-grafiek (figuur 3D-F). Ten slotte, 35 minuten na de afgifte, was een fractie van de cellen EdU-negatief, maar met tweemaal de hoeveelheid DNA, wat aangeeft dat die cellen de S-fase hadden voltooid en zich in de G2 + M-fase bevonden (figuur 3G). De S-fase duurt dus 20 minuten in deze omstandigheden. Ondanks de hoge synchronie die werd waargenomen met de overlay van DNA-inhoud gedetecteerd met Sytox Green, wat suggereert dat de S-fase 40 minuten na de release in de hele populatie voorbij was, toonden de bivariate analyses aan dat sommige cellen de S-fase 60 minuten na de release voltooiden en dat de S-fase 65 minuten na de release voor de hele populatie was voltooid (figuur 3H, I en aanvullende figuur S2).

Bovendien kunnen de S-fase en DNA-synthese worden gevolgd door microscopie. Van elke geactiveerde replicatieoorsprong wordt DNA-synthese uitgevoerd door twee vastgebonden replisomen, die een nucleaire replicatiefocus vormen die kan worden gevolgd door microscopie door een gelabelde versie van een replicatiefactor en / of operators array en hun overeenkomstige repressor gefuseerd tot een fluorescerend eiwit 2,13. Als alternatief kan DNA-synthese worden gedetecteerd door microscopie met thymidine-analogen14,15. We gebruikten EdU om de subnucleaire DNA-regio's te monitoren die DNA-synthese ondergaan. Daartoe pulseerden we asynchrone WT- en cdc6-1-cellen met EdU (10 μM) gedurende 3 minuten bij 28 °C en brachten ze in beeld na de Click-reactie. We verwachtten variaties in de EdU-signaalintensiteiten te detecteren, afhankelijk van de DNA-synthesesnelheid en van de celprogressie in de celcyclus tijdens de 3 minuten EdU-puls (d.w.z. cellen die de hele 3 minuten in de S-fase doorbrengen, zullen een sterker signaal vertonen dan cellen die de S-fase tijdens de puls binnenkomen of verlaten). Dienovereenkomstig vertoonden WT S-fase cellen een EdU-signaal in hun kern dat varieerde in intensiteit (figuur 4A). De S-faseduur kan gemakkelijk worden geëxtrapoleerd uit deze analyse. Inderdaad, het werd bepaald uit twee biologische replicaties (ten minste 150 cellen werden geteld), dat 34% ± 3% en 38% ± 3% van de WT- en cdc6-1-cellen respectievelijk EdU-positief waren. Net als in deze groeiomstandigheden was de verdubbelingstijd respectievelijk 90 min en 123 min voor de WT- en cdc6-1-cellen (tabel 2), we extrapoleerden dat de S-fase respectievelijk 31 min en 47 min duurde. Het eerste resultaat is in lijn met dat van onze FACS-analyses (tabel 3), wat aangeeft dat de detectie van EdU-positieve cellen door microscopie de bepaling van de S-faseduur mogelijk maakt. Opmerkelijk is dat dit laatste hoger is dan de S-faseduur geëxtrapoleerd uit onze FACS-analyses omdat er geen duidelijk onderscheid was tussen de S- en G2 + M-populaties (figuur 2D). De EdU-foci werden gemakkelijk waargenomen in de WT-cellen (figuur 4B), maar waren zwakker en minder in de cdc6-1-cellen (figuur 4C). Om de mogelijkheid uit te sluiten dat het verschil in EdU-signaalintensiteit tussen de WT- en cdc6-1-cellen afhankelijk was van de stap van de S-fase, werd de intensiteit gekwantificeerd van gesynchroniseerde cellen. Zoals verwacht was de gemiddelde EdU-signaalintensiteit drievoudig lager in de cdc6-1-cellen (figuur 4D), consistent met DNA-replicatie geïnitieerd vanuit minder replicatieoorsprongen. Het EdU-signaal was beperkt tot de kern, colocaliserend met een sterk DAPI-signaal, en georganiseerd in bolvormige patronen, consistent met de organisatie van DNA-replicatie in nucleaire regio's of replicatiefabrieken. Belangrijk is dat EdU alleen werd gedetecteerd in cellen zonder tonde of kleine knoppen en nooit aanwezig was in cellen met grote knoppen, wat aangeeft dat de WT-gistcellen klaar waren met replicatie tegen de tijd dat ze mitose binnenkwamen. Deze methode is daarom gevoelig voor het visualiseren van DNA-replicatie met een hoge ruimtelijke resolutie, evenals voor het detecteren en kwantificeren van milde DNA-replicatiedefecten.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve FACS-analyses. (A) Representatieve Sytox Green FACS-analyses voor WT-cellen gekweekt bij 25 °C. (B,C) Representatieve EdU-PI bivariate FACS-analyses voor WT-cellen gekweekt bij 25 °C en gepulseerd gedurende 5 minuten met EdU (10 μM) of 1 μL DMSO. De polygonen waren in beide analyses hetzelfde. C werd gebruikt om de EdU-negatieve van de EdU-positieve cellen af te bakenen (over het algemeen is de limiet ingesteld op een intensiteit >1× 104-2 × 104). De bovenste polygoonpoort bakende de EdU-positieve cellen (S-fasefractie) af. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Fractie van cellen in de G1, S en G2 + M celcyclusfasen in asynchrone celpopulaties. (A) WT- en cdc6-1-stammen werden gespot bij seriële vijfvoudige verdunningen op rijk medium en gegroeid bij 25 °C, 28 °C of 34 °C. (B) Bevolkingsverdubbelingstijd. Asynchrone WT- en cdc6-1-cellen werden gekweekt bij 25 °C of 28 °C, en de celconcentratie werd elk uur gemeten gedurende 7 h. (C,D) EdU-PI bivariate FACS-analyse van WT- en cdc6-1-cellen gekweekt bij 28 °C en gedurende 5 minuten gepulseerd met EdU (10 μM). Het vermenigvuldigen van de populatieverdubbelingstijd met de S-fasefractie zorgt voor de S-faseduur. De gemiddelde intensiteiten van de EdU-positieve en EdU-negatieve cellen werden berekend als het gemiddelde van de intensiteit van elke waarde in de corresponderende veelhoek. De gemiddelde intensiteiten van de WT- en cdc6-1 EdU-negatieve cellen (respectievelijk 5.077 en 4.454) werden genormaliseerd tot 1. De gemiddelde intensiteiten van de WT- en cdc6-1 EdU-positieve cellen (respectievelijk 52.604 en 36.141) werden gedeeld door de normalisatiefactor die voor elke stam werd gebruikt. De verkregen waarden waren respectievelijk 10,4 en 8,1 (d.w.z. een daling van 25%, zoals vermeld in de tekst). Afkortingen: WT = wild-type; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; PI = propidiumjodide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Bepaling van de S-faseduur op gesynchroniseerde cellen. (A) Tijdsverloopanalyse van het DNA-gehalte van WT-cellen na α-factorafgifte bij 28 °C. De aangegeven tijd houdt rekening met de duur van de EdU-puls (5 min). (B-I) EdU-PI bivariate FACS-analyses voor gesynchroniseerde WT-cellen pulseren gedurende 5 minuten met EdU (10 μM) en verzameld op de aangegeven tijdstippen na de afgifte van G1-arrestatie. Afkortingen: WT = wild-type; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; PI = propidiumjodide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: EdU detectie en kwantificering door microscopie. Asynchrone WT- en cdc6-1-stammen werden gedurende 2 uur bij 28 °C gekweekt en vervolgens gedurende 3 minuten gepulseerd met EdU (10 μM) en in beeld gebracht door wide-field microscopie met behulp van adequate excitatie- / emissiefilters. (A) Representatieve beelden van wide-field microscopie voor WT en (B,C) individuele cellen voor WT en cdc6-1 gevisualiseerd door DIC en gekleurd met DAPI of voor EdU, zoals aangegeven. De schaalstaven in (A) en (B,C) zijn respectievelijk 10 μm en 2 μm. D) EdU-intensiteitsmetingen op synchrone WT- en cdc6-1-cellen die 30 minuten na de afgifte van G1-arrestatie bij 28 °C zijn gekweekt. De grafiek geeft de pooling van drie biologische replicaties weer (ten minste 50 cellen werden geteld in elke biologische replicaat). De gemiddelde ± SD worden weergegeven in de grafiek. Een ongepaarde tweestaartige t-test tussen WT- en cdc6-1-cellen wordt aangegeven met **** (p < 0,0001). Afkortingen: WT = wild-type; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; DIC = differentieel interferentiecontrast; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; A.U. = willekeurige eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam Genotype Figuren en tabellen
WT (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.1, Fig.2A,B,C, Fig3, Fig.4A,B,D, Supp Fig.1,2,3 Tabellen2,3
CDC6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.2A,B,D, Fig.4 C,D, Supp Fig.1, Tabellen2,3
TK + (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Supp Fig.4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Supp Fig.4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
W303-1A (E001): MATa, ade2-1, trp1-1, blik1-100, leu2-3.112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Supp Fig.4

Tabel 1: Lijst van de in dit onderzoek gebruikte stammen.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Verdubbelingstijd (min) 120 90 118 123
SD ± 13 min ± 3 min ± 10 min ± 6 min

Tabel 2: Gemiddelde verdubbelingstijden van WT - en cdc6-1-stammen gekweekt bij 25 °C en 28 °C. De verdubbelingstijden werden berekend op basis van drie biologische replicaten (vier technische replicaten voor elke biologische replicate) met behulp van de volgende formule: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), waarbij Cf en Ci overeenkomen met respectievelijk de uiteindelijke en initiële celconcentraties, en Δt overeenkomt met het verschil in minuten tussen tf en ti, wanneer Cf en Ci werden gemeten, respectievelijk.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Procent Duur
(min)		 Procent Duur
(min)		 Procent Duur
(min)		 Procent Duur
(min)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Tabel 3: Gemiddelde fracties van cellen en duur van de G1-, S- en G2 + M-fasen in WT- en cdc6-1-cellen gekweekt bij 25 °C en 28 °C. De fracties van cellen werden bepaald uit drie biologische replicaties (twee technische replicaties voor elke biologische replicaat). De verschillen in G1, S en G2 + M duur tussen de WT en cdc6-1 cellen gekweekt bij 28 °C waren statistisch significant (ongepaarde tweestaartige t-test, p < 0,1).

Aanvullende figuur S1: Fractie van cellen in de vroege en late S-fasen in WT- en cdc6-1-cellen gekweekt bij 28 °C. Twee identieke polygonen genaamd S1 en S2 voor respectievelijk de vroege en late S-fasen werden getekend in de fractie van EdU-positieve cellen om deze in twee helften te splitsen op de EdU-PI bivariate FACS-analyses voor (A) WT-cellen gekweekt bij 28 °C en (B) cdc6-1-cellen gekweekt bij 28 °C. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Celcyclusprogressie van EdU-pulsgelabelde cellen na afgifte van G1-arrestatie gevisualiseerd door EdU-PI bivariate FACS. Een aliquot van cellen werd gedurende 5 minuten gepulseerd met 10 μM EdU elke 5 minuten na afgifte van α-factorstilstand bij 28 °C en tot 80 minuten, zoals aangegeven. Afkortingen: EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; PI = propidiumjodide. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Celcyclusprogressie van met DMSO behandelde cellen na afgifte van G1-arrestatie gevisualiseerd door EdU-PI bivariate FACS. Dit is hetzelfde als supplementale figuur 2, maar de cellen werden gedurende 5 minuten geïncubeerd met 1 μL DMSO (dimethylsulfoxide). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: BrdU- en EdU-toxiciteit in TK hENT1-gistcellen. Cellen van het aangegeven genotype werden gespot in vijfvoudige seriële verdunningen op YPD-platen met toenemende concentraties BrdU of EdU en gedurende 40 uur bij 30 °C gekweekt. Afkortingen: DMSO = dimethylsulfoxide; BrdU = bromodeoxyuridine; Edu = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; TK = thymidinekinase; hENT1 = human equilibratieve nucleoside transporter. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gist is een belangrijk modelorganisme voor celcyclusstudies, maar de karakterisering van de S-fase wordt al lang belemmerd door het onvermogen om exogene nucleosiden op te nemen, zoals BrdU, die worden gebruikt als tracers van DNA-replicatie. Het uitrusten van gist met een hoge expressie van herpes simplex thymidinekinase (TK) en de toevoeging van een humane nucleoside transporter (hENT) heeft dit probleem grotendeels opgelost15,16. EdU is veelzijdiger dan BrdU omdat de detectie met kleine fluorescerende azide en Click-chemie vatbaar is voor permeabiliseerde gistcellen en FACS-analyse, in tegenstelling tot anti-BrdU-antilichamen17. Hier hebben we de omstandigheden van EdU-etikettering en -detectie in deze TK-hENT1-stam geoptimaliseerd en aangetoond dat eerder onopgemerkte replicatiedefecten met behulp van dit protocol kunnen worden gekwantificeerd door FACS of microscopie.

Het bestuderen van een biologisch mechanisme met behulp van hulpmiddelen die hetzelfde mechanisme kunnen verstoren, is een veel voorkomend probleem in de biologie. Omdat EdU een bekend cytotoxisch effect heeft, zochten we naar EdU-concentraties die niet toxisch zijn bij chronische blootstelling aan de gemanipuleerde TK-hENT1-stam en vonden we 10 μM een geschikte dosis. TK-hENT1-cellen kunnen zich niet vermenigvuldigen bij 25 μM EdU, terwijl TK-alone of hENT1-alone cellen gemakkelijk bestand zijn tegen 100 μM EdU (supplementale figuur S4). Hoewel gistcellen aanzienlijk gevoeliger zijn voor EdU dan BrdU, ontdekten we dat proliferatie pas na de tweede celcyclus na blootstelling aan EdU afnam, wat suggereert dat het op beide strengen moet worden opgenomen om celproliferatie te beïnvloeden (gegevens niet getoond). Om aan de veilige kant te blijven, gebruikten we 10 μM EdU in dit protocol, met alleen korte pulsen (3 min voor microscopie; 5 min voor FACS), en ontdekten dat dit geschikt was voor goede detectie met behulp van dit geoptimaliseerde protocol.

Subtiele defecten in DNA-replicatie kunnen een sterke invloed hebben op chromosoomherschikkingen4. Daarom is de ontwikkeling van technieken en protocollen die in staat zijn om deze subtiele defecten te detecteren de sleutel tot het blootleggen van de etiologie van chromosomale aberraties. Hier laten we zien dat dit geoptimaliseerde protocol van EdU-opname en -detectie kan meten tot een drievoudige vermindering van de signaalintensiteit (figuur 2 en figuur 4), wat aangeeft dat de snelheid van DNA-synthese wordt verminderd in temperatuurgevoelige cdc6-1-cellen gekweekt bij 28 ° C, die tot nu toe geen defecten vertonen op de levensvatbaarheidstests van de plaat (figuur 2A ). Dit protocol van EdU-opname en kwantificering kan dus worden gebruikt om andere mutanten te screenen waarvoor replicatiedefecten in eerste instantie niet worden vermoed. Bovendien kan het nuttig zijn om mitotische DNA-synthese (MiDAS), meiotische recombinatie-afhankelijke DNA-synthese of andere dna-synthese met lange tractus te detecteren.

Een nadeel is dat EdU-detectie alleen op vaste cellen kan worden uitgevoerd, waardoor live analyse wordt uitgesloten zoals bij PCNA-GFP of andere fluorescerende uitlezingen van DNA-replicatie, die zelf lijden onder de hoge fototoxiciteit van de laserstralen die worden gebruikt voor beeldvorming. Het kweken van cellen in een synthetisch medium is cruciaal voor de beste detectie, omdat YPD-restanten de Klik-reactie aanzienlijk lijken te doven. Interessant is dat het uitkiezen van de S-fasecellen met behulp van bivariate EdU-PI FACS-analyse op gesynchroniseerde populaties de schatting mogelijk maakt van de duur van de S-fase tot 20 minuten in afzonderlijke cellen (figuur 3, aanvullende figuur S2 en aanvullende figuur S3). Maar zelfs wanneer synchronisatie na α-factor release zo bijna perfect lijkt als in de klassieke Sytox Green FACS-analyse (figuur 3A), wordt uit bivariate EdU-PI FACS-analyse duidelijk dat cellen relatief asynchroon de S-fase ingaan (figuur 3B-I).

Hier beschrijven we drie methoden om de duur van de S-fase te bepalen met behulp van flowcytometrie en microscopie op synchrone en asynchrone cellen op zowel het niveau van één cel als op populatieniveau. De gemiddelde S-faseduur bepaald in asynchrone WT-cellen op populatieniveau is vergelijkbaar met behulp van flowcytometrie en microscopie, respectievelijk 29 minuten en 31 minuten, terwijl onze gesynchroniseerde eencellige benadering laat zien dat de duur zo kort kan zijn als 20 minuten (figuur 2, figuur 3, figuur 4 en tabel 3 ). De discrepantie tussen deze waarden is verrassend, maar kan gemakkelijk worden verklaard. Inderdaad, met onze op één cel gebaseerde benadering werd de duur van de S-fase bepaald op basis van de vroegste gebeurtenissen (d.w.z. de eerste cellen die de S-fase binnenkomen en verlaten, figuur 3C, G), maar dit impliceert niet dat de S-fase 20 minuten duurt in elke cel binnen een populatie. Deze gegevens zouden het onverwachte idee ondersteunen dat er een bepaald niveau van heterogeniteit is in S-faseduur tussen cellen.

Verbeterde protocollen of nieuwe technieken kunnen oude dogma's of nieuwe ideeën omverwerpen. Er zijn er drie die deze data uitdagen. Ten eerste wordt aangenomen dat DNA-synthese gepaard gaat met het ontstaan van knoppen in S. cerevisiae. Figuur 4A-C laat zien dat EdU-kleuring het sterkst is in cellen zonder toppen en cellen met kleine knoppen, ondanks de labelingvertraging van 3 minuten, wat aangeeft dat de S-fase duidelijk begint voordat deze ontluikt, zoals eerder getoond16. Ten tweede wordt gemeld dat gistcellen geen G2-fase hebben, waarbij mitotische spindels zich tegelijkertijd met DNA-synthese vormen. De zeer korte pulsen in combinatie met gevoelige EdU-detectie door FACS (figuur 3, aanvullende figuur S2 en aanvullende figuur S3) of microscopie (figuur 4) maakt het mogelijk om precies te bepalen wanneer de S-fase begint en eindigt in afzonderlijke cellen. Door dit te doen, ontdekten we dat bulk-DNA-synthese 40 minuten na α-factorafgifte eindigt (figuur 3, aanvullende figuur S2 en aanvullende figuur S3), terwijl korte mitotische spindels slechts 20 minuten latervormen 16 (gegevens niet weergegeven). We concluderen dat gistcellen een G2-fase hebben. Ten derde werd onlangs voorgesteld dat tot 30% van de gistcellen de DNA-synthese in anafase-telophase18 voltooit. Met behulp van dit geoptimaliseerde protocol hebben we geen EdU-opname gedetecteerd in cellen met een anafase / telophase-spindel (gegevens niet getoond), maar we kunnen niet uitsluiten dat deze tweede golf van DNA-synthese onder de gebruikte detectiedrempel ligt. Gezien de sterke signaal/ruisverhouding achten wij de laatste optie onwaarschijnlijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen Agence Nationale de la Recherche (ANR) en Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) erkennen voor de doctoraatsbeurzen aan J.d.D.B.T. en het Agence Nationale pour la Recherche (ANR) voor financiële steun (subsidie ANR-18-CE12-0018-01). Cytometrie en microscopie werden uitgevoerd in de Montpellier MRI BioCampus beeldvormingsfaciliteit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

Tags

Biologie Nummer 188
Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter